MALDI-TOF-MS檢測(cè)哈維弧菌前處理?xiàng)l件的探索及聚類分析*

武 靜，陳英劍，李繼霞，胡成進(jìn)

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六○醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，山東濟(jì)南 250031)

哈維弧菌又稱哈氏弧菌，為革蘭陰性嗜鹽菌，是海水中重要的機(jī)會(huì)性致病菌，主要引起蝦及魚類和貝類的感染，引發(fā)死亡率較高的弧菌病[1-3]。據(jù)報(bào)道[4]，該菌可引起泰國(guó)、印度、澳大利亞、中國(guó)等地的斑節(jié)對(duì)蝦、墨吉明對(duì)蝦、長(zhǎng)毛明對(duì)蝦等不同種類對(duì)蝦和魚類、貝類大量死亡，嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展[5]。還可引起法國(guó)、日本、歐洲的鮑魚于2天內(nèi)發(fā)生大批量死亡，產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究顯示[6]，不同弧菌對(duì)不同抗菌藥的敏感性不同，對(duì)弧菌病的診斷鑒定到種十分必要。因此，為快速診斷并有效治療哈維弧菌感染，急需一種快速、有效的檢測(cè)手段。

目前，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中還沒(méi)有哈維弧菌的檢測(cè)方法。哈維弧菌的菌落無(wú)明顯特征，且鏡下形態(tài)與其他弧菌相似。VITEK-Compact是傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法中最常用的微生物鑒定儀器，而依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書，V2S 5.01細(xì)菌庫(kù)中GN卡僅能夠鑒定包括溶藻弧菌和副溶血性弧菌在內(nèi)的8 種弧菌，未包含哈維弧菌。文獻(xiàn)報(bào)道的哈維弧菌檢測(cè)多是基因測(cè)序方法[7-9]?；驕y(cè)序?qū)τ诠S弧菌的鑒定有明顯的優(yōu)勢(shì)，但操作繁瑣，對(duì)操作人員技術(shù)要求高，操作時(shí)間長(zhǎng)，不適宜常規(guī)開(kāi)展。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)是近年發(fā)展起來(lái)的一種全新的用于微生物快速鑒定的技術(shù)，具有快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)。本研究基于MALDI-TOF-MS檢測(cè)哈維弧菌，對(duì)其前處理?xiàng)l件及聚類分析進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、TCBS即硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基、2216E培養(yǎng)基；α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)基質(zhì)、50%乙腈、2.5%三氟乙酸。

1.1.2菌株來(lái)源 33株哈維弧菌，分布于中國(guó)黃渤海海域、美國(guó)及日本沿海區(qū)域，分離自患病的海洋動(dòng)物及海水中。

1.1.3主要儀器 MALDI-TOF-MS(型號(hào)：布魯克autoflex speed)；靶板MSP 96 target polished steel；數(shù)據(jù)采集軟件flexControl3.4；數(shù)據(jù)分析軟件flexAnalyses3.4；結(jié)果鑒定軟件Biotyper3.1，該軟件自帶Biotyper3.1數(shù)據(jù)庫(kù)。恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)SHEL-LAB公司)；Ⅱ級(jí)生物安全柜(新加坡ESCO公司)，購(gòu)自美國(guó)Baker公司。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取及rpoB測(cè)序 所有菌株接種在2216E培養(yǎng)基，28 ℃孵育箱恒溫培養(yǎng)24 h。無(wú)菌EP管中加入50 μL無(wú)菌水，挑取單個(gè)菌落，調(diào)制菌液至2濁度，震蕩混勻；置100 ℃沸水中煮沸10 min，冰上放置10 min；13 000 r/min離心5 min，上清液即為DNA提取液。取上述步驟提取的基因組DNA作為PCR反應(yīng)模板，進(jìn)行rpoB基因擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94 ℃ 8 min；循環(huán)94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s ，72 ℃ 1 min 30 s，30循環(huán)；72 ℃延伸8 min。反應(yīng)引物F:AGG CGT GTT CTT CGA CAG CGA TAA，R:TCG TCC ACT TCG CCT TTA CC。擴(kuò)增產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成測(cè)序，利用NCBI中Blast軟件進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2細(xì)菌質(zhì)譜鑒定 哈維弧菌接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、TCBS瓊脂培養(yǎng)基和2216E培養(yǎng)基，37 ℃分別培養(yǎng)16、24、48 h后，同時(shí)采用兩種方法進(jìn)行樣本前處理。直接涂抹法：在平板上挑取單個(gè)菌落均勻涂于靶板上，即刻在涂布的菌落上加入1 μL HCCA基質(zhì)液覆蓋，在室溫下自然干燥后進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)菌株重復(fù)檢測(cè)2次。甲酸提取法：在EP管中加入300 μL去離子水。取待測(cè)微生物樣本至離心管中。充分混勻。加入900 μL乙醇，13 000 r/min離心2 min，倒去上清。再次離心，使用移液槍完全去除殘余的上清，整個(gè)過(guò)程不應(yīng)觸碰沉淀液。室溫下干燥沉淀2～3 min。加入70%甲酸水溶液(1～80 μL，根據(jù)生物量調(diào)整)，渦旋振蕩。加入純乙腈(1～80 μL，與甲酸等體積)，充分混勻。13 000 r/min離心2 min。吸取1 μL上清，滴加到MALDI靶板上。半小時(shí)內(nèi)，用1 μL HCCA基質(zhì)溶液覆蓋上述樣品點(diǎn)。

用flexControl3.4軟件采集圖譜，并用flexAnalyses3.4軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析。根據(jù)所得圖譜與儀器數(shù)據(jù)庫(kù)參考圖譜匹配程度，用BioTyper3.1軟件可得到0～100的分值(對(duì)數(shù)值為1～3)。儀器參數(shù)為：線性操作、正離子模式；檢測(cè)范圍：(2～20)×103；激光點(diǎn)擊數(shù)：每圖譜50 shots；激光頻率：30.0 Hz；離子源加速電壓：20 kV。

1.2.3質(zhì)譜聚類分析 利用Biotyper 3.1軟件的cluster analysis功能對(duì)33株菌進(jìn)行聚類分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析。不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)時(shí)間以及不同處理方法下“屬”“種”水平鑒定結(jié)果比較用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)譜圖及蛋白峰差異 將每株菌產(chǎn)生的所有峰經(jīng)過(guò)歸一化處理、閾值設(shè)定、排除異常峰，挑選出60個(gè)峰進(jìn)行分析。所有的實(shí)驗(yàn)菌株在m/z為4 278、5 183、6 129、6 410、7 210附近均出現(xiàn)高強(qiáng)度蛋白峰。研究顯示[10-11]，質(zhì)譜獨(dú)特蛋白峰型的存在可能是特異性蛋白或毒力性的標(biāo)志，可能預(yù)測(cè)耐藥情況。這些種特異性蛋白峰，有可能成為哈維弧菌的分子標(biāo)志物，尚需要進(jìn)一步的研究去證實(shí)。

2.2不同培養(yǎng)基對(duì)哈維弧菌鑒定的影響 假設(shè)不同培養(yǎng)時(shí)間及不同前處理方法對(duì)不同培養(yǎng)基的鑒定結(jié)果無(wú)影響。本文僅列出了培養(yǎng)18 h甲酸提取法條件下的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。哈維弧菌在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、TCBS瓊脂培養(yǎng)基和2216E培養(yǎng)基中的培養(yǎng)鑒定結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同培養(yǎng)基鑒定結(jié)果比較[n(%)]

2.3不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)哈維弧菌鑒定的影響 不同培養(yǎng)基的選擇對(duì)鑒定結(jié)果無(wú)明顯影響，假設(shè)前處理方法的選擇對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的鑒定結(jié)果無(wú)影響，本文僅對(duì)血平板甲酸提取法條件培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鑒定結(jié)果的影響進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示，培養(yǎng)18、24 h的鑒定準(zhǔn)確率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但培養(yǎng)48 h鑒定準(zhǔn)確率明顯低于培養(yǎng)18、24 h的鑒定準(zhǔn)確率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間鑒定結(jié)果比較[n(%)]

2.4不同前處理方法對(duì)哈維弧菌鑒定的影響 選擇血平板、培養(yǎng)18 h條件下探討前處理方法的影響。甲酸提取法鑒定準(zhǔn)確率明顯高于直接轉(zhuǎn)移法的鑒定準(zhǔn)確率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同前處理方法鑒定結(jié)果比較[n(%)]

2.5質(zhì)譜聚類分析 見(jiàn)圖1。在距離水平為900的時(shí)候被分成了2支，其中一支用B表示，主要包括哈維弧菌20、21、22、25、26、27、29、30、31、32，該10株菌均分離自中國(guó)。其余歸為一支，用A表示。在距離水平為700左右時(shí)又被分為兩個(gè)分支，其中一支包括1、2、3、4、5、6、14、19、23、24、33共11株菌，該11株菌除3、19、24、33外其余均分離自美國(guó)。另一支包括7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、28，分離自西班牙、突尼西亞、厄瓜多爾、丹麥等多為歐洲地區(qū)?？梢?jiàn)地理位置較近的菌株被歸為相同分支。

圖1 33株哈維弧菌MALDI-TOF-MS指紋圖譜聚類分析

3 討 論

16S rRNA序列分析為公認(rèn)的細(xì)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。然而由于海洋細(xì)菌基因序列高保守性和高同源性的特點(diǎn)，16S rRNA測(cè)序并不能對(duì)海洋弧菌進(jìn)行可靠鑒定。編碼RNA聚合酶β亞基的基因rpoB，為序列較長(zhǎng)的單拷貝基因，可以克服16S rRNA的高度保守性[12]。而且有研究已經(jīng)證明rpoB基因，可用于弧菌的分類[13-14]。因此，本研究采用rpoB基因測(cè)序作為哈維弧菌鑒定的參考方法。

質(zhì)譜鑒定是將細(xì)菌直接點(diǎn)在靶板上，通過(guò)激光照射使細(xì)菌電離，收集所產(chǎn)生離子的m/z及強(qiáng)度，與庫(kù)中已知菌株的蛋白指紋圖譜進(jìn)行比較，得出鑒定結(jié)果。從涂菌到取得結(jié)果只需幾分鐘，具有快速、準(zhǔn)確、高通量等明顯優(yōu)勢(shì)。

不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間及前處理方法對(duì)細(xì)菌蛋白表達(dá)有一定影響，會(huì)造成質(zhì)譜圖中峰點(diǎn)、峰信號(hào)強(qiáng)度、信噪比等的差異，得到不可靠的鑒定結(jié)果。因此，本研究針對(duì)哈維弧菌進(jìn)行了質(zhì)譜檢測(cè)前條件的摸索。不同菌種對(duì)培養(yǎng)基的適宜生長(zhǎng)程度不同。有研究利用不同培養(yǎng)基分離純化食品中可疑沙門菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)出的沙門菌用MALDI-TOF-MS鑒定出的菌種不同[15]。本研究中3種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定分值沒(méi)有明顯差異，可能3種培養(yǎng)基均能滿足哈維弧菌的生長(zhǎng)要求。但若菌落比較小難以挑取或取到培養(yǎng)基會(huì)顯著影響鑒定可信度。短時(shí)間培養(yǎng)的選擇(18、24 h)對(duì)鑒定結(jié)果的影響不明顯，可能因?yàn)閷?duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期核糖體蛋白比較穩(wěn)定。長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，蛋白表達(dá)受到抑制。同時(shí)考慮到對(duì)細(xì)菌鑒定快速性的要求，推薦使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌落進(jìn)行鑒定。直接轉(zhuǎn)移法為將細(xì)菌直接涂到靶板上后再點(diǎn)加基質(zhì)進(jìn)行分析，簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，但結(jié)晶的均勻性較差。而甲酸提取法有細(xì)菌滅活和蛋白溶出的步驟，可改善結(jié)晶的均勻性。甲酸提取法中水和乙醇能洗掉培養(yǎng)基內(nèi)的雜質(zhì)，而甲酸能保護(hù)分析物質(zhì)，避免分解。通過(guò)甲酸提取法前處理的細(xì)菌得到的質(zhì)譜圖離子峰較多，信噪比更高。

有研究顯示[16-17]，不同海洋環(huán)境和地理位置會(huì)影響不同弧菌種和亞種的分布，同一菌的毒力和致病性也會(huì)隨著地理位置的不同而改變。本研究對(duì)不同時(shí)間不同地點(diǎn)分離的33株哈維弧菌菌株的聚類分析也證實(shí)MALDI-TOF-MS不僅可以分類細(xì)菌而且對(duì)于一些致病菌的溯源分析具有重要價(jià)值，符合病原菌流行病學(xué)分析快速、有效的要求。因此，對(duì)海洋弧菌病爆發(fā)流行時(shí)感染性病原體的溯源，質(zhì)譜檢測(cè)將會(huì)發(fā)揮重要作用。

MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)中必須含有足夠多的已知菌株，才可實(shí)現(xiàn)匹配度最高的鑒定。利用本研究中的前處理?xiàng)l件，33株哈維弧菌已入庫(kù)。相信隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷補(bǔ)充,MALDI-TOF-MS在海洋漁業(yè)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛。而且隨著儀器趨向體積小和成本低方向的發(fā)展，質(zhì)譜儀將會(huì)更加適合推廣應(yīng)用。

4 結(jié) 論

本研究提出了一種基于MALDI-TOF-MS快速檢測(cè)哈維弧菌的新技術(shù)，首次探討了前處理的適宜條件并對(duì)33株哈維弧菌進(jìn)行了聚類分析，為海洋漁業(yè)哈維弧菌病的快速診斷及流行病學(xué)分析提供了理論依據(jù)。