J 亞群禽白血病病毒囊膜表面蛋白受體結(jié)合域鑒定

禽白血病是由禽白血病病毒（ALV）引起的一種具有傳染性的禽類腫瘤性疾病。J 亞群ALV（ALV-J）自1999 年在我國發(fā)現(xiàn)以來，對我國白羽肉雞、蛋用型雞、黃羽雞（我國地方品種雞）造成嚴重危害，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，同時也嚴重威脅我國家禽種源安全。ALV-J 通過其囊膜表面蛋白（gp85）與細胞受體chNHE1 的特異性結(jié)合啟動感染，而這種結(jié)合能力的強弱，可直接影響病毒侵入宿主細胞的水平，同時病毒侵入機制的闡明為研究抗病新技術也非常重要。我們前期的研究已證明，chNHE1 的第一個膜外環(huán)的A28～E39 位氨基酸是受體的最小功能域，其與gp85 蛋白直接結(jié)合，介導病毒進入，但gp85 蛋白如何與受體結(jié)合，哪些區(qū)域或氨基酸參與受體的結(jié)合，還不清楚。

近期在《Journal of Virology》發(fā)表了“The bipartite sequence motif in the N- and C-terminal of gp85 of Subgroup J avian leukosis virus plays a crucial role in receptor-binding and viral entry”的研究論文。該研究鑒定出ALV-J gp85的N端38-131氨基酸和C端的159-283氨基酸是影響gp85 蛋白與chNHE1 結(jié)合的關鍵氨基酸。此外，gp85 的糖基化位點Gly116 和Gly219 和半胱氨酸位點Cys60和Cys197在受體結(jié)合和病毒進入中起關鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于闡明ALV-J 進入宿主細胞的分子機制，為ALV-J的防控提供了新的抗病毒靶點。

為鑒定ALV-J gp85 蛋白與細胞受體chNHE1 的結(jié)合域，該研究首先表達了可溶性的具有生物學活性的gp85 蛋白，利用流式細胞術建立了檢測gp85 蛋白與chNHE1結(jié)合能力的方法。采用HA標簽逐段替換gp85蛋白全序列的策略，構建并表達了33 種嵌合gp85 蛋白。受體結(jié)合和固相結(jié)合實驗結(jié)果均表明：HA5-14（aa38-131）和HA18、HA20-31（aa159-283）的替換，顯著影響了gp85 蛋白與chNHE1 的結(jié)合能力。為了驗證這一結(jié)果，該研究將純化的33 種嵌合gp85 蛋白與RCAS（J）-EGFP 標簽病毒進行了病毒阻斷實驗，結(jié)果同樣表明，HA5-14（aa38-131）和HA18、HA20-31（aa159-283）的替換，導致嵌合gp85 蛋白不能夠阻斷RCAS（J）EGFP 標簽病毒進入靶細胞。綜上，gp85 蛋白的第38-131位和159-283位氨基酸是影響ALV-J與受體結(jié)合的關鍵氨基酸區(qū)域。

為進一步探究ALV-J gp85蛋白的糖基化位點和半胱氨酸位點對其結(jié)合受體結(jié)合力的影響，該研究將gp85 蛋白的第38-131 位和159-283 位氨基酸中的糖基化位點和半胱氨酸位點回復突變，然后利用流式細胞術和固相結(jié)合證實糖基化位點Gly116和Gly219、半胱氨酸Cys60 和Cys197 影響ALV-J 與受體的結(jié)合能力。為進一步驗證這2 個糖基化位點和2 個半胱氨酸對ALV-J 與受體結(jié)合、進入靶細胞的作用，該研究構建糖基化位點（Gly116 和Gly219）和半胱氨酸（Cys60 和Cys197）突變的4種重組毒（ΔN6，ΔN11，ΔC3和ΔC9）和對應回復突變的4 種重組毒（rN6、rN11、rC3 和rC9）。病毒拯救結(jié)果表明，僅回復突變的4 種重組毒rN6、rN11、rC3 和rC9 成功拯救；進入實驗結(jié)果表明，rN6、rN11、rC3 和rC9 重組病毒能夠有效進入DF-1細胞。這些結(jié)果表明，ALV-J gp85的糖基化位點Gly116和Gly219、半胱氨酸Cys60和Cys197對于受體結(jié)合和病毒進入至關重要。

目前還沒有用于禽白血病防控的疫苗或有效藥物，該病主要通過種群進化來控制，而疾病凈化是一項長期而復雜的過程，費時費力效率低，迫切需要建立新型有效的防控技術。該研究結(jié)果有利于闡明ALVJ入侵宿主細胞的分子機制，為研究抗ALV-J感染雞的研究提供了重要基因編輯靶點，為抗病育種提供重要技術支撐和理論指導。