硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞脂質(zhì)含量及脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

黃陳翠，孫 健，吉 紅，黃小城，邊晨晨

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料研究室，陜西咸陽，712100)

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一，由于生長迅速，飼料來源廣等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國主要的淡水養(yǎng)殖對象[1]。2018年我國草魚的年產(chǎn)量超過500萬噸，其產(chǎn)量位居淡水養(yǎng)殖品種之首。同時(shí)，草魚作為食用魚類和水生植物治理魚類在全球廣泛養(yǎng)殖[2]?？茖W(xué)家將草魚作為潛在的草食性模式動(dòng)物，展開了一系列營養(yǎng)、免疫、增殖放流相關(guān)的研究[3-5]。另一方面，草魚攝食較高脂質(zhì)水平日糧時(shí)，雖可快速生長并縮短上市周期，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致其腹腔脂肪過度蓄積，危害其健康，這一問題亟待解決[6,7]。

硫辛酸作為一種集抗氧化、減脂、提高免疫力等功能于一身的化合物，較多的研究報(bào)道其可以緩解高脂日糧對小鼠造成的負(fù)面影響，降低血脂、膽固醇等[8,9]。過去的研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加硫辛酸可以通過Nrf2-Keap1通路增強(qiáng)草魚抗氧化能力，緩解脂質(zhì)過氧化對草魚的毒性作用[10]，且適宜劑量的硫辛酸可以提高草魚的免疫功能和抗病性[11]。另外，硫辛酸可以通過激活A(yù)MPK-ATGL通路增強(qiáng)脂質(zhì)水解，同時(shí)調(diào)控PPARα-CPT1促進(jìn)脂肪酸β-氧化供能，從而減少草魚腹腔脂肪蓄積[12]。腹腔脂肪組織是草魚主要蓄積脂肪的部位，而脂肪組織主要由各類脂肪細(xì)胞組成，因此可以通過減少脂肪細(xì)胞脂質(zhì)含量的方法來解決脂肪組織的脂質(zhì)蓄積問題。然而，硫辛酸能否調(diào)控草魚脂肪細(xì)胞的脂代謝并減少脂質(zhì)含量尚不清楚。因此，本試驗(yàn)在體外研究硫辛酸對草魚成熟脂肪細(xì)胞脂代謝的影響，旨在豐富硫辛酸作為新型飼料添加劑在淡水魚類日糧中的應(yīng)用，同時(shí)也為淡水魚類健康養(yǎng)殖提供新思路。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要試劑：DMEMF12培養(yǎng)基(Hyclone)、PBS緩沖液、無脂肪酸牛血清白蛋白(Sigma)、I型膠原酶(Sigma)、硫辛酸(Sigma)、甘油三酯試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)、甘油試劑盒(南京建成生物工程研究所)、非酯化脂肪酸(NEFA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、RNAiso Plus (TaKaRa)、分析純的氯仿、異丙醇、無水乙醇、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、SYBR?Premix Ex TaqTMII (TaKaRa)等。

主要試驗(yàn)器材：剪刀鑷子等解剖器材、200目過濾網(wǎng)、移液槍、酶標(biāo)儀、實(shí)時(shí)定量-PCR儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 草魚脂肪細(xì)胞的分離

從楊凌康樂市場購買體重1 kg左右健康無病的草魚后暫養(yǎng)1 d。重?fù)纛^部致暈后剪斷鰓弓放血，用洗潔精清洗魚體3遍至潔凈。無菌環(huán)境下分離腹腔脂肪組織，首先用75%酒精擦拭體表3遍消毒滅菌，用解剖工具緩慢剖開草魚腹腔，分離腹腔脂肪組織。將分離的脂肪組織放入盛裝無血清DMEMF12培養(yǎng)基的燒杯中，稱重記錄。用PBS洗滌脂肪組織3次后，加入等體積的0.1% I型膠原酶酶液消化脂肪組織，消化過程中連續(xù)剪碎脂肪組織并攪拌，消化時(shí)間為30 min。用有血清培養(yǎng)基終止消化，200目過濾網(wǎng)過濾消化液至50 mL離心管，700g離心10 min。上層漂浮細(xì)胞為草魚成熟脂肪細(xì)胞，輕輕吸至另一潔凈的50 mL離心管并用PBS緩沖液洗滌三次后，用2%牛血清白蛋白緩沖液重懸備用。

1.2.2 草魚脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

硫辛酸處理草魚脂肪細(xì)胞的方法參考文獻(xiàn)[13]中的HUFA處理脂肪細(xì)胞方法。硫辛酸處理細(xì)胞的濃度參考文獻(xiàn)[12]，試驗(yàn)用含有不同濃度(0、50和200 μmol/L)硫辛酸的2%牛血清白蛋白緩沖液重懸草魚脂肪細(xì)胞，細(xì)胞濃度為6×105/mL，將細(xì)胞均勻地接種在24孔培養(yǎng)板中，放入28 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h后取出細(xì)胞，立即放于冰盒上終止反應(yīng)，4 ℃離心機(jī)700g離心10 min，用移液槍緩慢收集上層脂肪細(xì)胞至新的離心管，另外收集下層培養(yǎng)液。其中每個(gè)處理12個(gè)重復(fù)，每三個(gè)重復(fù)的樣品混合為一個(gè)樣本。

1.2.3 甘油三酯、甘油和非酯化脂肪酸檢測方法

將收集的脂肪細(xì)胞用PBS洗滌兩次后，加入400 μL細(xì)胞裂解液，將細(xì)胞裂解后，用于檢測草魚脂肪細(xì)胞甘油三酯含量及蛋白濃度。培養(yǎng)液用于檢測脂肪細(xì)胞甘油和非酯化脂肪酸的釋放量。

草魚脂肪細(xì)胞甘油三酯含量和蛋白濃度，培養(yǎng)基甘油和非酯化脂肪酸含量的檢測方法分別按照甘油三酯試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)、甘油試劑盒(南京建成生物工程研究所)、非酯化脂肪酸(NEFA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書執(zhí)行。

1.2.4 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR

按照文獻(xiàn)[14]中草魚成熟脂肪細(xì)胞總RNA的提取方法進(jìn)行總RNA的提取和濃度測定，每個(gè)處理12個(gè)重復(fù)，每3個(gè)重復(fù)的樣品混合為一個(gè)樣本。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)得到cDNA備用。試驗(yàn)采用CFX96實(shí)時(shí)定量PCR檢測系統(tǒng)，定量引物見表1，反應(yīng)體積為20 μL，包含10 μL 2×SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ，7.8 μL 雙蒸水，1 μL cDNA 和各0.6 μL的引物。整個(gè)反應(yīng)過程是95 ℃，30 s，然后95 ℃，5 s，最后60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，利用溶解曲線對產(chǎn)物的唯一性進(jìn)行分析。β-actin作為內(nèi)參，相對定量法比較CT2-ΔΔCt，計(jì)算基因表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences used for real-time PCR analysis of mRNA expression

注：TG：甘油三酯；NEFA：非酯化脂肪酸；ATGL：脂肪甘油三酯脂酶；HSL：激素敏感性甘油三酯脂肪酶；MGL：單酰甘油脂肪酶；PPARα：過氧化物酶體增殖物激活受體α；CPT1：肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1；LPL：脂蛋白酯酶；CD36：脂肪酸轉(zhuǎn)移酶；Leptin：瘦素；TNFα：腫瘤壞死因子-α；SREBP-1c：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c；FAS：脂肪酸合成酶；ACC：乙酰輔酶A羧化酶；DGAT：甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶；PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ；GyK：甘油激酶

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件分析。試驗(yàn)結(jié)果用平均值或者平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS的單因素方差分析法(one-way ANOVA)和Duncan多重比較分析甘油三酯、甘油和非酯化脂肪酸的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)采用SPSS的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行分析。差異水平為P<0.05。使用GraphPad Prism 5 (Graphpad Software，San Diego，CA)軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞甘油三酯含量的影響

硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞甘油三酯含量的影響結(jié)果見圖1。50和200 μmol/L硫辛酸孵育草魚脂肪細(xì)胞6 h均可顯著降低細(xì)胞甘油三酯含量。

圖1 硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞甘油三酯含量的影響Fig.1 The effect of α-lipoic acid on triglyceride content of adipocyte in C.idellus 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同字母上標(biāo)表示差異顯著，下同

2.2 硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞甘油和非酯化脂肪酸釋放量的影響

硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞甘油和非酯化脂肪酸釋放量的影響結(jié)果見圖2。50 μmol/L硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞甘油和非酯化脂肪酸(NEFA)釋放量無顯著影響，200 μmol/L硫辛酸極顯著增加草魚脂肪細(xì)胞甘油和NEFA釋放量。

圖2 硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞甘油和非酯化脂肪酸釋放量的影響Fig.2 The effect of α-lipoic acid on the release of glyoerol and non-esterified fatty acid (NEFA) of adipocyte in C.idellusA：培養(yǎng)基甘油含量；B：培養(yǎng)基非酯化脂肪酸(NEFA)含量。

2.3 硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3.1 硫辛酸對脂肪分解相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖3A所示，200 μmol/L硫辛酸處理草魚脂肪細(xì)胞6 h后，顯著增加HSL的mRNA表達(dá)，對ATGL和MGL的mRNA表達(dá)無影響。硫辛酸對脂肪酸β-氧化相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果見圖3B，200 μmol/L硫辛酸顯著增加草魚脂肪細(xì)胞PPARα、CPT1和CD36的mRNA表達(dá)，對LPL的mRNA表達(dá)無顯著影響。另外，200 μmol/L硫辛酸處理草魚脂肪細(xì)胞6 h對脂肪細(xì)胞因子Leptin和TNFα的mRNA表達(dá)無顯著影響(圖3C)。

2.3.2 硫辛酸對脂合成基因表達(dá)的影響

圖3 硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞脂肪分解相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.3 The effect of α-lipoic acid on mRNA expression of the genes related to lipolysis of adipocyte in C.idellus 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，“**”表示差異極顯著，下同

圖4 硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 The effect of α-lipoic acid on mRNA expression of the genes related to lipogenesis of adipocyte in C.idellus

如圖4所示，200 μmol/L硫辛酸極顯著增加ACC和PPARγ的mRNA表達(dá)，對SREBP-1c、FAS、DGAT2和GyK的mRNA表達(dá)無顯著影響。

3 討論

硫辛酸是一種具有抗氧化、提高免疫力、調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝等功能的自然化合物，作為一種新型飼料添加劑已在陸上動(dòng)物養(yǎng)殖中得到了較為廣泛的研究。日糧中添加硫辛酸對哺乳動(dòng)物的降脂功能已經(jīng)得到確認(rèn)，有研究指出，在高脂或高膽固醇日糧中添加硫辛酸可以降低總血脂、甘油三酯和膽固醇含量[15,16]。Jia等[17]研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加硫辛酸也能顯著降低肉雞血清甘油三酯(TG)含量和增加非酯化脂肪酸(NEFA)的含量。另外，硫辛酸可以增強(qiáng)肉雞肝臟和脂肪組織的脂質(zhì)代謝，離體情況下增加其脂肪細(xì)胞的甘油釋放量[18]。Shi等[12]研究發(fā)現(xiàn)硫辛酸可顯著降低脂質(zhì)蓄積肝細(xì)胞的甘油三酯含量。在3T3前體脂肪細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，硫辛酸可以抑制脂肪細(xì)胞早期分化，在分化后7天，硫辛酸顯著降低了脂質(zhì)含量[19]。目前尚無有關(guān)硫辛酸在魚類脂肪細(xì)胞上的研究，本研究發(fā)現(xiàn)200 μmol/L硫辛酸處理草魚脂肪細(xì)胞處理6 h后，細(xì)胞甘油三酯含量下降，且草魚成熟脂肪細(xì)胞的甘油和NEFA的釋放量顯著增加。相似的結(jié)果在3T3脂肪細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)，250 μmol/L硫辛酸處理孵育成熟的3T3脂肪細(xì)胞6 h后，處理組比對照組甘油釋放量顯著上升且差異最大，100 μmol/L硫辛酸處理3 h后非酯化脂肪酸顯著高于對照組[20]。為了進(jìn)一步探究硫辛酸對草魚脂肪細(xì)胞脂代謝的調(diào)控作用機(jī)制，本試驗(yàn)對脂質(zhì)代謝的相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。

甘油三酯的水解是脂肪分解的重要組成部分，該過程必須通過脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)、激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)和單酰甘油脂肪酶(MGL)三類脂肪酶的連續(xù)作用才會(huì)產(chǎn)生甘油和非酯化脂肪酸[21]。本研究發(fā)現(xiàn)200 μmol/L硫辛酸處理顯著增強(qiáng)HSL mRNA的表達(dá)，對ATGL和MGL mRNA的表達(dá)無影響。之前的研究發(fā)現(xiàn)250 μmol/L硫辛酸顯著上調(diào)脂質(zhì)蓄積草魚肝細(xì)胞ATGL和HSL mRNA的表達(dá)，并降低肝細(xì)胞TG含量[12]。與本研究結(jié)果不同的原因可能是由于硫辛酸對不同類型細(xì)胞的脂質(zhì)水解的調(diào)控不同，即這種差異與脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞的不同有關(guān)。硫辛酸處理3T3脂肪細(xì)胞得到和本研究類似的結(jié)果，硫辛酸通過激活HSL磷酸化促進(jìn)脂肪分解，對ATGL和G0S2的蛋白表達(dá)無影響[20]。另一方面，本研究結(jié)果表明硫辛酸可以顯著增強(qiáng)草魚脂肪細(xì)胞脂肪酸β-氧化相關(guān)基因(PPARα和CPT1)mRNA表達(dá)，這一結(jié)果和前人的研究結(jié)果相同[8,12]。

脂質(zhì)代謝是一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的過程，表觀的脂質(zhì)含量是脂質(zhì)分解代謝和合成代謝的綜合體現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)硫辛酸可以上調(diào)草魚脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)合成部分基因(ACC和PPARγ)mRNA的表達(dá)，對其他脂質(zhì)合成基因表達(dá)無顯著影響。乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成的重要限速步驟，關(guān)系到甘油三酯(TG)的底物濃度[22]。與本研究結(jié)果相反，前人研究報(bào)道飼喂硫辛酸日糧會(huì)降低乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶(FAS)的基因表達(dá)，抑制小鼠的脂質(zhì)合成[23]。硫辛酸能夠降低小鼠肝臟脂質(zhì)含量，也是通過抑制肝臟脂肪酸合成[24]。草魚脂肪細(xì)胞的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)可以刺激甘油激酶(Gyk)的活性，而Gyk可以直接使脂質(zhì)水解產(chǎn)生的甘油成為TG合成的直接原料-3-磷酸甘油[25]。而本研究發(fā)現(xiàn)硫辛酸增加草魚成熟脂肪細(xì)胞PPARγ mRNA表達(dá)卻并沒有導(dǎo)致Gyk mRNA表達(dá)上升。實(shí)際上，PPARγ在人類的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中除了調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成外，激活后可調(diào)節(jié)脂肪酸氧化酶系，促進(jìn)脂質(zhì)的氧化代謝[26]。本研究中PPARγ的mRNA表達(dá)上調(diào)可能是由于硫辛酸激活了PPARγ促進(jìn)脂質(zhì)氧化代謝的功能。