綿羊VEGF-B 基因可變剪切體克隆與鑒定

張立春 ，李夢姝，，張珈溯，云巾宴，柳儉強(qiáng)，曹 陽，金海國，夏廣軍*

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院，吉林公主嶺 136100；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 130021；3.長春金賽藥業(yè)股份有限公司，吉林長春 130012)

血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）屬I 型分泌性糖蛋白，分子量在34～45 KD 之間，其主要生理功能包括促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增強(qiáng)血管通透性、改變細(xì)胞外基質(zhì)及誘導(dǎo)血管生成等[1]。目前發(fā)現(xiàn)的人VEGF 家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 和胎盤生長因子（Placenta growth factor，PGF）[2]。VEGF-B 氨基酸組成及空間結(jié)構(gòu)與VEGF-A 相似，又被稱為VEGF 相關(guān)因子[3]。人VEGF-B基因含有6 個(gè)外顯子，其中外顯子6 可發(fā)生可變剪切生成2 種變異體VEGF-B167 和186[3]。人和小鼠VEGF-B基因具有廣譜的組織分布特性[4-5]，但在小鼠心臟、骨骼肌中高表達(dá)[4]，人中除心臟和骨骼肌外，還在脂肪組織及血管中高表達(dá)[5]，提示物種間VEGF-B 的差異性。由此推測VEGF-B基因在心臟血管發(fā)育及誘導(dǎo)心肌肥大等方面發(fā)揮作用[6]。另外與VEGF 家族其他成員所不同的是VEGF-B 并不表現(xiàn)出明顯的腫瘤促進(jìn)功能，而表現(xiàn)在能量代謝、神經(jīng)保護(hù)方面，進(jìn)一步提示VEGF 家族成員功能的差異性[7]。

VEGF-B基因可在皮膚組織中表達(dá)，但在EGF 和TGF-β1 刺激情況下，皮膚成纖維細(xì)胞中VEGF-B 敏感性要高于膠質(zhì)細(xì)胞[8]。皮膚成纖維細(xì)胞中盡管VEGF-B缺失并不影響受損皮膚組織血管修復(fù)[9]，但通過轉(zhuǎn)基因方法表達(dá)VEGF-B 卻可加快皮膚組織血管恢復(fù)[10]。目前除VEGF-A 外，其他VEGF 家族成員并未有直接證據(jù)證明參與毛囊毛發(fā)發(fā)育[11]。課題組前期研究證明新吉細(xì)毛羊在毛用性狀相關(guān)指標(biāo)上顯著優(yōu)于小尾寒羊，其潛在影響因素在于皮膚毛囊組織功能差異[12]。進(jìn)一步在綿羊皮膚組織中相繼克隆出VEGF 家族A、C、D和PGF基因[13-16]，并揭示不同家族成員在皮膚組織中通過可變剪切（Alternative Splicing,AS）產(chǎn)生多種類型轉(zhuǎn)錄本[13-15]。本文進(jìn)一步以小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊?yàn)檠芯繉ο?，克隆綿羊VEGF-B基因并進(jìn)行系統(tǒng)分析，為系統(tǒng)了解綿羊VEGF 基因家族在皮膚組織中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RNAlater 購置于QIAGEN 公司、Trizol購自于Invitrogen 公司；pMD18-T 載體、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit 和Ex Taq 酶均購自大連Ta KaRa 公司；大腸桿菌工程菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品采集 本實(shí)驗(yàn)動物為前期研究相同實(shí)驗(yàn)群體與實(shí)驗(yàn)樣品[11]。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 由于目前GenBank 數(shù)據(jù)庫中尚未有綿羊VEGF-B基因mRNA 數(shù)據(jù)信息，僅有預(yù)測的cDNA 序列，本實(shí)驗(yàn)以預(yù)測序列為模板，設(shè)計(jì)引物，引物序列參見表1。引物合成委托北京華大基因生物公司完成。

表1 引物序列及擴(kuò)增條件

1.4 皮膚總RNA 提取與cDNA 一鏈合成 皮膚總RNA提取采用液氮研磨，Trizol 法提取。瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測后-80℃保存?zhèn)溆谩DNA 第一鏈合成反應(yīng)參照PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，具體步驟按說明書進(jìn)行。

1.5 RT-PCR 與基因克隆 RT-PCR 擴(kuò)增體系為25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.5μL，sVEGF-B_C 上 下 游 引 物（10 μmol/L）各0.5 μL，0.5 U/μL Taq 酶0.2 μL，cDNA 模 板1 μL，ddH2O 17.8μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共35 個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5 min 延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、膠回收和T 載體連接等后續(xù)實(shí)驗(yàn)，陽性菌落送生物公司完成測序反應(yīng)，測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.6 生物信息學(xué)分析 測序結(jié)果首先用DNASTAR7.0軟件包Seqmen 進(jìn)行序列拼接，拼接序列利用Blast N在GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對。核酸及氨基酸多序列比對采用DNAman 9.0 軟件進(jìn)行?？勺兗羟蟹治鲋饕獙⑺@得的序列與綿羊基因組數(shù)據(jù)比對，并參照比對結(jié)果繪制可變剪切模式圖。蛋白序列功能結(jié)構(gòu)域分析采用SMART 在線數(shù)據(jù)庫分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）。蛋白氨基酸序列酶切位點(diǎn)分析采用PeptideCutter進(jìn)行（https://web.expasy.org/peptide_cutter/）。

1.7 不同組織器官VEGF-B 可變剪切體分布與表達(dá)分析 不同組織器官VEGF-B 可變剪切體分布檢驗(yàn)通過設(shè)計(jì)不同可變剪切體檢測引物（表1），以不同綿羊組織器官cDNA 為模板，采用RT-PCR 方法檢驗(yàn)不同組織器官中可變剪切體是否存在特異性分布情況。不同組織器官表達(dá)譜分析則在保守區(qū)設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物（表1），采用羅氏light cycle 480 II 機(jī)器進(jìn)行。反應(yīng)體系（20 μL）：ddH2O 8.6 μL，cDNA 模 板1μL，Light cycler 480 SYBR Green I master 10 μL，正、反向引物各0.2 μL。PCR 反應(yīng) 條 件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。每個(gè)品種檢測2 個(gè)個(gè)體，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)行3 次。以GAPDH 引物為內(nèi)參，檢測結(jié)果利用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪制柱形圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 綿羊VEGF-B基因克隆與序列分析 以小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊皮膚組織cDNA 為模板，經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增，電泳檢測顯示成功擴(kuò)增出目的條帶，但不同個(gè)體間存在大小差異（圖1）?？紤]到VEGF-B基因可能存在可變剪切，將擴(kuò)增電泳條帶全部回收、克隆測序分析，Blast N 比對結(jié)果顯示所回收的擴(kuò)增片段均為VEGF-B基因，與參考序列同源性均在98% 以上。所獲得的擴(kuò)增片段大小依次為978 bp 和877 bp，分別命名為X-B4、X-B7 和S-C1。其中X-B4 與參考序列（序列號：XM_012117071.2）相同，為VEGF-B基因預(yù)測突變體X2。X-B7 和S-C1 片段中間區(qū)出現(xiàn)101 bp 的片段缺失（圖2），與VEGF-B基因預(yù)測突變體X3 序列相同（序列號：XM_012117072.2）。

進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)所克隆到的VEGF-B基因并不包含完整的ORF 框，氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)所獲得的2 種類型VEGF-B基因編碼蛋白C 端氨基酸序列差異較大，從本質(zhì)上說已完全不屬于同一蛋白（圖3），但Blast P 結(jié)果發(fā)現(xiàn)X-B4 編碼氨基酸序列除與突變體X2 相同外，還與牛VEGF-B186 高度同源。X-B7 和S-C1 所編碼氨基酸序列除與突變體X3 相同外，也與牛VEGF-B基因氨基酸序列高度同源，一方面說明牛羊之間VEGF-B基因親緣關(guān)系較近，另一方面也說明本實(shí)驗(yàn)所克隆到的VEGF-B基因2 種類型可變剪切模式具有物種間的普遍性[17]。SMART 分析結(jié)果顯示2 種類型氨基酸序列突變均未造成PDGF 功能結(jié)構(gòu)域的改變，影響的僅是蛋白C 末端長度及結(jié)構(gòu)性改變，推測可能并不能從根本上改變VEGF-B 功能，目前尚不清楚綿羊VEGF-B不同突變類型的功能及產(chǎn)生機(jī)制。

VEGF 家族蛋白成熟過程需要經(jīng)歷N 端及C 端前導(dǎo)肽的蛋白水解過程。本實(shí)驗(yàn)中所發(fā)現(xiàn)的2 種類型VEGF-B 蛋白C 末端氨基酸差異性是否影響蛋白水解，利用PeptideCutter 在線分析程序?qū)-B4 和X-B7部分氨基酸序列進(jìn)行蛋白酶位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，2 種類型VEGF-B 氨基酸序列蛋白酶預(yù)測位點(diǎn)存在明顯變化（圖4、表2），其中X-B4 氨基酸序列中Proteinase K和Thermolysin 酶切位點(diǎn)數(shù)量明顯增加，X-B7 氨基酸序列中Arg-C proteinase、Clostripain、NTCB（2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid）和Trypsin 酶切位點(diǎn)數(shù)量明顯增加，提示2 種類型VEGF-B 蛋白在水解加工過程中可能存在差異。

表2 X-B4 與X-B7 氨基酸C 末端段蛋白酶切位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

2.2 不同組織器官VEGF-B基因可變剪接體突變體表達(dá)模式分析 鑒于在綿羊皮膚組織中所克隆到的VEGF-B基因存在2 種類型的可變剪切突變體，為探討該突變體是否具有組織特異性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可變剪切體檢測引物，以小尾寒羊心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、腸道、肌肉、卵巢和腦組織cDNA 為模板，通過RT-PCR 法檢測不同器官的VEGF-B基因的可變剪切類型（圖5）。結(jié)果顯示在小尾寒羊個(gè)體各個(gè)組織中均有表達(dá)，片段大小與預(yù)測相同，但在腸道組織、卵巢及皮膚組織中還擴(kuò)增出一條150 bp 左右的特異性條帶，目前尚不清楚該條帶是非特異性擴(kuò)增還是該組織中存在其他不同類型的突變體mRNA（圖5）。同時(shí)值得注意的是在心臟組織中出現(xiàn)一條較為特異的擴(kuò)增條帶，較877 bp 檢測片段稍小，考慮到PCR 擴(kuò)增反應(yīng)特異性較強(qiáng)，且其他組織中并未發(fā)現(xiàn)類似擴(kuò)增產(chǎn)物，推測腸道、卵巢和皮膚以及心臟組織VEGF-B基因可能存在組織特異性的可變剪切方式。

2.3 不同組織器官VEGF-B基因表達(dá)譜分析VEGF-B基因不同AS 類型在組織器官特異性檢測發(fā)現(xiàn)僅存在輕微差異，為進(jìn)一步檢驗(yàn)該基因在不同組織器官中的表達(dá)差異，本實(shí)驗(yàn)選取2 頭成年小尾寒羊個(gè)體，利用qRTPCR 法檢驗(yàn)心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腸、肌肉、卵巢和腦組織中的相對表達(dá)水平，并以心臟組織為參照，繪制VEGF-B基因在不同組織器官中的相對表達(dá)量柱形圖（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF-B在不同組織器官中的表達(dá)量變異較大，其中脾臟和腎臟相對心臟表達(dá)量略高，大約為心臟表達(dá)水平的1.5 倍。肺臟與卵巢組織中則明顯高于心臟組織，相對表達(dá)量依次為5.3 倍和2.3 倍。與上述組織相反，腸道、肝臟、肌肉和腦組織中VEGF-B基因表達(dá)量較心臟組織表達(dá)量下調(diào)，其中肝臟組織和腦組織相對表達(dá)量僅為心臟組織的20%左右，肌肉則更低，相對表達(dá)量僅為8%。腸道組織相對表達(dá)降低則不如上述器官明顯，約為心臟組織表達(dá)水平的60%。

3 討 論

小尾寒羊是我國特有的地方綿羊品種，具有高繁殖率、耐粗飼的優(yōu)良特性，但其產(chǎn)肉、產(chǎn)毛性能低下，毛多以粗毛和兩型毛為主，盡管經(jīng)過一定的選育提高，但仍主要用于毛氈、毛毯等生產(chǎn)為主，無法用于高檔毛紡面料[18]。新吉細(xì)毛羊是本世紀(jì)初我國新疆和吉林兩省育種學(xué)家以澳洲美利奴羊毛為父本，以地方細(xì)毛羊?yàn)槟副九嘤龅募?xì)毛羊品種，具有毛用性狀優(yōu)良、遺傳潛力大等突出優(yōu)點(diǎn)[19]。小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊同時(shí)可作為綿羊毛品質(zhì)遺傳機(jī)制研究的理想動物模型，用以挖掘影響毛用性狀的功能基因。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)小尾寒羊皮膚毛囊組織結(jié)構(gòu)存在顯著差異，差異之一為毛細(xì)血管密度差異，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)VEGF 家族基因在綿羊皮膚中均有表達(dá)，且存在類型多樣的可變剪切突變體。鑒于皮膚組織脈管結(jié)構(gòu)分布豐富，毛囊生長發(fā)育與周期過程中同樣伴隨著周圍毛細(xì)血管的新生與退化過程[20]，VEGF 可能作為重要的血管增殖調(diào)控因子直接參與毛囊周圍血管新生與退化，間接調(diào)控毛囊及毛發(fā)生長發(fā)育過程[21]。本文克隆出綿羊VEGF-B基因mRNA 并對其進(jìn)行了系統(tǒng)的生物學(xué)分析，為進(jìn)一步研究綿羊VEGF-B基因功能奠定基礎(chǔ)。

目前基因數(shù)據(jù)庫中尚未有綿羊VEGF-B基因mRNA序列信息的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)利用預(yù)測序列設(shè)計(jì)引物在小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊皮膚組織擴(kuò)增長短不同的2 條片段VEGF-B基因mRNA 序列，分別與預(yù)測序列XM_0121 17071.2 和XM_012117072.2 相同，但并未發(fā)現(xiàn)與另一種類型突變體所對應(yīng)的片段（序列：XM_012117073.2），提示VEGF-B基因在綿羊皮膚組織中表達(dá)具有自身特點(diǎn)。值得注意的是mRNA 中間部分缺失導(dǎo)致所編碼蛋白產(chǎn)生移碼突變，這種類似突變在不同物種間普遍存在[17]，其原因在于這種突變類型并未改變PDGF 功能結(jié)構(gòu)域，PDGF 功能結(jié)構(gòu)域是VEGF 家族的功能核心，其左右兩端序列會在蛋白加工成熟過程中由蛋白酶水解去除[22]。2 種類型VEGF-B 蛋白C 端蛋白酶切位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果證實(shí)存在蛋白酶類型及數(shù)量差異，進(jìn)而可能影響VEGF-B 的加工過程及功能活性。

為探尋VEGF-B不同類型可變剪切體組織器官的表達(dá)特性，對10 個(gè)組織器官檢測發(fā)現(xiàn)VEGF-B不同類型可變剪切體具有組成型表達(dá)的特性，但也可能存在組織器官間的細(xì)微差別，該基因與傳統(tǒng)可變剪切具有組織器官特異性的特點(diǎn)存在一定差異[23-24]，說明2 種類型可變剪切體具有普遍性，也提示氨基酸序列突變及潛在蛋白酶解加工過程同樣具有普遍意義。實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果表明，在皮膚組織中除VEGF-D基因不存在可變剪切突變體外，VEGF-C[25]、B、A[13]和PGF[15]均存在不同類型的可變剪切突變體，進(jìn)一步證明VEGF 基因的復(fù)雜性[26]。

對不同組織器官VEGF-BmRNA 表達(dá)檢測結(jié)果顯示，在肺臟和卵巢組織較心臟呈現(xiàn)高表達(dá)，脾臟和腎臟基本持平，肝臟、腸道、肌肉和腦組織較心臟下調(diào)表達(dá)，該結(jié)果與人VEGF-B表達(dá)模式部分相似[5,27]，似乎與組織器官血管密度不存在直接相關(guān)性。但考慮到VEGF-B功能主要參與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管通透性增強(qiáng)、細(xì)胞外基質(zhì)改變及誘導(dǎo)新生血管生成等，可能在成年綿羊個(gè)體中VEGF-B 主要功能是維持血管通透性，如肺臟組織，而在發(fā)育完全且血管不太可能增生的組織器官如肌肉、腦等，其表達(dá)量維持較低的水平。但由于未對特定可變剪切類型進(jìn)行進(jìn)一步表達(dá)分析，不同類型是否在特定組織器官表現(xiàn)累積特性尚不得而知，這也是下一步研究的重點(diǎn)。

皮膚組織結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜，既為機(jī)體與外界環(huán)境的第一道屏障，擔(dān)負(fù)機(jī)體免受外界物理、化學(xué)及生物損傷等重要功能，同時(shí)也是指甲、毛發(fā)等皮膚附屬物的發(fā)生組織。本實(shí)驗(yàn)室證實(shí)小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊在皮膚組織結(jié)構(gòu)及毛用性狀相關(guān)指標(biāo)存在顯著差異。人皮膚組織中同樣表達(dá)VEGF 家族基因，但在皮膚角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，對生長因子刺激，VEGF-B基因僅僅在皮膚成纖維細(xì)胞中呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)，提示VEGF 家族更多參與皮膚組織修復(fù)等生理病理過程[28]，該結(jié)果與上皮細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)VEGF-B基因小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[10]。有研究表明，生長期毛囊中VEGFmRNA 表達(dá)上調(diào)[11]，轉(zhuǎn)VEGF 基因亦能誘導(dǎo)毛囊周圍血管的形成[29]，VEGF 促毛囊生長作用多指VEGF-A[30]，目前尚無其他家族成員與毛囊生長發(fā)育的相關(guān)研究報(bào)道，VEGF-B在皮膚組織表達(dá)分布及具體生物學(xué)功能值得關(guān)注。

4 結(jié) 論

本研究通過RT-PCR 方法從不同品種綿羊皮膚組織中成功地克隆出VEGF-B基因片段，序列分析發(fā)現(xiàn)VEGF-B片段由不同可變剪切方式生成并導(dǎo)致RNA 所編碼蛋白序列移碼突變，所編碼的VEGF-B突變體具有物種間保守型。主要引起VEGF-B 突變體PDGF 結(jié)構(gòu)域C 端蛋白酶切位點(diǎn)的改變。表達(dá)分析顯示2 種類型VEGF-B突變體具有組成型表達(dá)特性，相對心臟組織、肺臟和卵巢組織呈現(xiàn)高表達(dá)，肝臟、腸道和腦組織中低表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為研究VEGF-B基因功能提供基礎(chǔ)。