酶法催化酯交換制備甘油二酯工藝優(yōu)化研究

馬靖軒，馬傳國,2,3，李利君,2,3，劉 偉，劉 君,2,3

(1.河南工業(yè)大學糧油食品學院，鄭州 450001； 2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室,鄭州 450001；3.國家糧食局糧油食品工程技術研究中心，鄭州 450001)

甘油二酯是油脂中的天然物質，但在常見的普通油脂中含量較少[1]。甘油二酯的代謝途徑與甘油三酯不同，甘油二酯可以減少動物和人體內的脂肪積累，對肥胖及與體重相關的疾病有益[2]。此外，甘油二酯可作為食品級乳化劑，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領域[3]。甘油二酯的制備方法主要有化學法[4- 5]和生物酶法[6-7]兩種?；瘜W法存在反應溫度較高、催化劑專一性較差、甘油二酯含量低、能耗大以及環(huán)境污染等問題[8]。生物酶法相比于化學法具有反應條件溫和、專一性高、產物得率高、分離純化簡單、環(huán)境友好、固定酶可重復使用等優(yōu)點，是最有應用前景的生產工藝[9-10]。

酯交換法可以引入原料油中含量較低的脂肪酸種類，在催化劑的作用下發(fā)生?；粨Q或者脂肪酸重排,是改善油脂物理性質的有效方法之一。采用酶促酯交換反應具有能耗低、條件溫和、副產物少等優(yōu)點。因此，本實驗以大豆油和單甘酯為原料，在無溶劑體系中利用固定化脂肪酶Novozym 435催化制備甘油二酯，考察了反應溫度、底物摩爾比、反應時間、酶添加量4個因素對甘油二酯含量的影響，并進行了響應面優(yōu)化實驗，旨在為酯交換制備甘油二酯的工業(yè)化生產提供一定的研究基礎和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

一級大豆油，許昌邦迪蛋白有限公司；單甘酯，佳力士添加劑有限公司；無水硫酸鈉，分析純；正己烷，色譜純；固定化脂肪酶Novozym 435，諾維信(中國)生物技術有限公司。

DF-101Z 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，AUY-220 型電子分析天平，S25渦旋儀，Agilent 7890B 氣相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 酯交換制備甘油二酯

稱取一定摩爾比的大豆油與單甘酯于50 mL圓底燒瓶中攪拌加熱，待達到預定溫度后，加入一定量的固定化脂肪酶Novozym 435，反應一定時間后停止加熱。將反應后的混合物離心使酶與粗產品分離，得到的上層油相即為富含甘油二酯的?；视突旌衔铩?/p>

1.2.2 甘油酯組成測定

取100 μL樣品，加入2 mL色譜級正己烷，渦旋混勻溶解后，加入適量無水硫酸鈉，用1 mL注射器吸出溶液，經(jīng)過孔徑0.45 μm 針式過濾器過濾，打入氣相小瓶中備用，待氣相色譜分析。

氣相色譜分析條件: 氫火焰離子化檢測器；DB-1ht 毛細管柱(30 m × 250 μm × 0.1 μm)；升溫程序為柱溫100℃保持0 min，50℃/min 升溫到220℃保持0 min，15℃/min 升溫到290℃保持0 min，40℃/min升溫到320℃保持8 min，20℃/min升溫到360℃保持8 min；進樣口溫度350℃；分流比40∶1；檢測器溫度400℃；高純氮氣流速3.79 mL/min；氫氣流速50 mL/min；空氣流速300 mL/min。各組分含量采用面積歸一化法計算。

1.2.3 脂肪酸組成測定

樣品中脂肪酸采用三氟化硼甲酯化后[11]，進行氣相色譜分析。

氣相色譜分析條件：HP-88毛細管色譜柱(100 m×250 μm×0.2 μm)；載氣為純度99.999%氮氣；柱初溫140℃，保持5 min，4℃/min升溫至240℃，保持20 min；進樣口溫度260℃；柱流量1.0 mL/min；分流比50∶1；進樣量1 μL；檢測器溫度260℃；氫氣流量45 mL/min；空氣流量400 mL/min。

1.2.4 理化指標測定

酸價，按GB 5009.229—2016測定；過氧化值，按GB 5009.227—2016測定；皂化值，按GB/T 5534—2008測定；碘值，按GB/T 5532—2008測定；水分及揮發(fā)物含量，按GB 5009.236—2016測定。

將上述參數(shù)設置之后，將設計的PLC程序重新燒錄到PLC中，將組態(tài)監(jiān)控程序燒錄到觸摸屏中。用MPI電纜將兩設備連接，再次通訊，通訊成功觸摸屏界面數(shù)值顯示窗口的數(shù)據(jù)顯示為“00000”。

2 結果與討論

2.1 原料理化指標及脂肪酸組成

大豆油理化指標見表1，大豆油及單甘酯的脂肪酸組成及含量見表2。

表1 大豆油理化指標

注：“-”表示未檢出。

表2 大豆油和單甘酯脂肪酸組成及含量 %

由表2可知，大豆油以不飽和脂肪酸為主，其中油酸和亞油酸占比接近80%。單甘酯以飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸為主。

2.2 酯交換制備甘油二酯的單因素實驗

2.2.1 反應溫度的影響

在大豆油與單甘酯摩爾比1∶1、酶添加量5%、反應時間8 h條件下，考察反應溫度對甘油二酯含量的影響，結果如圖1所示。由圖1可見，反應溫度從70℃升高到110℃過程中，酰基混合物中各組分的含量基本沒有變化，這可能是因為一定范圍內反應溫度的升高降低了混合物的黏度，提高了底物之間的溶解度和擴散速率，有利于酶與底物的相互作用[12]。此外，由于脂肪酶Novozym 435是固定化酶，通常情況下，酶經(jīng)固定化后熱穩(wěn)定性提高，其活性在較高溫度下得到充分發(fā)揮，在這一溫度范圍內，酶的催化效率較高導致甘油二酯含量較高[13]。當反應溫度達到120℃，甘油一酯和甘油三酯的含量明顯增加，甘油二酯的含量明顯降低。這是因為脂肪酶是具有生物活性的大分子物質，反應溫度超過酶的最適溫度，導致酶變性，酶的催化活性降低甚至失活，不易生成甘油二酯?？紤]到實際生產的能耗，選擇最佳反應溫度為80℃。

圖1 反應溫度對甘油二酯含量的影響

2.2.2 大豆油與單甘酯摩爾比的影響

在反應溫度80℃、酶添加量5%、反應時間8 h條件下，考察大豆油與單甘酯摩爾比對甘油二酯含量的影響，結果如圖2所示。由圖2可見，隨著單甘酯添加量的增多，甘油二酯含量呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，這可能是由于隨著單甘酯的增多，脂肪酶催化合成甘油二酯比較容易，在大豆油與單甘酯摩爾比為1∶1后反應達到動態(tài)平衡。隨著大豆油與單甘酯摩爾比的繼續(xù)增加，甘油二酯含量基本不變，甘油一酯含量逐漸增多，甘油三酯含量逐漸減少，這也與甘油三酯添加量少，甘油一酯添加量越來越多有關。因此，選擇最佳大豆油與單甘酯摩爾比為1∶1。

圖2 大豆油與單甘酯摩爾比對甘油二酯含量的影響

2.2.3 反應時間的影響

在反應溫度80℃、酶添加量5%、大豆油與單甘酯摩爾比1∶1條件下，考察反應時間對甘油二酯含量的影響，結果如圖3所示。由圖3可見，反應時間在2～6 h范圍時，甘油二酯含量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，在2 h時已經(jīng)接近40%，而甘油三酯含量略微下降，甘油一酯和脂肪酸含量隨反應時間的變化較小。這可能是因為脂肪酶在80℃時催化活性高，反應效率高，短時間內大量生成甘油二酯。隨著反應時間的繼續(xù)延長，水解速率與酯化速率平衡，反應體系處于平衡狀態(tài)，各物質含量變化較小[4]。因此，選擇最佳反應時間為6 h。

圖3 反應時間對甘油二酯含量的影響

2.2.4 酶添加量的影響

在反應溫度80℃、大豆油與單甘酯摩爾比1∶1、反應時間6 h條件下，考察酶添加量對甘油二酯含量的影響，結果如圖4所示。由圖4可見，酶添加量從1%增加到5%時，甘油二酯的含量從35%左右增加到50%左右，甘油三酯含量則隨著酶添加量的增加有明顯下降的趨勢，酶添加量為5%時，反應體系處于平衡狀態(tài)。這可能因為酶添加量越多，酶分子活性部位與反應底物接觸程度提高，酶促反應效率高，有利于反應進行。但是繼續(xù)加大酶添加量，甘油二酯的含量變化不大，維持在45%左右，這可能是因為當酶添加量過多時，酶的活性部位過量，有可能導致蛋白的聚集作用而不再與底物接觸[14]。因此，選擇最佳酶添加量為5%。

圖4 酶添加量對甘油二酯含量的影響

2.3 酯交換制備甘油二酯的響應面實驗

2.3.1 實驗方案設計和結果

根據(jù)單因素實驗結果，利用Design-Expert軟件設計響應面實驗，對反應溫度(A)、大豆油與單甘酯摩爾比(B)、反應時間(C)及酶添加量(D)4個因素，分別在3個水平上進行Box-Behnken組合設計，以甘油二酯含量(Y)為評價指標，建立數(shù)學模型，確定酯交換制備甘油二酯的最佳工藝參數(shù)。響應面實驗因素水平見表3，響應面實驗設計及結果見表4。

表3 響應面實驗因素水平

表4 響應面實驗方案設計及結果

2.3.2 回歸方程方差分析

用 Design-Expert軟件對表4的 29 組實驗結果進行回歸擬合，得到二次多元擬合回歸方程：Y=46.93-7.76A+4.03B+6.09C+5.77D+6.46AB+5.79AC+1.07AD-4.94BC-5.19BD-5.33CD-7.33A2-2.95B2-3.36C2-3.99D2。

表5 方差分析

2.3.3 最優(yōu)條件及驗證實驗

利用Design-Expert軟件得到酯交換制備甘油二酯最優(yōu)工藝條件為：大豆油與單甘酯摩爾比1∶2，反應溫度82.9℃，反應時間6.4 h，酶添加量9%。在最優(yōu)條件下，甘油二酯含量的預測值為52.8%。考慮到實際操作的可行性，調整工藝條件為：大豆油與單甘酯摩爾比1∶2，反應溫度83℃，反應時間6.5 h，酶添加量9%。對調整的工藝條件進行驗證實驗，甘油二酯含量的平均值為(51.2±0.2)%。劉尊等[15]利用固定化脂肪酶 Lipozyme TL IM催化單甘酯和棕櫚油(24℃)制備甘油二酯，在反應溫度65℃、反應時間3 h、原料質量比2∶8、催化劑用量5%的條件下，產品中甘油二酯含量為26%。本研究采用的是非專一性固定化脂肪酶Novozym 435，耐熱溫度較高，有利于單甘酯與大豆油充分溶解；反應過程在無溶劑體系下進行，且只加入原料和固定化酶，綠色環(huán)保。此外，酯交換反應后的混合物容易快速結晶，應在高溫下將固定化酶與油相分離。

3 結 論

本研究以一級大豆油和單甘酯為原料，在無溶劑體系下利用固定化脂肪酶Novozym 435催化酯交換制備甘油二酯，系統(tǒng)考察了酶法制備甘油二酯的主要參數(shù)，并基于響應面實驗優(yōu)化工藝條件，建立了良好的數(shù)學模型指導甘油二酯的合成。實驗確定酯交換制備甘油二酯的最優(yōu)條件為：大豆油與單甘酯摩爾比1∶2，酶添加量9%，反應溫度83℃，反應時間6.5 h。在最優(yōu)條件下，甘油二酯含量達(51.2±0.2)%。