適應(yīng)性免疫細(xì)胞在自身免疫性溶血性貧血發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展①

閻羽欣 陳廣潔

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海 200025)

自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia,AIHA)是由機(jī)體免疫調(diào)控異常、免疫調(diào)節(jié)紊亂等因素引起自身抗體和(或)補(bǔ)體作用于紅細(xì)胞膜，導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞的溶血性貧血。作為一種自身免疫性疾病，適應(yīng)性免疫細(xì)胞在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。隨著相關(guān)研究的不斷推進(jìn)，適應(yīng)性免疫細(xì)胞亞群與AIHA發(fā)病機(jī)制的關(guān)系逐漸明確。

適應(yīng)性免疫應(yīng)答的成分為淋巴細(xì)胞及其產(chǎn)物。具有特異性應(yīng)答能力的淋巴細(xì)胞分為B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞兩類，前者又稱為B細(xì)胞，后者又稱為T細(xì)胞。

1 B淋巴細(xì)胞在AIHA發(fā)病機(jī)制中的作用

1.1B1-a細(xì)胞和B2細(xì)胞在AIHA發(fā)病機(jī)制中的作用 根據(jù)B細(xì)胞不同的發(fā)育來源，可將B細(xì)胞分為B1細(xì)胞和B2細(xì)胞。根據(jù)是否表達(dá)CD5-分子，又可將B1細(xì)胞分為CD5+的B1-a細(xì)胞和CD5-的B1-b細(xì)胞[1]。B1細(xì)胞在個體發(fā)育胚胎期即產(chǎn)生，主要定居于腹膜腔、胸膜腔和腸道固有黏膜層中，產(chǎn)生低親和力的IgM，參與固有免疫；B2細(xì)胞是參與適應(yīng)性體液免疫的主要細(xì)胞，在抗原刺激和Th細(xì)胞的輔助下最終分化為抗體形成細(xì)胞——漿細(xì)胞。B1-b細(xì)胞在包括AIHA在內(nèi)的自身免疫病的發(fā)病機(jī)制中的作用鮮有報(bào)道，本文主要討論B1-a與B2細(xì)胞在AIHA發(fā)病機(jī)制中的作用。

CD5+的B細(xì)胞(B1-a細(xì)胞)是一類不需抗原提呈細(xì)胞輔助的，產(chǎn)生以IgM為主的低親和力、多反應(yīng)性抗體的B細(xì)胞亞群，在抵御外來微生物感染，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的(或初治組)AIHA患者外周血內(nèi)CD5+B細(xì)胞與健康人或緩解組AIHA患者相比均顯著增高[2,3]。CD5+B細(xì)胞的表面分子CD80、CD86的表達(dá)也顯著增高[2,4]。CD5+IL-10+B細(xì)胞占B淋巴細(xì)胞的百分比與AIHA患者的血紅蛋白、補(bǔ)體3(C3)水平呈負(fù)相關(guān)，與乳酸脫氫酶、總膽紅素、間接膽紅素水平呈正相關(guān)[3]。AIHA患者外周血內(nèi)CD5+B細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)水平升高，但CD5+B細(xì)胞分泌IL-10至外周血的能力下降，可能導(dǎo)致IL-10的免疫抑制功能不能充分發(fā)揮[2]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CD5+B淋巴細(xì)胞中CD5+TGF-β+B淋巴細(xì)胞比例和TGF-β的mRNA表達(dá)水平在新診斷和緩解AIHA方面與健康對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CD5+B淋巴細(xì)胞可通過分泌IL-10而非TGF-β來調(diào)控AIHA患者的免疫應(yīng)答[3]?；独萚5]研究發(fā)現(xiàn)，AIHA患者外周血中B1-a細(xì)胞及B細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞比例均明顯升高，表明在AIHA患者中，不但B1-a細(xì)胞增加，B2細(xì)胞也有明顯增加；患者在接受脾切除術(shù)，溶血得到控制后B1-a細(xì)胞明顯下降。研究顯示，4%～10%的慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)患者會發(fā)生自身免疫性血細(xì)胞減少癥，而AIHA是最常見的自身免疫性血細(xì)胞減少癥。CLL背景下的繼發(fā)性自身免疫性血細(xì)胞減少癥病因復(fù)雜，主要是由于非惡性B細(xì)胞產(chǎn)生多克隆高親和力的IgG抗體，其針對紅細(xì)胞和血小板上的抗原會分別導(dǎo)致溶血性貧血和免疫性血小板減少癥[6,7]，而這種高親和力的IgG抗體來源于B2細(xì)胞分化后的漿細(xì)胞。這些研究結(jié)果反映了B1-a細(xì)胞和B2細(xì)胞可通過過表達(dá)表面分子、分泌細(xì)胞因子以及產(chǎn)生IgM、IgG自身抗體等機(jī)制參與AIHA的發(fā)病。

關(guān)于B細(xì)胞尤其是B1-a細(xì)胞擴(kuò)增的機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，miR-150是一種在成熟、未活化的B細(xì)胞和T細(xì)胞中選擇性表達(dá)的miRNA。miR-150最重要的作用靶點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄因子c-Myb，而c-Myb對淋巴細(xì)胞發(fā)育和免疫應(yīng)答至關(guān)重要。miR-150在體內(nèi)控制c-Myb的表達(dá)，miR-150缺陷可導(dǎo)致B1細(xì)胞擴(kuò)增和體液免疫應(yīng)答增強(qiáng)[8]。Xing等[9]研究表明，AIHA患者體內(nèi)CD19+B細(xì)胞中的c-Myb mRNA表達(dá)上調(diào)，而miR-150表達(dá)下調(diào)，證明了miR-150與c-Myb之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明在AIHA患者中，miR-150很可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子c-Myb的表達(dá)從而調(diào)控B細(xì)胞的發(fā)育、分化和成熟，進(jìn)一步影響自身抗體的生成和自身免疫反應(yīng)。

除RNA水平的調(diào)節(jié)之外，B細(xì)胞活化因子(B-cell-activating factor,BAFF)在AIHA中的作用也受到廣泛關(guān)注。BAFF是TNF超家族的一員，主要由髓細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。BAFF在外周B細(xì)胞的產(chǎn)生、成熟及免疫球蛋白生成類別轉(zhuǎn)換中都起到重要的調(diào)控作用。BAFF可通過MEK5-ERK5 MAP激酶信號通路誘導(dǎo)成熟B細(xì)胞存活和B2細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)態(tài)維持[10]。Zhao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，AIHA患者，尤其是直接抗人球蛋白試驗(yàn)(direct antiglobulin test,DAT)結(jié)果呈IgG(+)C3(+)的患者血清BAFF水平顯著升高，提示以BAFF為靶點(diǎn)的靶向治療在AIHA患者中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，AIHA患者血清BAFF水平顯著高于健康人，并且血紅蛋白水平較低(血紅蛋白<8 g/dl)和LDH活性較高(LDH>480 U/ml)的患者血清BAFF水平顯著增加，而糖皮質(zhì)激素治療可以降低血清BAFF水平，因此血清BAFF水平可反映AIHA的臨床活性。以上研究結(jié)果提示AIHA患者血清中BAFF上調(diào)可促進(jìn)B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)。

1.2調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在AIHA發(fā)病機(jī)制中的作用 調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cell,Breg)是近年來新發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)免疫耐受、具有免疫抑制功能的B細(xì)胞亞群。人類中已發(fā)現(xiàn)的Breg表型有CD24hiCD27+、CD19+CD24hiCD27int、CD19+CD24hiCD38hi、CD19+CD25hiCD71hi等。通過產(chǎn)生IL-10、TGF-β和IL-35等細(xì)胞因子，Breg細(xì)胞可抑制促炎性淋巴細(xì)胞的分化，例如產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(TNF-α)的單核細(xì)胞、Th1細(xì)胞和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞等[13]。Breg細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等很多自身免疫病的發(fā)病機(jī)制中有重要作用[14]。研究表明，AIHA患者外周血中CD19+CD24hiCD27+Breg細(xì)胞的表達(dá)較健康對照組顯著降低，AIHA患者外周血中分泌IL-10濃度與健康對照組相比亦顯著降低[15]。朱奕等[16]研究發(fā)現(xiàn)，AIHA患者外周血單個核細(xì)胞中CD19+Tim-1+Breg細(xì)胞數(shù)量顯著低于健康對照組，并且培養(yǎng)液上清中IL-10水平也低于健康對照組。這些研究結(jié)果均提示Breg細(xì)胞數(shù)量和分泌功能的下降可能與AIHA的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

2 T淋巴細(xì)胞在AIHA發(fā)病機(jī)制中的作用

根據(jù)功能的不同，T細(xì)胞可分為輔助T細(xì)胞(helper T cell,Th)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL/cytotoxic T cell,Tc)。

2.1Th細(xì)胞在AIHA發(fā)病機(jī)制中的作用 Th細(xì)胞均表達(dá)CD4，通常所稱的CD4+T細(xì)胞即指Th細(xì)胞。未受抗原刺激的初始CD4+T細(xì)胞為Th0。在抗原性質(zhì)和局部免疫微環(huán)境中細(xì)胞因子等因素的調(diào)控下，Th0分化成不同亞群，包括Th1、Th2、Th17和濾泡輔助T細(xì)胞(follicular helper T cell,Tfh)等。

2.1.1Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞在AIHA發(fā)病機(jī)制中的作用 Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、IL-17和GM-CSF等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和遲發(fā)型超敏反應(yīng)，在抗感染、器官移植排斥反應(yīng)和自身免疫病誘導(dǎo)過程中有重要作用。Th1型細(xì)胞因子可促進(jìn)CTL、自然殺傷細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的活化和增殖，介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)。Hoyer等[17]實(shí)驗(yàn)表明，AIHA小鼠模型中存在Th1表型的CD4+T細(xì)胞擴(kuò)增和過度的Th1免疫應(yīng)答，而這種免疫應(yīng)答在IFN-γ被去除后消除。IFN-γ促進(jìn)調(diào)理性抗紅細(xì)胞抗體的產(chǎn)生并刺激脾巨噬細(xì)胞的吞噬活性，促進(jìn)AIHA的發(fā)生和發(fā)展。近期也有國內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，與健康對照組相比，AIHA 患者外周血中CD4+IFN-γ+Th1 細(xì)胞比顯著增高[18]。

Th2細(xì)胞主要分泌Th2型細(xì)胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等。它們能促進(jìn)Th2細(xì)胞的增殖，輔助B細(xì)胞活化，參與體液免疫反應(yīng)，同時抑制Th1細(xì)胞增殖。既往實(shí)驗(yàn)表明，AIHA患者外周血內(nèi)IL-4水平較健康對照組明顯升高，推測Th2細(xì)胞與IL-4促進(jìn)了AIHA的發(fā)病[19]。IL-33是新近發(fā)現(xiàn)的IL-1超家族的細(xì)胞因子，參與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。Bu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，AIHA患者外周血IL-33水平與健康對照組相比顯著升高，IL-33水平與AIHA疾病活動度呈正相關(guān)。另外，IL-33可促進(jìn)IgG型抗紅細(xì)胞自身抗體的產(chǎn)生，其機(jī)制正是促進(jìn)相關(guān)Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-13的表達(dá)。除此之外，實(shí)驗(yàn)表明，與健康對照組相比，活動性溫型AIHA患者外周血中存在Th1/Th2的不平衡、Th2細(xì)胞亞群的增加及IL-4與IL-10的表達(dá)增加，推測這種“Th2譜”促進(jìn)了自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆的誘導(dǎo)和增殖[21]。以上研究結(jié)果說明，Th1、Th2細(xì)胞數(shù)量、Th1/Th2比及兩種細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子水平變化參與了AIHA的發(fā)病。

2.1.2Th17細(xì)胞在AIHA發(fā)病機(jī)制中的作用 隨著免疫學(xué)研究的進(jìn)展，多種不同于Th1和Th2的細(xì)胞亞群被發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞是其中一個重要的亞群。Th17主要產(chǎn)生IL-17、IL-21等細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病。Th17細(xì)胞可通過表達(dá)B細(xì)胞的化學(xué)趨化物CXCL-13，激活B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，AIHA患者外周血中Th17比例顯著增高且與疾病活動度呈正相關(guān)，可促進(jìn)Th17分化和增殖的細(xì)胞因子IL-6與IL-21的表達(dá)水平在AIHA患者外周血中亦明顯增高。另外，Th17的過繼轉(zhuǎn)移與IL-17均可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生AIHA。Hall等[23]研究發(fā)現(xiàn)，AIHA患者血清中IL-17A的濃度與健康對照組相比顯著升高，并與貧血程度相關(guān)。在AIHA患者外周血中，已鑒定出的特異性自身抗原介導(dǎo)了IL-17A對紅細(xì)胞的免疫反應(yīng)，而在健康供體的外周血單個核細(xì)胞中，IL-17A與紅細(xì)胞不會發(fā)生免疫反應(yīng)。徐文艷等[24]研究顯示，AIHA溶血發(fā)作組患者CD3+CD4+IL-17+/CD3+CD4+細(xì)胞比例和CD3+CD4+IL-17+/T細(xì)胞比例均明顯高于緩解組和健康對照者，提示Th17細(xì)胞的活化可能參與AIHA的發(fā)病。CD69與Gelectin-1可共同調(diào)控Th17細(xì)胞，AIHA溶血發(fā)作組患者CD4+T細(xì)胞內(nèi)CD69 mRNA表達(dá)量顯著高于緩解組及健康對照組，且溶血發(fā)作組患者血漿CD69水平顯著高于健康對照組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明Th17及其分泌的細(xì)胞因子在AIHA的發(fā)病中起重要作用，并可能成為未來的治療靶點(diǎn)。

2.1.3Tfh細(xì)胞在AIHA發(fā)病機(jī)制中的作用 Tfh細(xì)胞最主要的功能是在生發(fā)中心輔助B細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞，Tfh的作用需要其分泌的IL-21參與。方周賓等[25]研究表明，與健康對照組相比，AIHA患者外周血中CD4+T細(xì)胞中Tfh/Th比例顯著升高，Treg/Th細(xì)胞比例顯著降低，Tfh/Treg細(xì)胞的比例顯著升高。另外，AIHA患者外周血中IL-21水平明顯高于健康對照組，而IL-10的水平低于對照組。提示Tfh與Treg細(xì)胞比例失衡和相應(yīng)的細(xì)胞因子分泌失調(diào)可能介導(dǎo)抗紅細(xì)胞自身抗體的產(chǎn)生，從而參與AIHA的發(fā)病。劉艷等[26]的實(shí)驗(yàn)亦表明AIHA患者Tfh細(xì)胞比例明顯高于正常對照組。這些結(jié)果提示有效抑制Tfh可能成為靶向治療AIHA的新思路。

2.2Treg在AIHA發(fā)病機(jī)制中的作用 Treg細(xì)胞膜表面表達(dá)CD25、CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte-associatedantigen 4)，核內(nèi)表達(dá)叉頭盒蛋白 3 轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged-helix transcription factor box P3，F(xiàn)oxp3)是Treg的重要的標(biāo)記物之一，也是其發(fā)育和功能發(fā)揮的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[27]。Treg主要通過直接接觸抑制靶細(xì)胞活化和分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子負(fù)調(diào)控免疫應(yīng)答。黃東平等[28]研究發(fā)現(xiàn)，AIHA患者治療前外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg較健康對照組顯著降低，經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療后患者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例較治療前明顯升高，較對照組也增高。黃繼賢等[29]研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg水平在AIHA發(fā)作患者中明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且淋巴細(xì)胞共刺激因子CD86比率上升，推測明顯上升的CD86可能進(jìn)而導(dǎo)致Treg生成減少，最終參與AIHA的發(fā)病。值得注意的是，Richards等[30]研究表明，在小鼠體內(nèi)，免疫系統(tǒng)對抗紅細(xì)胞自身抗體的耐受與Treg不足并無直接關(guān)系，即Treg對于防止紅細(xì)胞特異性的自身免疫反應(yīng)的發(fā)生并不是必需的，表明機(jī)體對于抗紅細(xì)胞自身抗體的耐受可能還存在其他免疫機(jī)制。

2.3CTL在AIHA發(fā)病機(jī)制中的作用 表達(dá)CD8分子的T細(xì)胞的主要功能亞群是CTL(Tc)。根據(jù)CTL分泌的細(xì)胞因子的不同，可以將其分為Tc1和Tc2兩個亞群。其中Tc1主要產(chǎn)生IL-2、TGF-β、IFN-γ等細(xì)胞因子，介導(dǎo)CTL的細(xì)胞毒活性；而Tc2主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-10等細(xì)胞因子，參與對B細(xì)胞的輔助。既往研究表明，AIHA患者外周血中Tcl、Tc2細(xì)胞百分率無明顯變化,與健康對照組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Tcl/Tc2 比例明顯升高，與對照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示AIHA患者體內(nèi)Tc1細(xì)胞占優(yōu)勢，可能通過釋放穿孔素、顆粒酶等方式特異性殺傷自體紅細(xì)胞，導(dǎo)致溶血性貧血[31]。但新近實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，AIHA患者中T細(xì)胞單克隆性的發(fā)生率顯著升高，且分析顯示單克隆T細(xì)胞屬于CD8+亞群，但這種T細(xì)胞克隆的持續(xù)存在與血紅蛋白水平和其他緩解或復(fù)發(fā)跡象無關(guān)，并且在治療和臨床改善后沒有消失(觀察期1～10年)，故推測 AIHA中T細(xì)胞克隆除對自身免疫過程有可能的致病作用外，并不直接參與溶血的維持和發(fā)展[32]。CTL在AIHA發(fā)病機(jī)制中的具體作用尚有爭議，并未全面闡明。

3 小結(jié)

綜上所述，B細(xì)胞與T細(xì)胞在AIHA的發(fā)病機(jī)制中均有重要作用。B細(xì)胞通過接受或不接受特異性抗原刺激產(chǎn)生抗體，攻擊自身紅細(xì)胞。B1-a細(xì)胞和B2細(xì)胞數(shù)量上升，介導(dǎo)了AIHA患者亢進(jìn)的自身體液免疫反應(yīng)。而具有免疫抑制功能的Breg數(shù)量減少，使機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能下降。T細(xì)胞中，Th細(xì)胞亞群及其分泌細(xì)胞因子的失衡參與了AIHA的發(fā)病，Tfh數(shù)量上升促進(jìn)了效應(yīng)B細(xì)胞的分化，Treg數(shù)量減少、功能下降導(dǎo)致免疫抑制功能降低，這些都是AIHA發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)。AIHA發(fā)病機(jī)制中適應(yīng)性免疫細(xì)胞的具體作用機(jī)制以及相關(guān)分子信號通路還未完全闡明，各細(xì)胞亞群的表面分子及細(xì)胞因子的表達(dá)水平變化還未有公認(rèn)的結(jié)論，這些都可成為今后科學(xué)研究的方向。將B細(xì)胞和(或)T細(xì)胞的特定亞群或其分泌的細(xì)胞因子作為靶點(diǎn)的針對性治療對于AIHA患者有積極意義，這也為今后科研工作帶來新的啟示。