結(jié)核分枝桿菌異煙肼和丙硫異煙胺耐藥及其交叉耐藥相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展

王曉英，張匯征，羅 明,曾婉婷

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis，MTB)感染引起的慢性傳染病，是由單一致病菌引起的死亡人數(shù)最多的疾病[1]。我國(guó)結(jié)核病疫情嚴(yán)重，僅次于印度，居世界第2位。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Healthy Orgnization，WHO)估算，2018年全球新發(fā)結(jié)核病患者數(shù)為1 000萬(wàn)，耐多藥(Multi-Drug Resistant，MDR)結(jié)核病患者數(shù)為48.4萬(wàn)[2]。MDR患者化療療程約為20個(gè)月或更長(zhǎng)，但治療效果卻不理想，治療成功率僅為54%，病死率達(dá)16%。2010年全國(guó)第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)結(jié)核病患者對(duì)異煙肼(isoniazid, INH)的總耐藥率最高，達(dá)28.6%，對(duì)二線抗結(jié)核藥物丙硫異煙胺(prothionamide, Pto)的總耐藥率達(dá)12.9%，總耐藥順位分別排第1位和第4位；其中，初治肺結(jié)核患者INH與Pto的耐藥率分別為第1位和第4位，復(fù)治肺結(jié)核患者INH與Pto的耐藥率分別為第1位和第5位[3]。由此可見(jiàn)，我國(guó)INH與Pto的耐藥情況已經(jīng)非常嚴(yán)峻?？焖贉?zhǔn)確的預(yù)測(cè)結(jié)核病患者對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥性，有助于患者及時(shí)有效的治療。結(jié)核病耐藥的快速檢測(cè)依賴(lài)于對(duì)耐藥機(jī)制的研究，因此，充分了解INH和Pto交叉耐藥的相關(guān)機(jī)制，有助于對(duì)這兩種藥物耐藥性的精確檢測(cè)和其臨床上的合理使用。

1 異煙肼及丙硫異煙胺作用機(jī)理

1.1異煙肼作用機(jī)理 INH是目前使用的重要一線抗結(jié)核藥物，是一種需要經(jīng)過(guò)氧化反應(yīng)才能變得有活性的前體藥物。INH作用于MTB細(xì)胞壁分枝菌酸的合成，它通過(guò)抑制參與MTB細(xì)胞壁生物合成的烯?；d體蛋白還原酶inhA而達(dá)到殺菌的功效[4]。INH易滲入吞噬細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞內(nèi)外的MTB均有殺菌作用，故稱(chēng)“全效殺菌藥”[5]。

1.2丙硫異煙胺作用機(jī)理 MTB對(duì)INH耐藥后，臨床上通常用Pto來(lái)代替INH組成治療方案[5]。Pto屬于口服抑菌二線抗結(jié)核藥物，也是一種前體藥物，被廣泛用于耐多藥結(jié)核病、敏感菌導(dǎo)致的結(jié)核性腦膜炎及粟粒性結(jié)核等多種結(jié)核病的治療中[6-7], 也適用于非結(jié)核分枝桿菌病的治療[5]。Pto與乙硫異煙胺(Ethionamide, Eto)均屬硫胺類(lèi)藥物，為異煙酸的衍生物，可通過(guò)抑制MTB分枝菌酸的合成并擾亂MTB細(xì)胞膜的合成而發(fā)揮抗結(jié)核功效[5,7-8]。

2 異煙肼和丙硫異煙胺交叉耐藥機(jī)制

Pto與Eto顯示出高度的交叉耐藥性，因此，Eto耐藥相關(guān)基因突變成為研究Pto耐藥機(jī)制的主要依據(jù)。Pto、Eto與INH的作用相似，存在部分的交叉耐藥性[9]。

2.1inhA基因 INH和Pto均屬于前體藥物，需要不同的酶進(jìn)行活化后才能發(fā)揮作用，但兩種藥物有共同的作用靶點(diǎn)：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD),NADH依賴(lài)的烯酰基乙酰載體蛋白還原酶，涉及到分枝菌酸合成的inhA[10-11]。inhA基因編碼分枝桿菌脂肪酸合成酶II系統(tǒng)中的一種烯酰基乙酰載體蛋白還原酶，激活的INH共價(jià)結(jié)合到NAD上形成加合物而附著到inhA上[12]。因此，inhA基因或/和inhA啟動(dòng)子區(qū)域基因突變可導(dǎo)致inhA基因編碼產(chǎn)物的過(guò)表達(dá)或者修飾，降低了inhA酶與NADH的親和力，從而造成INH與Pto的交叉耐藥[13-15]。研究表明，在INH與Pto同時(shí)耐藥的菌株中，33.5%的菌株存在INH與Pto交叉耐藥的情況，由inhA和/或其啟動(dòng)子區(qū)域的單一突變或者兩者同時(shí)突變導(dǎo)致；交叉耐藥菌株中，最常見(jiàn)的突變?yōu)閕nhA啟動(dòng)子區(qū)域-C15T突變，占26%。但在INH耐藥Pto敏感或INH敏感Pto耐藥菌株中，存在3例inhA啟動(dòng)子-C15T突變的情況，可能與其他調(diào)整因子的代償突變有關(guān)[16]。

目前關(guān)于INH與Pto交叉耐藥的研究較少，多是關(guān)于INH與Eto交叉耐藥情況的研究。一項(xiàng)關(guān)于INH與Eto交叉耐藥的研究表明，94%的MDR菌株在inhA啟動(dòng)子區(qū)域存在突變，突變類(lèi)型為-C15T[17]。而另一項(xiàng)關(guān)于INH與Eto交叉耐藥的研究表明，33.3%Eto耐藥的MDR菌株中存在inhA啟動(dòng)子區(qū)域或inhA基因突變，在66.6%的交叉耐藥菌株中可見(jiàn)inhA啟動(dòng)子區(qū)域-C15T突變[18]。而南非東開(kāi)普省的研究表明，inhA啟動(dòng)子區(qū)域-C17T突變?cè)赬DR-TB菌株中是主要的突變類(lèi)型，達(dá)到83%[19]。inhA基因編碼區(qū)域突變比較少見(jiàn)，目前研究表明，在INH和Eto交叉耐藥菌株中，inhA基因編碼區(qū)域氨基酸突變位點(diǎn)僅有I21T, S94A和I95P[20-21]。但inhA基因突變及其啟動(dòng)子區(qū)域突變導(dǎo)致的交叉耐藥在不同地區(qū)的差異很大，從12%到100%不等[20, 22-26]。

2.2ndh基因ndh基因編碼NADH脫氫酶，其在恥垢分枝桿菌的研究中首次被認(rèn)為與INH的耐藥機(jī)制有關(guān)。研究表明，ndh基因編碼的NADH脫氫酶對(duì)于恥垢分枝桿菌的存活至關(guān)重要，而NADH脫氫酶通過(guò)將NADH氧化成NAD+而提高INH的活性[27]。隨后的研究表明，ndh基因突變只出現(xiàn)在INH耐藥的MTB菌株中，說(shuō)明ndh基因突變與MTB對(duì)INH耐藥有關(guān)。ndh基因突變降低了NADH氧化成NAD+的速率，從而導(dǎo)致了NADH的累積以及NAD的缺乏[28]，增加的NADH水平可能競(jìng)爭(zhēng)性的抑制了INH-NAD加合物附著到inhA酶的活性位點(diǎn)[29-30]，從而破壞了酶活性的調(diào)整并可能引起INH和Pto的交叉耐藥[31]。也可能因?yàn)镹ADH是過(guò)氧化物酶AhpCF和KatG的底物，NADH濃度的增加可能競(jìng)爭(zhēng)性抑制KatG對(duì)INH的過(guò)氧化作用[27]。Miesel等人的研究也表明增加的NADH濃度阻止了INH和Eto的作用從而導(dǎo)致高水平耐藥[27]。

在恥垢分枝桿菌和牛分枝桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ndh基因突變可導(dǎo)致INH與Eto交叉耐藥[32]。來(lái)自新加坡和巴西的研究也表明ndh突變(R13C、T110A和R268H)發(fā)生在8%～10%的異煙肼耐藥菌株中，但并不存在于INH敏感的菌株中[28,33]。但其他相關(guān)研究表明，ndh突變?cè)贗NH耐藥和敏感菌株中均存在[20]。最新的關(guān)于結(jié)核分枝桿菌INH和Pto交叉耐藥的研究中，僅在ndh基因中新發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非同義突變(G339A)，且其僅與INH耐藥相關(guān)[16]。因此，目前ndh突變與INH和Pto交叉耐藥的相關(guān)性并不是很明確，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

2.3fabG1-inhA基因fabG1基因(又稱(chēng)為mabA)g609a突變首先被發(fā)現(xiàn)與INH耐藥相關(guān)[34]。fabG1基因沉默突變導(dǎo)致INH和ETH耐藥。fabG1基因g609a突變及與它臨近的區(qū)域扮演了inhA基因啟動(dòng)子的作用，增強(qiáng)inhA的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致inhA的過(guò)表達(dá)，降低了inhA酶與NADH的親和力，從而導(dǎo)致INH和ETH的交叉耐藥。fabG1基因g609a突變也可能通過(guò)增加轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性和改變RNase在mabA-inhA mRNA中的裂解位點(diǎn)來(lái)影響inhA轉(zhuǎn)錄的水平，最終導(dǎo)致INH和ETH的交叉耐藥[35]。fabG1基因突變已被用于預(yù)測(cè)MTB對(duì)INH耐藥的檢測(cè)中[36]，但目前MTB對(duì)Pto耐藥及INH與Pto交叉耐藥相關(guān)研究中并未對(duì)fabG1基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)[16,37]。因此，fabG1基因突變是否與INH和Pto的交叉耐藥相關(guān)以及其相關(guān)的耐藥機(jī)制，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3 異煙肼耐藥的其它機(jī)制

除與Pto交叉耐藥的相關(guān)機(jī)制外，導(dǎo)致MTB對(duì)INH耐藥的主要分子機(jī)制主要與katG、ahpC、kasA和oxyR等基因突變有關(guān)。katG基因突變導(dǎo)致過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶的形成受阻，不能活化INH為具有殺菌作用的異煙酸，從而導(dǎo)致MTB對(duì)INH耐藥[38-39]。最常見(jiàn)的KatG突變?yōu)镾315T突變，94%的INH耐藥菌株與S315T突變相關(guān)[40]。各個(gè)地區(qū)INH耐藥菌株中因katG基因突變而導(dǎo)致的耐藥比率差異很大，從31.8%～96.9%不等[41]。ahpC基因在INH耐藥中起著重要的作用。由ahpC基因編碼的AhpC酶(alkyl hydro peroxidase)引起過(guò)氧化氫底物的減少，ahpC基因啟動(dòng)子區(qū)域的突變能夠增強(qiáng)ahpC蛋白的表達(dá)，從而代償性抵抗KatG/CP活性的丟失[42]。oxyR是一種氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)蛋白，控制著編碼解毒酶基因觸酶-過(guò)氧化物酶(katG編碼)和烷基氫過(guò)氧化物酶(ahpC編碼)的表達(dá)[43]。29%的INH耐藥臨床株在oxyR-ahpC基因間隔區(qū)存在突變[43]，oxyR-ahpC基因間隔區(qū)突變，例如-G9A和-C15T可分別增加ahpC的表達(dá)達(dá)9倍和18倍[42]。但oxyR-ahpC基因間隔區(qū)突變是否與INH耐藥相關(guān)目前還存在爭(zhēng)議[44]。kasA基因編碼的KasA(β-酮脂?；］d體蛋白合成酶) 能促進(jìn)分枝菌酸的生物合成[25]，但kasA基因突變?cè)贗NH耐藥中的作用并不是很清楚[34,45-46]。因此，INH耐藥菌株相關(guān)基因(如ahpC、kasA和oxyR)突變的具體位點(diǎn)及其與INH臨床耐藥的確切關(guān)系還不是很明確，需要進(jìn)行更深入的研究。

4 丙硫異煙胺耐藥的其它機(jī)制

除與INH交叉耐藥的機(jī)制外，Pto耐藥主要與ethA、ethR和mshA等基因突變有關(guān)。ethA基因可編碼加單氧酶ethA，Pto經(jīng)加單氧酶ethA激活后與NAD+反應(yīng)，產(chǎn)生 Pto-NAD加合物，從而抑制inhA基因及分枝菌酸的合成[47-50]。Brossier等的研究結(jié)果表明，47%的Eto耐藥菌株存在ethA基因突變(F110L和 A95T突變)[31]。多項(xiàng)研究表明，ethA基因的非同義突變和框架突變可導(dǎo)致Pto/Eto耐藥，所占比例從37%到100%不等[15,25,37,51]。另外，Islam等的研究發(fā)現(xiàn)了ethA基因上29個(gè)新的非同義突變和3個(gè)截?cái)嗤蛔兣cPto的耐藥相關(guān)[16]。ethR是TetR/CamR家族的一員,可抑制ethA基因的表達(dá)[52]。抑制ethR基因的功能將導(dǎo)致MTB對(duì)Pto的敏感性提高，而ethR基因突變則會(huì)導(dǎo)致Pto耐藥[49]。ethR基因突變(F110L和 A95T)與Eto耐藥相關(guān)，約占Eto耐藥菌株的4%[31]。ethR基因上兩個(gè)新的非同義突變 (R216C和V152M)和一個(gè)同義突變也被證實(shí)與Pto耐藥相關(guān)[16]。mshA屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族，涉及到MTB分枝硫醇的生物合成[11]，mshA基因突變可能與Pto/Eto的激活被破壞有關(guān)[11,15,31]，但mshA基因突變與Pto/Eto耐藥的相關(guān)性并不是很明確，有待進(jìn)一步的研究。目前，MTB對(duì)Pto耐藥的相關(guān)機(jī)制研究較少，多基于對(duì)Eto耐藥機(jī)制的研究，相關(guān)基因突變的具體位點(diǎn)及其與臨床耐藥的相關(guān)性仍需要進(jìn)行更深入的研究。

5 展 望

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，INH的耐藥機(jī)制也越來(lái)越明確，但目前MTB對(duì)Pto耐藥相關(guān)突變基因以及突變位點(diǎn)的分析仍然非常有限，還存在未知的基因突變。已有研究表明，20.2%的Pto耐藥菌株中未發(fā)現(xiàn)已知的基因突變[16]，在未知的耐藥基因突變中也有可能存在與INH交叉耐藥相關(guān)的機(jī)制。另外，MTB因受各種因素的影響，其遺傳特點(diǎn)多存在顯著的地域差異。目前，我國(guó)INH和Pto耐藥情況已經(jīng)比較嚴(yán)峻，尤其是兩者之間存在著交叉耐藥的情況。對(duì)于INH和Pto交叉耐藥機(jī)制的研究也十分有限，需要進(jìn)行更加深入的研究以探索其作用的新機(jī)制。對(duì)INH與Pto交叉耐藥機(jī)制的研究可為結(jié)核病相關(guān)耐藥基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供參考，為耐藥結(jié)核病的診斷及臨床醫(yī)生的合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無(wú)。