紅豆皮多酚提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性分析

謝佳函 劉回民 劉美宏 鄭明珠 徐 倩 劉景圣 *

（1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長春 130118

2 小麥和玉米深加工國家工程試驗(yàn)室 長春 130118

3 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 長春 130118）

現(xiàn)代都市人群因其生活節(jié)奏快，工作壓力大，飲食不合理，作息不規(guī)律，缺乏運(yùn)動(dòng)等諸多因素，導(dǎo)致長期情緒不良，機(jī)體代謝紊亂，亞健康狀態(tài)頻發(fā)。亞健康狀態(tài)使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量過剩的活性氧自由基，造成組織細(xì)胞中的脂質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)、DNA和RNA等生物大分子發(fā)生變形、交聯(lián)、斷裂等現(xiàn)象，從而造成氧化損傷，引發(fā)各種疾病[1]。開發(fā)天然高效的抗氧化劑不僅對(duì)預(yù)防和治療各種自由基引起的疾病具有深遠(yuǎn)的意義，還能夠避免人工合成抗氧化劑產(chǎn)生的毒副作用。

紅豆（Vigna angularis）又名赤豆、赤小豆、小豆、紅小豆、飯豆等[2]，是中國、日本、韓國等亞洲國家最常食用的的雜糧作物之一，常用來做粥、湯以及甜點(diǎn)等。中醫(yī)認(rèn)為，紅豆的藥用價(jià)值很高，具有補(bǔ)血補(bǔ)脾、健胃生津、祛濕益氣、排膿解毒等多種功效，被李時(shí)珍形象地稱為“心之谷”[3]。紅豆皮是紅豆沙加工的副產(chǎn)物，其中含有豐富的多酚類物質(zhì)[4-5]，例如原花青素、蘆丁、兒茶素、槲皮素、金絲桃苷等[6]。多酚化合物具有清除機(jī)體內(nèi)自由基，緩解氧化損傷，預(yù)防和治療許多氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的功效，例如：阿爾茨海默氏癥、慢性疲勞綜合癥、心臟病、糖尿病、帕金森等[7-10]。以膳食多酚作為原料開發(fā)食品和藥品，具有來源廣泛，安全可靠，功效顯著等優(yōu)勢(shì)[11]。本研究從紅豆皮中提取多酚類物質(zhì)，不僅能夠變廢為寶，還能夠增加紅豆的經(jīng)濟(jì)效益，開發(fā)利用前景極為廣闊。

目前，提取多酚的方法有很多，例如：溶劑浸提法、超聲輔助提取、酶解提取法、微波輔助提取、超臨界CO2萃取法等[12-14]。本試驗(yàn)采用超聲輔助乙醇提取法，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時(shí)間、料液比對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響，具有時(shí)間短，操作簡單，提取量高等優(yōu)點(diǎn)。通過響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，提取的多酚粗提物經(jīng)大孔樹脂純化后采用HPLC分析單體成分并進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)，旨在為開發(fā)安全、高效的紅豆皮多酚抗氧化劑在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅豆，小麥和玉米國家工程試驗(yàn)室提供；沒食子酸、蘆丁、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、阿魏酸、異牡荊素、牡荊素、異鼠李素、金絲桃苷、山奈酚、槲皮素、VC標(biāo)準(zhǔn)品，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu顯色劑，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；大孔樹脂，鄭州華溢科技新材料股份有限公司；DPPH、ABTS，美國Sigma公司；所用化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

JY 92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀（配備φ6變幅桿），寧波新芝生物科技股份有限公司；高速萬能粉碎機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，德國BMG公司；超純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司；101A-1ET電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海試驗(yàn)儀器廠有限公司；SHB-Ⅲ 循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；電子分析天平，Sartorious（北京）有限公司；Allegra X-30R高速離心機(jī)，美國Beckman公司；2-16 LSC冷凍干燥儀，美國Ghrist公司；1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅豆皮粉的制備 將紅豆用蒸餾水快速?zèng)_洗3次，在25℃條件下浸泡24 h，手工剝皮，將收集的紅豆皮在40℃條件下烘干10 h至質(zhì)量恒定，用粉碎機(jī)將干燥的紅豆皮粉碎，過80目篩，備用。

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取5 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于5mL雙蒸水中，定容至刻度線，配制成1mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，分別稀釋得到質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50，60 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，雙蒸水做空白對(duì)照。精確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各50μL，依次加入200μL雙蒸水和250μL福林酚工作液（1mL FC用8mL雙蒸水稀釋），室溫下避光靜置5min，再加入250μL 10%Na2CO3溶液，于30℃水浴鍋中避光反應(yīng)1 h，使用酶標(biāo)儀在765 nm波長處測(cè)定吸光度值。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=0.0032x+0.0015，R2=0.9993。

1.3.3 紅豆皮多酚含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取紅豆皮粉末2.000 g，置于200mL燒杯中，并按一定液料比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，搖勻。然后在室溫條件下，用一定功率的超聲波分別處理一定時(shí)間，取出后溶液立刻離心20min（4 000 r/min），取上清液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮樣品，蒸餾水定容至50mL。精確吸取已制備好的紅豆皮多酚溶液50 μL，測(cè)定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出溶液中多酚的質(zhì)量濃度（μg/mL），每組做3個(gè)平行樣。紅豆皮多酚提取量按式（1）計(jì)算：

式中，C——紅豆皮多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；V——提取液體積，mL；N——稀釋倍數(shù)；M——紅豆皮粉質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱取紅豆皮粉末2.000 g，按照料液比1∶50加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在超聲波功率350W條件下超聲20min測(cè)定紅豆皮多酚提取量。固定其它條件，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、提取時(shí)間、料液比對(duì)多酚提取量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時(shí)間、料液比4個(gè)因素，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法。

1.3.6 純化 將提取的紅豆皮多酚粗品使用AB-8型大孔樹脂進(jìn)行純化，上樣質(zhì)量濃度為2.5mg/mL紅豆皮多酚粗提液，洗脫液是體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，上樣液流速和洗脫液流速均為1.0 mL/min。將純化后的多酚溶液冷凍干燥，用于HPLC分析和抗氧化活性的檢測(cè)。

1.3.7 高效液相色譜測(cè)定紅豆皮多酚單體酚 色譜條件：Zorbox SB-C18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱箱溫度：30℃；檢測(cè)器：DAD，檢測(cè)波長280 nm。流動(dòng)相組成：100%甲醇（A）和0.5%冰醋酸（B）；流速：1.0mL/min；洗脫梯度見表1。根據(jù)樣品色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比較，判定單體酚種類。

表1 梯度洗脫表Table1 Gradient elution table

1.3.8 抗氧化試驗(yàn)

1.3.8.1 DPPH自由基清除率測(cè)定[15]精確配制0.2mmol/L DPPH乙醇溶液，避光放置，現(xiàn)用現(xiàn)配。精確配制不同質(zhì)量濃度樣液按照表2加入試劑后，室溫條件下避光放置30min，于517 nm波長處測(cè)定吸光度，并按公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

表2 DPPH自由基清除試驗(yàn)加樣表Table2 Sample table for DPPH free radical scavenging test

1.3.8.2 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定[16]精確配制不同質(zhì)量濃度樣液分別取0.5mL加入1mL 0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），于25℃水浴10min，再加入50μL預(yù)熱好的0.01mol/L鄰苯三酚溶液，迅速混勻，空白用10mmol/L的HCl溶液代替。于320 nm波長處每30 s測(cè)定吸光度1次。鄰苯三酚的自氧化速率用吸光度的斜率A0表示，加入樣品溶液后的鄰苯三酚氧化速率記為A1，并按公式（3）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

1.3.8.3 羥自由基清除率測(cè)定[17]精確配制不同質(zhì)量濃度樣液分別取2mL，分別加入2.0mL 8 mmol/L硫酸亞鐵溶液、2.0 mL 8mmol/L的水楊酸溶液和2mL 8mmol/L的過氧化氫溶液混勻，于37℃水浴30min，于510 nm波長處測(cè)定吸光度記為A1。蒸餾水代替樣液的混合液吸光度記為A0，蒸餾水代替水楊酸的混合液吸光度記為A2，并按公式（4）計(jì)算羥自由基清除率。

1.3.8.4 ABTS+·自由基清除率測(cè)定[18]將 7.4 mmol/L ABTS＋·溶液與2.6mmol/L過硫酸鉀溶液按體積比1∶1混勻，室溫避光靜置12 h，用pH 7.4的磷酸緩沖液稀釋至在734 nm處吸光度為0.7±0.02，記為A0，精確配制不同質(zhì)量濃度樣液分別取0.2mL與0.8mL ABTS工作液充分混合，避光靜置6min，于734 nm波長處測(cè)定吸光度記為A1，并按公式（5）計(jì)算ABTS自由基清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，紅豆皮多酚的提取量逐漸增大，并在體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)到最大值135.85mg/g，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)逐漸降低。這可能是由于水相比例較大時(shí)，溶出的水溶性雜質(zhì)較多，抑制了多酚的溶出。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，多酚溶出量趨于飽和。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，會(huì)使蛋白質(zhì)變性，阻止結(jié)合酚的溶出，此外，較高的乙醇使脂溶性雜質(zhì)增多，形成多酚的競(jìng)爭性抑制劑，導(dǎo)致多酚提取量降低。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.1.2 超聲功率對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響 由圖2可知，隨著超聲功率的增大，紅豆皮多酚的提取量逐漸增大，并在350W時(shí)達(dá)到最大值137.77 mg/g。然而當(dāng)超聲功率大于350W時(shí)，提取量逐漸下降，這可能是由于過大的超聲功率使溶液溫度過高，降低了多酚的穩(wěn)定性，破壞了分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取量降低。因此，選擇超聲功率為350W。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響 由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的延長，紅豆皮多酚提取量逐漸增大，并在30min時(shí)達(dá)到最大值143.41 mg/g。當(dāng)超聲時(shí)間在30min內(nèi)時(shí)，對(duì)細(xì)胞的破碎程度更加充分，多酚的提取量也逐漸增大，30min后趨于平穩(wěn)，這可能是因?yàn)榧t豆皮多酚可能已被基本提取，繼續(xù)超聲導(dǎo)致溶液溫度升高，多酚結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生降解。因此，選擇超聲波時(shí)間為30 min。

2.1.4 液料比對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響 由圖4可知，在液料比為30∶1～40∶1（mL/g）之間時(shí)，紅豆皮多酚的提取量逐漸增大，并在40∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大值144.59mg/g。隨著液料比增大，多酚的提取量逐漸下降，這可能是因?yàn)?0∶1（mL/g）時(shí)多酚類物質(zhì)已達(dá)到飽和，提高液料比反而會(huì)促進(jìn)其它雜質(zhì)溶出，造成提取溶劑的浪費(fèi)[19-20]。因此，選擇液料比為40∶1（mL/g）。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of azuki bean coat polyphenols

圖2 超聲功率對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of azuki bean coat polyphenols

圖3 超聲時(shí)間對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction yield of azuki bean coat polyphenols

圖4 液料比對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響Fig.4 Effect of liquid to solid ratio on the extraction yield of azuki bean coat polyphenols

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以紅豆皮多酚提取量為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行4因素3水平的工藝優(yōu)化試驗(yàn)。總共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，包括24個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)零點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3。

2.2.2 回歸方程擬合和方差分析 采用 Design-Expert 8.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析得到紅豆皮多酚提取量與各因素變量的二次方程模型為：Y=143.25+1.12A+2.80B-1.91C-0.59D+3.33AB+5.33AC+2.11AD-1.30BC-0.048BD-1.26CD-8.97A2-11.81B2-8.87C2+0.80D2。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Box-Behnken design with experimental results

表4 方差分析Table4 Analysis of variance of regression model

從表4可以看出，該回歸方程模型的P＜0.0001，表明該二次多項(xiàng)回歸模型極度顯著；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.4169＞0.05），說明模型與實(shí)際情況擬合程度較好。由R2=0.9795，RAdj2=0.9590，進(jìn)一步說明模型方程能夠很好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值。各因素對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響大小順序?yàn)椋撼暪β剩境晻r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比。

方程的一次項(xiàng)中B項(xiàng)對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響達(dá)到極度顯著水平（P＜0.0001），C項(xiàng)達(dá)到了高度顯著水平（P＜0.01），A 項(xiàng)達(dá)到了顯著水平（P＜0.05），而 D 項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響比較大，乙醇體積分?jǐn)?shù)次之，料液比相對(duì)影響較小，因此，在試驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制超聲功率和超聲時(shí)間；兩兩交互項(xiàng)中AC項(xiàng)極度顯著（P＜0.0001），AB項(xiàng)高度顯著（P＜0.01），AD 項(xiàng)顯著（P＜0.05），說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間兩兩因素交互作用對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響比較大，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比次之；各因素的二次項(xiàng)中，除了因素D2項(xiàng)外，其余因素的二次項(xiàng)對(duì)紅豆皮多酚提取量均有顯著影響。

2.2.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于各試驗(yàn)因素A、B、C和D所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，能夠更加形象的描述回歸方程，其二維平面的等高線圖能夠直觀地反映出各試驗(yàn)因素以及兩兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[21]。由響應(yīng)面圖形可知，超聲功率、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)的曲面彎曲程度較大，說明這3個(gè)因素對(duì)紅豆皮多酚提取量影響顯著。由等高線圖可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率、超聲時(shí)間、料液比之間的交互作用對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響顯著，其它因素交互作用則不明顯，與方差分析結(jié)果一致。

利用Design-Expert 8.05軟件對(duì)紅豆皮多酚提取工藝進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，得到的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)59.48%，超聲功率361.64W，超聲時(shí)間 29.39min，液料比 1∶30（g/mL），此條件下得出的紅豆皮多酚提取量預(yù)測(cè)值為144.86mg/g?？紤]到實(shí)際操作的局限性，將理論值修改為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲功率360 W，超聲時(shí)間30min，液料比1∶30（g/mL），通過3次平行試驗(yàn)，得出多酚提取量為（145.28±2.21）mg/g，說明試驗(yàn)優(yōu)化后的工藝參數(shù)比較可靠。

圖5 兩因素交互作用對(duì)紅豆皮多酚提取量的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and corresponding contour plots showing the effects of operating parameters on the extraction yield of azuki bean coat polyphenols

2.3 紅豆皮多酚高效液相色譜的測(cè)定結(jié)果

為進(jìn)一步探究紅豆皮中多酚類物質(zhì)成分，本研究通過高效液相色譜法測(cè)定了紅豆皮中13種單體酚，如圖6B。通過與圖6A中各標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間相對(duì)比，分析鑒定出13種成分如下：沒食子酸、蘆丁、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、阿魏酸、異牡荊素、牡荊素、異鼠李素、金絲桃苷、山奈酚、槲皮素，其中金絲桃苷為主成分峰。目前，很多研究表明這些單體酚能夠預(yù)防和治療很多由氧化應(yīng)激引起的相關(guān)疾病，例如原花青素、兒茶素、表兒茶素等具有多種生物活性，能夠預(yù)防心血管疾病[22]，抗腫瘤等[23]。蘆丁能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)化生成槲皮素，從而抑制脂肪細(xì)胞分化，起到緩解肥胖的作用[24]。沒食子酸具有抗心肌梗死，保護(hù)肝損傷等生物活性[25-26]，金絲桃苷具有抗抑郁，抗病毒等作用[27]。因此，紅豆皮多酚作為一種新型的天然抗氧化劑，具有重要的研究開發(fā)和利用價(jià)值。

圖6 紅豆皮多酚樣品（A）中13種單體酚和標(biāo)準(zhǔn)品混合液（B）的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatograms of the 13 monomer phenolics from azuki bean coat polyphenols（A）and the reference substance（B）

2.4 紅豆皮多酚抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果

2.4.1 紅豆皮多酚對(duì) DPPH自由基的清除能力如圖7所示，隨著質(zhì)量濃度的增大，多酚粗提物、純化物和VC對(duì)DPPH的清除率先不斷增大再趨于平緩，在質(zhì)量濃度為150μg/mL時(shí)多酚純化物與VC的清除效果相當(dāng)，達(dá)到最大值（96.53±1.38）%；多酚粗提物的效果最差，最大值為（74.56±2.85）%，說明紅豆皮多酚經(jīng)過純化后對(duì)DPPH有較強(qiáng)的清除效果稍弱于VC。

2.4.2 紅豆皮多酚對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力 如圖8所示，不同質(zhì)量濃度的多酚粗提物、純化物和VC都具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，在75μg/mL之前，多酚純化物的清除效果最好，VC次之，多酚粗提物最差。當(dāng)質(zhì)量濃度為125μg/mL時(shí)，多酚純化物的清除能力達(dá)到最大值（71.85±2.84）%，稍弱于VC，顯著高于粗提取物。

圖7 紅豆皮多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.7 DPPH free radical scavenging capacity of azuki bean coat polyphenols

圖8 紅豆皮多酚對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig.8 Superoxide free radical scavenging capacity of azuki bean coat polyphenols

2.4.3 紅豆皮多酚對(duì)羥自由基的清除能力 如圖9所示，多酚粗提物、純化物清除羥自由基的能力隨著質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢(shì)。在100μg/mL時(shí)多酚純化物對(duì)羥自由基清除率達(dá)到最大值（89.49±1.76）%，比VC高7%左右，比多酚粗提物高38%左右，說明經(jīng)過純化的多酚對(duì)羥自由基的清除能力高于VC。

2.4.4 紅豆皮多酚對(duì)ABTS+·自由基的清除能力如圖10所示，在質(zhì)量濃度小于60μg/mL時(shí)，VC對(duì)ABTS+·自由基的清除率高于多酚純化物和粗提物。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到90μg/mL時(shí)，多酚純化物的清除效果高于VC和粗提物，在質(zhì)量濃度150 μg/mL 時(shí)，達(dá)到最大值（93.97±2.37）%，說明紅豆皮多酚經(jīng)過純化后清除ABTS+·自由基的效果增強(qiáng)，且高于VC。

圖9 紅豆皮多酚對(duì)羥自由基的清除能力Fig.9 Hydroxyl free radical scavenging capacity of azuki bean coat polyphenols

圖10 紅豆皮多酚對(duì)ABTS+ ·自由基的清除能力Fig.10 ABTS+ ·free radical scavenging capacity of azuki bean coat polyphenols

通過SPSS軟件回歸分析得到多酚粗提物、多酚純化物和VC對(duì)上述4種自由基的半抑制質(zhì)量濃度IC50值見表4。

表4 紅豆皮多酚及VC的值Table4 IC50 values of azuki bean coat polyphenols and VC

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取紅豆皮多酚，最佳工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲功率360W，超聲時(shí)間30min，液料比30∶1（mL/g），在此條件下的多酚提取量為（145.28±2.21）mg/g，與理論值相符，說明該響應(yīng)面法優(yōu)化后的工藝參數(shù)可靠。各因素對(duì)紅豆皮多酚提取量的影響大小順序?yàn)槌暪β?、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比。通過此條件下得到的紅豆皮多酚的提取量比日本學(xué)者[6]（103mg/g）高出約 42mg/g。采用高效液相色譜法測(cè)定出紅豆皮多酚中的13種單體酚：沒食子酸、蘆丁、兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、阿魏酸、異牡荊素、牡荊素、異鼠李素、金絲桃苷、山奈酚、槲皮素。紅豆皮多酚DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除能力略低于VC，而對(duì)羥自由基、ABTS+·自由基清除能力高于VC，證明了從紅豆皮中提取的多酚化合物具有良好的抗氧化活性，可以作為天然的抗氧化劑。目前，日本學(xué)者對(duì)紅豆多酚類成分的研究較多[28]，我國紅豆資源豐富，因此對(duì)于紅豆皮多酚的研究應(yīng)該予以重視，研究要不斷深入到細(xì)胞、分子水平。本研究優(yōu)化了紅豆皮中多酚類物質(zhì)的提取工藝，并對(duì)其單體成分、抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)，不僅能夠提高紅豆的經(jīng)濟(jì)效益，也為紅豆皮多酚在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了良好的理論基礎(chǔ)。