ORMDL3調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在疾病中的研究進(jìn)展①

李 佳 李 莉

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心,上海 200080)

2007年Moffatt團(tuán)隊(duì)在Nature雜志上首次發(fā)表了哮喘的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)ORMDL3基因所在的17q21染色體區(qū)與哮喘高度相關(guān)，這是ORMDL3作為哮喘相關(guān)基因的首次報(bào)道，引起世界各國(guó)哮喘研究者高度關(guān)注[1]。后續(xù)十多年研究發(fā)現(xiàn)，除哮喘外，ORMDL3及其所在的17q21染色體區(qū)與炎癥性腸病、腎臟疾病及動(dòng)脈粥樣硬化等炎癥相關(guān)疾病密切相關(guān)[2-5]。功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)ORMDL3主要調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、胞內(nèi)Ca2+平衡、激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)參與自噬、凋亡等過(guò)程[5-7]。但目前功能研究的結(jié)論并不一致。雖然GWAS研究為發(fā)現(xiàn)疾病致病基因提供了良好的平臺(tái)，但隨后的功能研究對(duì)于闡明基因參與疾病的生物學(xué)機(jī)制更為重要。因此，本文對(duì)ORMDL3調(diào)控ERS參與疾病的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ORMDL3概述

ORMDL3基因?qū)儆谶M(jìn)化保守的ORM基因家族，包括小鼠和人的3個(gè)高度同源基因ORMDL 1/2/3，ORMDL3定位于17q21染色體區(qū)，與哮喘高度相關(guān)，而ORMDL1和ORMDL2分別定位于2q32和12q13.2，未見(jiàn)其與哮喘相關(guān)的報(bào)道。配對(duì)比較人和小鼠ORMDL 1/2/3發(fā)現(xiàn)，蛋白結(jié)構(gòu)和氨基酸同源性分別達(dá)95%和80%[8]。

ORMDL3編碼1個(gè)含有153個(gè)氨基酸的4次跨膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，在成人肺和肝臟、腎臟和胰腺等器官中表達(dá)，但在骨骼肌、心臟及大腦中未檢測(cè)到ORMDL3 mRNA表達(dá)[8]。ORMDL3目前在過(guò)敏性哮喘中研究最多，在參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞中表達(dá)尤其高，在小鼠和人氣道上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，在T細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞中高表達(dá)，而中性粒細(xì)胞表達(dá)ORMDL2而非ORMDL3[9-11]。

目前ORMDL3蛋白的功能尚不明確。近年研究表明，人ORMDL3轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出的自發(fā)性氣道重塑、纖維化、黏液合成、炎癥和氣道高反應(yīng)性證實(shí)ORMDL3為致病因素[12]。目前ORMDL3在疾病中的功能及機(jī)制研究尚處于起步階段，綜合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，ORMDL3通過(guò)抑制肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶(sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCAs)活性參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的Ca2+平衡，并激活ERS[2,5,6,13,14]。此通路是ORMDL3參與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，但其在各種疾病中的作用的研究結(jié)果并不一致。

2 ORMDL3調(diào)控ERS

2.1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及SERCAs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜系統(tǒng)是細(xì)胞加工蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及貯存Ca2+的主要場(chǎng)所。對(duì)于大多數(shù)分泌和跨膜蛋白來(lái)說(shuō),新翻譯的未經(jīng)折疊的蛋白經(jīng)過(guò)富有Ca2+與折疊酶環(huán)境的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行初步加工，形成穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)是分泌途徑的第一步。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為受調(diào)控的Ca2+存儲(chǔ)庫(kù)，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)的產(chǎn)生至關(guān)重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上存在Ca2+釋放通道(如肌醇三磷酸受體和蘭尼堿受體)控制Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)也存在鈣泵(如SERCAs)使Ca2+返回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。因此，SERCAs活性決定了細(xì)胞內(nèi)Ca2+的動(dòng)向，影響Ca2+信號(hào)形成，有助于維持較低的胞內(nèi)Ca2+水平。SERCAs還可通過(guò)調(diào)節(jié)用于下一個(gè)刺激應(yīng)答可釋放的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+水平影響Ca2+依賴的細(xì)胞反應(yīng)[15,16]。SERCAs在Ca2+穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，多種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+失調(diào)相關(guān)的疾病與SERCAs功能失調(diào)相關(guān)，如哮喘和阿爾茨海默病[17,18]。

2.2ORMDL3通過(guò)SERCAs調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)激活ERS 在HEK293細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染GFP和ORMDL3，通過(guò)卡巴膽堿刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ORMDL3的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+水平較低，且SERCAs活性較低，胞漿Ca2+清除率下降，免疫染色和免疫共沉淀研究表明，ORMDL3與SERCAs共定位并抑制其功能，致使胞漿Ca2+升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+降低，Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡進(jìn)而激活ERS[6]。此結(jié)果為ORMDL3與SERCAs直接作用調(diào)節(jié)SERCAs活性提供了確鑿證據(jù)。

ERS是重要的細(xì)胞自我防御機(jī)制，在缺氧、藥物、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，大量錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，促使其啟動(dòng)應(yīng)急機(jī)制，此過(guò)程稱為ERS，經(jīng)典應(yīng)急通路即為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。過(guò)表達(dá)ORMDL3的人氣道上皮細(xì)胞研究表明，ORMDL3選擇性激活UPR的活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)通路[13]。Haze等[19]證實(shí)ORMDL3表達(dá)提高可激活UPR信號(hào)通路基因，而siRNA介導(dǎo)的ORMDL3表達(dá)下調(diào)可減弱UPR。此外，ORMDL3表達(dá)提高導(dǎo)致ERS/UPR轉(zhuǎn)導(dǎo)分子eIF2α磷酸化和免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP) mRNA水平升高，提示ORMDL3通過(guò)激活ERS，活化UPR通路。

2.3UPR專屬通路觸發(fā)細(xì)胞自噬 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上存在3種ERS受體：RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(RNA-dependent protein kinase (PKR)-like ER kinase,PERK)、肌醇依賴酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)及活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。靜息狀態(tài)下，3種受體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含量豐富的分子伴侶GRP78/BiP結(jié)合而處于無(wú)活性狀態(tài)。一旦發(fā)生ERS并啟動(dòng)UPR，GRP78/BiP 便與上述3種受體解離,轉(zhuǎn)而結(jié)合新生的未折疊蛋白，解離的膜受體繼而活化專屬激活通路：PERK-eIF2α通路、IREl-XBP1s通路及ATF6 通路。上述3條UPR專屬通路均可觸發(fā)細(xì)胞自噬，清除錯(cuò)誤折疊蛋白、蛋白聚集物及受損細(xì)胞器，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力[3,20]。

2016年大隅良典因發(fā)現(xiàn)“細(xì)胞自噬機(jī)制”獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。自噬是細(xì)胞層面的回收再利用，從形成吞噬體開始級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終降解并回收細(xì)胞成分，完成進(jìn)化保守的物質(zhì)周轉(zhuǎn)過(guò)程，對(duì)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)維持和存活具有重要意義[21,22]。多種常見(jiàn)疾病，包括癌癥、感染、退行性疾病和自身免疫性疾病中自噬均具有重要作用。炎癥、ERS、血脂異常等刺激因素均可引起自噬，而ORMDL3在上述誘因中均發(fā)揮作用，因此ORMDL3可能為自噬相關(guān)基因。

Yang等[23]通過(guò)向擬南芥幼苗液體培養(yǎng)基中加入化學(xué)物PBA(4-苯基丁酸鈉)或TUDCA(牛磺脫氧膽酸)或過(guò)表達(dá)BiP蛋白，可減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白積累，從而抑制自噬。加入未折疊蛋白芐星青霉素或羧肽酶CPY*則可激活UPR和細(xì)胞自噬[23]。炎癥性腸病的研究顯示，具有高分泌特征的潘氏細(xì)胞自噬活性顯著增強(qiáng)可平衡高水平的ERS[4]。人內(nèi)皮細(xì)胞株中進(jìn)行的研究表明，敲除ORMDL3不僅能明顯減輕氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的自噬，且能明顯減輕基礎(chǔ)和血清饑餓誘導(dǎo)的自噬[2]。因此，ERS可活化UPR專屬通路，觸發(fā)細(xì)胞自噬。

3 ORMDL3調(diào)控的ERS在疾病中的作用

3.1過(guò)敏性哮喘 ORMDL3被確認(rèn)為哮喘相關(guān)基因已十余年，各研究團(tuán)隊(duì)在各類哮喘相關(guān)細(xì)胞中開展功能研究，但目前尚未定論。Miller等[24]研究ORMDL3在氣道上皮細(xì)胞中的作用，發(fā)現(xiàn)體外過(guò)表達(dá)ORMDL3可活化UPR ATF6途徑，并誘導(dǎo)哮喘相關(guān)基因表達(dá)，過(guò)表達(dá)ORMDL3的THP-1人單核細(xì)胞可激活UPR ATF6途徑；相反，Cantero-Recasens等[6]報(bào)道ORMDL3過(guò)表達(dá)激活PERK通路，但不影響UPR的IRE1通路；而Hsu等[24]研究顯示，ORMDL3表達(dá)水平變化不影響NF-κB誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8，通過(guò)siRNA沉默ORMDL3對(duì)UPR并無(wú)影響。以上結(jié)果不一致原因可能為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系不同，目前對(duì)UPR的3條通路雖然研究透徹，但3條通路在不同的細(xì)胞中分布不同，UPR反應(yīng)中同一信號(hào)分子在ERS的不同時(shí)段發(fā)揮的效應(yīng)不同，增加了ERS 研究的復(fù)雜性。

3.2炎癥性腸病 腸上皮細(xì)胞具有高度分泌性，ERS/UPR在其分泌功能中發(fā)揮重要作用。炎癥性腸病(IBD)患者的腸上皮細(xì)胞通常表現(xiàn)出明顯的ERS，表明腸黏膜應(yīng)激相關(guān)炎癥可能既是炎癥的主要來(lái)源，也是其延續(xù)的主要原因。目前，GWAS和Meta分析已確定了140多個(gè)與IBD相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，主要與IBD發(fā)病過(guò)程中的3條途徑相關(guān)：微生物識(shí)別、自噬和ERS,Hoefkens等[25]將ORMDL3劃分為ERS相關(guān)基因。

在腸上皮細(xì)胞XBP1缺失的小鼠(XBP1ΔIECmice)中，ERS及細(xì)胞凋亡水平升高，杯狀細(xì)胞及潘氏細(xì)胞數(shù)量下降，導(dǎo)致宿主防御肽合成減少，對(duì)李斯特菌易感性增強(qiáng)。XBP1也被證實(shí)可抑制實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)的癌癥，在TLR介導(dǎo)的促炎反應(yīng)中必不可少[26]。PERK-eIF2α和ATF6通路也與腸炎癥相關(guān)，表達(dá)非磷酸化eIF2α的小鼠模型可導(dǎo)致潘氏細(xì)胞功能異常，增強(qiáng)沙門氏菌感染和DSS所致結(jié)腸炎的易感性。ATF6α缺陷小鼠表現(xiàn)出ERS增強(qiáng)(BiP、ATF4、CHOP和XBP1水平升高)，從而增強(qiáng)了對(duì)DSS所致結(jié)腸炎的敏感性[27,28]?？傊?，ERS/UPR途徑在維持腸道穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，其破壞與IBD中持續(xù)的腸道感染、慢性炎癥和免疫反應(yīng)失調(diào)相關(guān)。因此，以調(diào)節(jié)該途徑為靶點(diǎn)的治療策略可能是IBD治療的突破點(diǎn)。

3.3動(dòng)脈粥樣硬化 脂質(zhì)引起的慢性炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而ORMDL3在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、炎癥反應(yīng)、ERS和UPR中起重要調(diào)節(jié)作用，研究表明哮喘預(yù)示著更高的冠狀動(dòng)脈疾病風(fēng)險(xiǎn)。因此，慢性炎癥性疾病間具有遺傳重疊的可能性，且有必要探索ORMDL3參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制。

Liu的團(tuán)隊(duì)一直致力于ORMDL3的功能學(xué)研究，分別在中國(guó)北方和南方人群中首次證實(shí)了ORMDL3基因上2個(gè)高度連鎖不平衡的SNP位點(diǎn)(rs7216389和rs9303277)與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性，且在北方人群中證實(shí)攜帶這2個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因的患者ORMDL3 mRNA表達(dá)水平顯著升高，功能學(xué)研究表明，在內(nèi)皮細(xì)胞中，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)上調(diào)ORMDL3表達(dá)，體外敲除ORMDL3不僅能明顯減輕ox-LDL誘導(dǎo)的自噬，且能明顯減輕基礎(chǔ)和血清饑餓誘導(dǎo)的自噬[2]。然而，目前ORMDL3通過(guò)哪些途徑及重要的信號(hào)通路或分子調(diào)節(jié)自噬尚未闡明。

3.4腎臟疾病 近10～15年研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能對(duì)腎臟中的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，而ERS是各種腎臟疾病的組成部分，如原發(fā)性腎小球腎炎、繼發(fā)于基因突變的腎小球疾病、糖尿病腎病、急性腎損傷、慢性腎病和腎纖維化。膜性腎病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕系难芯孔C實(shí)，UPR被激活，LC3-Ⅱ水平升高[29]。糖尿病腎病小鼠腎皮質(zhì)中CHOP和活化ATF6水平升高，sXBP1進(jìn)入細(xì)胞核導(dǎo)致易位受損[30]。急性腎損傷中，缺血再灌注可引起腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白積累，從而激活UPR，UPR保護(hù)缺血再灌注損傷，改善腎功能不全和損傷[31]。慢性腎病中，4-PBA處理可降低TGF-β介導(dǎo)的ERS，促纖維化因子和凋亡標(biāo)記物增加，減輕ERS，減少腎小管細(xì)胞凋亡和纖維化[3]。ERS/UPR在維持腎臟蛋白質(zhì)平衡中發(fā)揮重要作用，使用藥物維持ERS正常是在預(yù)防或阻止腎臟疾病進(jìn)展的重要方向。

4 總結(jié)

盡管ORMDL3在調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+平衡、激活ERS/UPR、參與自噬、脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)等功能研究中取得了一定進(jìn)展，但該基因在疾病中的具體作用機(jī)制尚未闡明。目前，關(guān)于ORMDL3的研究多數(shù)局限于哮喘，其在其他炎癥性疾病的詳細(xì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步研究。ORMDL3調(diào)控的ERS相關(guān)炎癥作用途徑不僅加深了本課題組對(duì)疾病致病機(jī)理的理解，也為發(fā)展新的治療方法提供了參考。