二烯丙基二硫醚對產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌毒力基因表達(dá)及生物學(xué)特性的影響

李鑫鑫 楊春雪 吳虹燕 魏麗娜 侯紅漫 張公亮

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連 116034）

食用香料是一類能增添食物香味和香氣的食品添加劑[1]。在食用香料中，含硫香料占據(jù)非常重要的位置。由于硫的香氣閾值低，特點強，體積小，可廣泛應(yīng)用于食品香精，特別針對肉類風(fēng)味的不足，對提高風(fēng)味質(zhì)量起重要作用。其中硫醚的化合物是含有R-（S）n-R'結(jié)構(gòu)，在可食用含硫化合物這一類中含量最多的物質(zhì)[2]。二烯丙基二硫醚（Diallyl disulfide，DADS）在蔥屬植物中比較常見，為大蒜素中存在硫醚的有效成分之一，是綠色、安全的天然添加劑[3]，并且具有特有的風(fēng)味及良好的抑菌、抗腫瘤、抗癌等特性[4]。

產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）能引發(fā)一系列的人類疾病，包括出血性腸炎（HE）、水樣腹瀉、溶血性尿毒綜合征（Hemolytic-uremic syndrome，HUS）、血小板減少性紫癜（TTP）等。截至目前，由STEC引起的胃腸道疾病的爆發(fā)情況顯示，這種病原體已經(jīng)成為威脅人類健康最重要的病原體之一[5]。至今，已報道的由STEC引發(fā)的人類疾病，除了包含O157∶H7血清型之外，還有其它血清型，例如：O111，O26，O146 等，也占有重要比例[6]，因此，非O157產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌的研究也尤為重要。STEC相關(guān)毒力因子的表達(dá)是其致病性的關(guān)鍵，志賀毒素（Shiga toxin，stx）是主要的毒力因子，Stx 家族由Stx1基因和Stx2基因組成，能夠特異結(jié)合到許多組織的內(nèi)皮細(xì)胞，從而引發(fā)各種疾病[7]。eaeA是緊密黏附素基因，它編碼的蛋白有助于細(xì)菌黏附在腸黏膜不被排出；ehxA基因編碼EHEC溶血素（EHEC－h(huán)emolysin，ehxA）是一種用普通方法檢測不到的特異性溶血素，與出血性腸炎等疾病密切相關(guān)[8]。

本文以二烯丙基二硫醚為試驗原料，探究DADS對大腸桿菌的作用機理及生物學(xué)特性，研究其對非O157產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌的抑制作用。選取其亞抑菌濃度對大腸桿菌作用，采用實時熒光定量PCR的方法，探究非O157產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌中典型毒力因子stx2，eaeA和ehxA的表達(dá)情況，研究其對大腸桿菌游動能力的影響，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）編號：CICC 10670，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。

1.2 材料與試劑

二烯丙基二硫醚（Diallyl disulfide，DADS），美國Sigma公司；氫氧化鈉、瓊脂粉、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉，博諾試劑公司；RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒，根生化科技（北京）有限公司；SYBRPremix Ex TaqTM，寶生物工程（大連）有限公司；RNase-free Water、熒光定量PCR用引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1112C超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；YSQ-LS-50Sll立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DPR-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；202-OAB電熱恒溫干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-1750型紫外分光光度計，日本島津儀器有限公司；微量臺式離心機，Thermo Scientific；MyiQ TM 2 型熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養(yǎng)基的配制 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨 1 g，牛肉膏 0.3 g，氯化鈉 0.5 g，瓊脂 1.5 g，去離子水100mL，調(diào)pH值至7.0左右，121℃下滅菌20min。

Swimming 培養(yǎng)基：蛋白胨 1 g，NaCl 0.25 g，瓊脂0.3 g，去離子水100mL，121℃下滅菌20 min。

1.4.2 菌種的活化 取-80℃凍存的菌液，吸取50μL置于5mL液體培養(yǎng)基中，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，第一次活化；將上述菌液劃平板過夜培養(yǎng)，第二次活化；挑取平板上的單菌落，轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中用于后續(xù)試驗。

1.4.3 硫化物的處理 根據(jù)已知原液的分子質(zhì)量和密度，按照如下公式稀釋DADS至所需濃度，半數(shù)稀釋至適當(dāng)濃度，密封備用[9]。公式如下：

式中，n——摩爾質(zhì)量，mol/L；M——分子質(zhì)量；m——原液質(zhì)量，g；ρ——密度，g/mL；V1——加入原液的體積，L；V總-V1——加入溶劑的體積，L。

1.4.4 最低抑菌濃度的測定 按照公式稀釋DADS至5mol/L，再半數(shù)稀釋為所需濃度。加入1 mL菌液到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，吸取40 μL不同濃度的DADS分別加至100mL液體培養(yǎng)基中，致 DADS 終濃度達(dá)到 4，2，1，0.5，0.25，0.125,0.625mol/L，充分振蕩均勻，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在12 h內(nèi)，利用紫外分光光度計每隔3 h測量其OD600值，繪制生長動力學(xué)曲線。以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，時間t為橫坐標(biāo)，繪制試驗組和對照組生長曲線。與對照相比，若有細(xì)菌生長，記為陽性（+）；若無細(xì)菌生長，記為陰性（-）。以無細(xì)菌生長的DADS最低濃度記為MIC。每個濃度3組平行，試驗結(jié)果取平均值。添加等體積DMSO作為陰性對照[10]。

1.4.5 RNA的提取及cDNA的合成 參照Upadhyay等和Knudsen等[11-12]，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，分別添加不同亞抑菌濃度DADS，以未添加DADS的作為對照組，培養(yǎng)12 h，取適量的菌液按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用酶標(biāo)儀測得OD260/OD280比率，檢測RNA純度。

1.4.6 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中大腸桿菌基因全長序列為模板，設(shè)計stx2、eaeA、ehxA的上下游引物序列，另外內(nèi)參基因16SrRNA的上下游引物序列來自Andino等[13]的報道，4種基因的bp長度在200以內(nèi)。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列及擴增片段長度見表1。

1.4.7 實時定量熒光PCR 用實時熒光定量PCR儀測定stx2、eaeA、ehxA基因在亞抑菌濃度DADS作用下的相對表達(dá)量。RT-qPCR反應(yīng)條件如下：初始變性 95℃，1min后，95℃，20 s；62℃，20 s；80℃，15 s反應(yīng)40個循環(huán)，60℃處停留 15 s。在60℃時進行熒光信號采集，反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律自動生成熔融曲線。得到目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，用2-⊿⊿Ct法計算相對表達(dá)量[14]：

表1 實時熒光定量PCR引物Table1 The qRT-PCR primers

1.4.8 DADS對大腸桿菌游動能力的影響 方法參考Abreu等和Butler等[15-16]大腸桿菌游動能力的抑制試驗，取1mL大腸桿菌種子液接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min培養(yǎng)18 h。將20mL泳動培養(yǎng)基滅菌后冷卻至45℃左右時，分別加入不同濃度DADS溶液，加生理鹽水作為陽性對照。倒板，取3μL菌液點到平板中央。培養(yǎng)18 h后，用游標(biāo)卡尺測量擴散圈直徑，根據(jù)擴散圈直徑大小判斷DADS對大腸桿菌游動能力的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 DADS對大腸桿菌的最低抑菌濃度影響

DADS對大腸桿菌有明顯的抑菌作用。DADS對大腸桿菌最低抑菌濃度見表2。通過測定，當(dāng)DADS的添加濃度大于2mmol/L時，抑制大腸桿菌的生長。該結(jié)果與前期研究相一致[17]，DADS對革蘭氏陽性菌包括大腸桿菌有良好的抑制效果。與吳楠等[18]的研究結(jié)果相符，以大蒜精油為原料研究對包括大腸桿菌在內(nèi)8種菌的抑菌效果，提取的大蒜精油中DADS占19.35%。DADS對大腸桿菌生長曲線的影響如圖1所示，陽性對照組大腸桿菌生長曲線呈正常典型的生長曲線，在DADS濃度為MIC時，DADS可以明顯抑制大腸桿菌生長，使細(xì)菌無法生長，1/2MIC的DADS使細(xì)菌無法進入對數(shù)生長期，非典型生長狀態(tài)，曲線平緩。在1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC和1/32MIC的DADS作用下，大腸桿菌雖然可以進入對數(shù)生長期，但由于DADS的抑制作用，生長數(shù)量處于略低狀態(tài)，吸光度值始終低于陽性對照組。培養(yǎng)12 h時，陽性對照組的OD600值達(dá)到1.31，而1/2MIC的DADS的OD600值為0.73。DADS對大腸桿菌的抑菌作用在1/4MIC～MIC之間具有一定的濃度依賴性。

2.2 RNA提取的結(jié)果

RNA提取結(jié)果如圖2所示，分別為未添加DADS的對照組和添加 1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC和1/32 MIC的DADS試驗組。瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶清晰，提取濃度和純度都符合要求，滿足后續(xù)試驗要求。

表2 二烯丙基二硫醚對大腸桿菌的最低抑菌濃度Table2 Minimum antibacterial concentration of diallyl disulfide

圖1 DADS對大腸桿菌生長曲線的影響Fig.1 Effect of Diallyl disulfide on the growth curve of E.coli

2.3 二烯丙基二硫醚對大腸桿菌毒力基因表達(dá)的影響

探究二烯丙基二硫醚（DADS）對非O157產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌毒力因子stx2，eaeA，ehxA表達(dá)的影響。結(jié)果如圖3所示，隨著二烯丙基二硫醚添加量的增加，3種毒力基因的相對表達(dá)量都呈濃度依賴性。與未添加DADS組相比，DADS濃度為1/4MIC時，stx2基因的表達(dá)量降低了90.37%，有顯著差異性，而當(dāng)濃度為1/32MIC時，stx2基因的表達(dá)量也下降了43.42%，當(dāng)濃度為1/4MIC時，eaeA基因的相對表達(dá)量降低87.05%，ehxA基因降低了91.74%。

圖2 大腸桿菌總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of RNA samples for E.coli

圖3 DADS對大腸桿菌相關(guān)毒力基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of DADS on related virulence genes of E.coli

不同抑制劑對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的毒力基因均有抑制作用，對革蘭氏陰性菌毒力基因表達(dá)的影響：馬宗兵等[19]在研究大蒜素對副豬嗜血桿菌抑制作用機理時，通過定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，通過8μg/mL和16μg/mL大蒜素處理的副豬嗜血桿菌，溶血毒素基因hhdA、mviN以及抗生素外排泵基因norM表達(dá)下調(diào)，結(jié)果說明含硫化合物對副豬嗜血桿菌有明顯的抑制效果，并且可抑制溶血毒素、毒力因子以及抗生素外排泵等基因的表達(dá)。Crane等[20]以鋅為抑制劑研究產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌stx基因及其相關(guān)蛋白的表達(dá)，濃度為0.4mmol/L的鋅可以抑制stx1和stx2的表達(dá)，抑制率達(dá)到90%以上。對革蘭氏陽性菌毒力基因表達(dá)的影響：Shi等[21]得到類似結(jié)論，在37℃和4℃下，Nisin對單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力基因inlA，prfA，plcA和hlyA均有一定程度的抑制，Nisin濃度越高，毒力基因表達(dá)量越??；亞抑菌濃度魚腥草醇提物對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌α-溶血素呈劑量依賴式抑制[22]。

此外，其它研究結(jié)果表明，外源抑制劑不僅對大腸桿菌有應(yīng)答，對真核細(xì)胞也有抑制作用，如Di等[23]得到結(jié)論，在研究果膠寡糖對大腸桿菌O157∶H7黏附性和HT29細(xì)胞志賀毒素毒性影響時發(fā)現(xiàn)，在HT29細(xì)胞中POS1抑制志賀毒素效果最好，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

圖4 DADS對大腸桿菌游動能力的影響Fig.4 Effect of DADS on swimming ability of E.coli

圖5 DADS對大腸桿菌游動能力的抑制率Fig.5 The inhibition rate of DADS on swimming ability of E.coli

2.4 DADS對大腸桿菌游動能力的抑制作用

添加不同濃度的DADS對大腸桿菌游動能力的影響如圖4和圖5所示，亞抑菌濃度下的DADS即可抑制大腸桿菌的游動能力，并呈濃度依賴性。與對照組相比，當(dāng)添加1/4MIC的DADS時，即0.5 mmol/L，大腸桿菌產(chǎn)生的擴散圈直徑為（24.6±0.6）mm，抑制率達(dá)到 61.18%，添加 1/8MIC、1/16MIC和1/32MIC的DADS，大腸桿菌擴散圈的抑制率分別達(dá)到52.42%，29.38%，8.86%。隨著DADS添加濃度的增加，大腸桿菌的遷移能力減小，遷移距離縮短，游動能力降低。

在其它外源抑制劑對微生物游動能力的研究中，Abreu等[15]也得到類似結(jié)論，以異硫氰酸酯類的異硫氰酸苯乙酯（PITC）為原料，PITC抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的游動能力。游動能力與鞭毛基因有關(guān)，楊丙燁等[24]在研究西瓜細(xì)菌性果斑病菌鞭毛基因fliS的功能分析時，得到結(jié)論：即鞭毛基因fliS對果斑病菌鞭毛絲的形成、游動性、菌膜形成能力、生長速率、菌落形態(tài)、致病性等均有調(diào)控作用。游動能力和黏附基因也有關(guān)，Iversen等[25]研究腸出血性大腸桿菌毒力基因調(diào)控得到的結(jié)論。Li等[26]研究表明1/16MIC和1/32MIC的石榴皮對沙門氏菌群體感應(yīng)系統(tǒng)（QS）、毒力因子有抑制作用，對沙門氏菌的游動能力有明顯的抑制作用，結(jié)果表明，石榴皮作為群體感應(yīng)抑制劑對毒力基因和游動能力都有一定的調(diào)控作用。

圖6 DADS對大腸桿菌游動能力抑制作用Fig.6 Inhibition of the swimming ability of E.coli by DADS

3 結(jié)論

經(jīng)測定，DADS的MIC是2mmol/L。在不同濃度二烯丙基二硫醚（DADS）的作用下，非O157產(chǎn)志賀毒性大腸桿菌的生長受到不同程度的抑制，當(dāng)DADS的濃度為MIC時，大腸桿菌完全不生長；當(dāng)濃度為1/2MIC時，抑制大腸桿菌生長；當(dāng)濃度為1/4MIC到1/32MIC時，對大腸桿菌沒有抑制作用。添加亞抑菌濃度的二烯丙基二硫醚后，與對照相比，stx2、eaeA和ehxA基因均下調(diào)，并呈濃度依賴性。隨著DADS添加濃度的增加，大腸桿菌的游動能力減小，呈濃度依賴性。本試驗以含硫香料作為健康、高效的抑菌劑，為今后應(yīng)用于食品行業(yè)提供理論依據(jù)，為研究致病性大腸桿菌提供了新的思路。