外源硫化氫緩解桑樹(shù)重金屬脅迫的效應(yīng)分析

高鴻鵬 杜 賡 李文強(qiáng) 董小龍 蘇 超 張敏娟*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)蠶桑絲綢研究所/ 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

由于過(guò)去工業(yè)和礦業(yè)的長(zhǎng)期粗放式發(fā)展，土壤重金屬污染對(duì)農(nóng)業(yè)的嚴(yán)重危害漸漸顯現(xiàn)。我國(guó)農(nóng)業(yè)土壤受重金屬影響已達(dá)2 000萬(wàn)公頃，其中鎘的危害性位列第一，其次是鉛、鋅、銅和汞。重金屬脅迫下，作物生長(zhǎng)發(fā)育異常，糧食減產(chǎn)，年經(jīng)濟(jì)損失達(dá)200億元[1]。 鎘和砷是礦區(qū)土地重金屬污染的前兩位首要污染物，都具有強(qiáng)烈的毒性，其污染范圍廣、穩(wěn)定不可降解，在環(huán)境中可長(zhǎng)期積累[2-3]。鎘和砷被植物吸收之后直接影響了植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，并且，土壤中的鎘和砷可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康，所以，植物在重金屬脅迫下的損傷與抗性機(jī)制研究已成為研究熱點(diǎn)。因此，對(duì)植物鎘、砷脅迫下的生長(zhǎng)和發(fā)育進(jìn)行研究，探討鎘、砷毒害對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，能夠?yàn)轭A(yù)防作物減產(chǎn)和鎘、砷中毒提供理論依據(jù)。

種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)是植物生命周期的重要階段，也是對(duì)外界環(huán)境因子最敏感的時(shí)期之一，因而種子萌發(fā)和苗期生長(zhǎng)指標(biāo)常用來(lái)評(píng)價(jià)植物的重金屬耐性[4-8]。種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，也是植物最早感受重金屬脅迫的階段，了解種子萌發(fā)對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)，是系統(tǒng)認(rèn)識(shí)逆境傷害機(jī)理的較好途徑。桑樹(shù)作為具有重要修復(fù)潛力的木本植物，其在重金屬污染土壤修復(fù)方面的可行性已被研究證實(shí)[9-13]。研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬污染地區(qū)，種子受重金屬脅迫傷害，會(huì)造成發(fā)芽率降低，生長(zhǎng)緩慢，根部發(fā)育不良等現(xiàn)象。而有關(guān)外源物質(zhì)緩解重金屬鎘或砷脅迫對(duì)桑樹(shù)種子萌發(fā)的傷害研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

硫化氫是重要的氣體信號(hào)分子，能夠緩解非生物脅迫對(duì)植物的傷害作用，對(duì)于植物抵抗逆境脅迫非常重要[14-15]。本研究擬利用硫化氫的供體硫氫化鈉溶液浸種處理，探討外源施加硫化氫是否能夠緩解重金屬鎘或砷對(duì)于桑樹(shù)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的脅迫作用，為闡明鎘、砷脅迫下的植物損傷與抗性機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)為緩解鎘、砷對(duì)植物的毒害作用進(jìn)而提高植物的產(chǎn)量和品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以桑樹(shù)品種豐馳桑的種子為材料，桑種采集于上一年四月到五月，4 ℃保存。重金屬鎘和砷的供體為無(wú)水氯化鎘(CdCl2)和無(wú)水亞砷酸鈉(NaASO2)，以上試劑購(gòu)自Aladdin公司。H2S供體為硫氫化鈉(NaHS)購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子消毒

將種子清洗干凈，加入適量水，種子吸水12 h進(jìn)行活化。將吸脹的種子置于超凈工作臺(tái)上，以70%酒精消毒5 min，次氯酸鈉溶液(有效氯含量不低于1%)消毒30 min，無(wú)菌水漂洗，無(wú)菌種子置于無(wú)菌濾紙上靜置吹干，至表面無(wú)明顯水漬時(shí)，用于下一步試驗(yàn)。

1.2.2 萌發(fā)試驗(yàn)

采用瓊脂平板作為發(fā)芽床進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，重金屬處理包括鎘處理和砷處理，分別以種子發(fā)芽抑制率大于50%的重金屬濃度作為處理濃度，其中，鎘濃度設(shè)置為0.15 mmol/L，砷濃度設(shè)置為38 mmol/L，向各組重金屬處理液中加入7 g/L瓊脂，高溫高壓滅菌后制備瓊脂平板，空白對(duì)照組(CK)用蒸餾水制備瓊脂平板。

1.2.3 硫氫化鈉浸種處理

設(shè)置硫氫化鈉濃度為0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L, 1.5 mmol/L，室溫浸種12 h。將消毒后的種子整齊排列在上述平板上，每皿30粒種子，每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù)，培養(yǎng)皿于23 ℃恒溫培養(yǎng)室暗培養(yǎng)。

1. 3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

以芽長(zhǎng)與種子長(zhǎng)度相等即認(rèn)為發(fā)芽，每天定時(shí)對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿發(fā)芽種子數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用游標(biāo)卡尺測(cè)量發(fā)芽種子的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)。計(jì)算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、(平均)種苗生長(zhǎng)量和種子活力指數(shù)。發(fā)芽率為最終發(fā)芽數(shù)與供試種子數(shù)比值。發(fā)芽勢(shì)為發(fā)芽高峰期發(fā)芽種子數(shù)與供試數(shù)比值，取開(kāi)始發(fā)芽的4 d為標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算公式如下：

發(fā)芽指數(shù)：

式中Gt為發(fā)芽種子粒數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)，即(當(dāng)天發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽日數(shù))的累加。

種子活力指數(shù)：

式中S即種苗生長(zhǎng)量，為種苗的全長(zhǎng)。

用Excel和SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算3次重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s方法比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，顯著性水平設(shè)置為0.05。

圖1 硫化氫對(duì)鎘脅迫下桑樹(shù)種子萌發(fā)指標(biāo)的影響注：鎘處理濃度為0.15 mmol/L，硫氫化鈉濃度為0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L，1.5 mmol/L，不同小寫字母表示處理之間具有顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源硫化氫對(duì)鎘脅迫下桑樹(shù)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，0.15 mmol/L鎘脅迫下桑樹(shù)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)急劇下降，其中發(fā)芽率降低了41.1%，發(fā)芽勢(shì)降低了63.3%。硫氫化鈉浸種處理緩解了鎘脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制，種子平均發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)升高。0.3 mmol/L硫氫化鈉浸種處理發(fā)芽率升高不顯著，0.9 mmol/L和1.5 mmol/L硫氫化鈉處理組發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)顯著升高，其中，1.5 mmol/L硫氫化鈉處理組發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)分別升高了28.9%，46.7%和10.3。與空白對(duì)照相比，1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種后鎘脅迫處理，種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別降低了12.2%和16.7%，沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種緩解了0.15 mmol/L鎘脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用。

從種苗生長(zhǎng)量和種子活力指數(shù)看(圖2)，0.3 mmol/L和0.9 mmol/L硫氫化鈉浸種處理后種子活力指數(shù)和種苗生長(zhǎng)量與0.15 mmol/L鎘脅迫處理沒(méi)有顯著差異，1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種后種子活力指數(shù)和種苗生長(zhǎng)量顯著高于鎘脅迫處理種子，而顯著低于空白對(duì)照種子，說(shuō)明1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種處理能夠緩解鎘脅迫對(duì)種子萌發(fā)后幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，但不能使幼苗完全恢復(fù)非脅迫下的生長(zhǎng)水平。

圖2 硫化氫對(duì)鎘脅迫下種苗生長(zhǎng)量以及種子活力指數(shù)的影響注：鎘處理濃度為0.15 mmol/L，硫氫化鈉濃度為0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L，1.5 mmol/L，不同小寫字母表示處理之間具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 外源硫化氫對(duì)砷脅迫下桑樹(shù)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

如圖3所示，38 mmol/L砷脅迫下桑樹(shù)種子萌發(fā)受到顯著抑制，發(fā)芽率降低了41.1%，發(fā)芽勢(shì)降低了53.3%，發(fā)芽指數(shù)降低了8.9。1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種處理能夠緩解砷脅迫對(duì)種子萌發(fā)抑制作用，0.3 mmol/L硫氫化鈉浸種處理后種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)分別升高了27.8%和35.6%，顯著高于砷處理組。0.9 mmol/L和1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種后，二者之間發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)沒(méi)有顯著差異，但二者的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)均顯著低于空白對(duì)照組，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)比對(duì)照分別降低了13.3%和17.8%，表明NaHS處理能夠緩解砷對(duì)種子萌發(fā)的脅迫，且此種效應(yīng)具有劑量依賴性。

圖3 硫化氫對(duì)砷脅迫下桑樹(shù)種子萌發(fā)指標(biāo)的影響注：砷處理濃度為38 mmol/L，硫氫化鈉濃度為0 mmol/L，0.3 mmol/L, 0.9 mmol/L,1.5 mmol/L，不同小寫字母表示處理之間具有顯著性差異(P<0.05)。

活力指數(shù)是表示種子活力比較全面的一項(xiàng)指標(biāo)，它是種子發(fā)芽能力和幼苗長(zhǎng)勢(shì)的綜合表示，數(shù)值高，種子活力大。如圖4所示，當(dāng)NaHS濃度高于0.3 mmol/L時(shí)，種苗生長(zhǎng)量顯著高于砷處理組，當(dāng)NaHS濃度高于0.9 mmol/L時(shí)，種子活力指數(shù)顯著高于砷處理組。而1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種后種苗生長(zhǎng)量與種子活力指數(shù)呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明硫氫化鈉緩解砷脅迫抑制種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有劑量依賴性，但此種緩解作用可能存在一個(gè)濃度限值。

圖4 硫化氫對(duì)砷脅迫下種苗生長(zhǎng)量以及種子活力指數(shù)的影響注：砷處理濃度為38 mmol/L，硫氫化鈉濃度為0 mmol/L，0.3 mmol/L，0.9 mmol/L，1.5 mmol/L，不同小寫字母表示處理之間具有顯著性差異(P<0.05)。

3 討 論

種子作為植物的繁殖體，承載著植物所有的遺傳信息，種子的萌發(fā)與否決定著植株的生命及群落的形成和演替。因此，深入研究桑樹(shù)種子萌發(fā)的抗逆性遺傳調(diào)控機(jī)理并進(jìn)行高抗種質(zhì)資源的鑒定，能夠?yàn)樯?shù)種質(zhì)的遺傳改良和抗逆品種選育奠定理論基礎(chǔ)。

硫化氫(H2S)是繼一氧化氮和一氧化碳后發(fā)現(xiàn)的第3個(gè)氣體信號(hào)分子。外源硫化氫可促進(jìn)植物種子萌發(fā)、根的形態(tài)建成、延遲衰老以及增強(qiáng)植物抗逆性[14-15]。外源硫化氫的作用濃度因物種、器官以及生長(zhǎng)時(shí)期而異，其作用方式表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度毒害[16-17]。以不同濃度的硫氫化鈉處理大豆種子，與對(duì)照相比，當(dāng)硫氫化鈉濃度在0～250 mmol/L時(shí)，對(duì)種子萌發(fā)沒(méi)有顯著影響；300 mmol/L硫氫化鈉處理能夠使大豆種子發(fā)芽率從40% 提高到65%；當(dāng)硫氫化鈉濃度在400～700 mmol/L時(shí)，種子發(fā)芽率開(kāi)始降低[18]。本研究結(jié)果表明，以種子發(fā)芽抑制率為50%的鎘濃度來(lái)脅迫桑樹(shù)種子，隨著硫氫化鈉的濃度升高，其對(duì)脅迫的緩解作用增強(qiáng)，1.5 mmol/L硫氫化鈉浸種后對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種苗生長(zhǎng)量以及種子活力指數(shù)的提高與0.3 mmol/L硫氫化鈉浸種具有顯著性差異；而以種子發(fā)芽抑制率為50%的砷濃度來(lái)脅迫桑樹(shù)種子發(fā)現(xiàn)，隨著硫氫化鈉濃度升高，發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)無(wú)顯著提高，發(fā)芽勢(shì)顯著提高；而種苗生長(zhǎng)量和種子活力指數(shù)在1.5mmol/L 硫氫化鈉處理組表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，體現(xiàn)出低濃度促進(jìn)，高濃度抑制現(xiàn)象。硫化氫能夠緩解多種非生物脅迫處理對(duì)植物種子萌發(fā)的抑制作用，植物所適應(yīng)的外源硫化氫的量隨物種不同而有差異。培養(yǎng)液中加入0.75 mmol/L H2S可顯著促進(jìn)干旱脅迫下水稻種子萌發(fā)，一定程度上緩解PEG對(duì)水稻種子萌發(fā)的抑制作用[19]。0.3 mmol/L外源硫化氫處理顯著提高了水分脅迫條件下玉米種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長(zhǎng)、株高、根系和地上部分鮮重，顯著降低了相對(duì)傷害率[20]。硫氫化鈉浸種處理緩解了重金屬鎘對(duì)小麥種子萌發(fā)的脅迫作用，顯著增長(zhǎng)小麥胚芽，但對(duì)小麥種子根的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響[21]。本研究結(jié)果證實(shí)硫化氫能夠顯著緩解鎘、砷脅迫對(duì)桑樹(shù)種子萌發(fā)的抑制，但對(duì)于解除鎘、砷脅迫對(duì)萌發(fā)后幼苗生長(zhǎng)的抑制作用并不顯著，而已有研究表明，硫氫化鈉噴施葉片或者浸泡根部處理均能緩解重金屬脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，因此，硫化氫在何種濃度、何種作用方式下能夠緩解鎘、砷脅迫對(duì)桑樹(shù)種子萌發(fā)后幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，硫氫化鈉浸種對(duì)桑樹(shù)重金屬脅迫傷害的緩解能否用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐還需新的研究來(lái)證實(shí)。