瓜氨酸化蛋白及其短肽誘導性RA動物模型研究進展①

朱興旺 宣亞男 萬麗娟 趙曉峰 趙文婷 陳恩生 肖長虹

(南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣州 510315)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)實驗動物模型研究是深入探討人類RA疾病發(fā)生發(fā)展機制的最有效途徑之一。目前廣泛應用于RA研究的比較成熟的動物模型如佐劑誘導性關(guān)節(jié)炎(ardjuvant induced arthritis，AIA)模型、膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)模型多為自限性，缺乏人類RA慢性侵蝕性特點，其血清中很少檢測到類風濕因子(rheumatoid factor，RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide,CCP)等RA特異性自身抗體；而且同一種模型由于誘導劑乳化方法、注射劑量、注射部位的不同也表現(xiàn)出不盡相同的關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。因此，上述RA動物模型并不能完全反映人類RA在關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)、免疫學、病理學等方面的特點，更無法闡明人類RA免疫炎癥反應的啟動和維持過程中的機制，制約RA研究的進一步發(fā)展。而目前有研究認為瓜氨酸化蛋白能充當啟動RA免疫炎癥反應的靶抗原，抗瓜氨酸免疫反應能誘導關(guān)節(jié)炎[1]；產(chǎn)生的抗瓜氨酸化蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibody，ACPAs)能直接或間接介導軟骨侵蝕、骨質(zhì)破壞[2]，在RA的炎癥反應和軟骨侵蝕、骨質(zhì)破壞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為進一步揭示瓜氨酸化蛋白、ACPAs的致病機制及獲得一種更符合人類RA發(fā)病特點的動物模型，近年來國內(nèi)外學者展開了以瓜氨酸化蛋白或其短肽作為抗原誘導劑建立RA動物模型的探索，現(xiàn)已可見幾種瓜氨酸化蛋白誘導性關(guān)節(jié)炎模型的報道。本文就瓜氨酸化蛋白及其短肽誘導性RA模型進行綜述如下。

1 瓜氨酸化蛋白誘導性RA模型

這些模型普遍的造模方法是在瓜氨酸化緩沖液中，體外通過肽?；彼崦搧啺访?peptidyl arginine deiminase，PADs)催化蛋白發(fā)生瓜氨酸化后獲取瓜氨酸化蛋白，再對大鼠或小鼠進行免疫。概括起來有以下3種類型：

1.1瓜氨酸化Ⅱ型膠原蛋白誘導性關(guān)節(jié)炎大鼠模型 2005年瑞典學者Lundberg等[3]在他的研究中建立了首個瓜氨酸化蛋白誘導性關(guān)節(jié)炎模型。他在體外37℃條件下，以2U PADs催化1 mg兔源Ⅱ型膠原蛋白獲得瓜氨酸化Ⅱ型膠原作為抗原誘導劑，然后將瓜氨酸化Ⅱ型膠原與等容量弗氏佐劑進行乳化，再將含120 μg瓜氨酸化Ⅱ型膠原的乳化液對9～14周齡的雌性Lew.1AV1大鼠尾根部進行注射免疫。該模型關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率約為80%，發(fā)病時間出現(xiàn)在免疫后第13天，相比對照組發(fā)病率更高，關(guān)節(jié)炎發(fā)生更早。Lew.1AV1大鼠自第13天發(fā)病后關(guān)節(jié)炎逐漸加重，至免疫后第28天其關(guān)節(jié)炎指數(shù)可達14分，持續(xù)至第38天仍保持較高的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分；并且發(fā)病大鼠關(guān)節(jié)病理存在滑膜細胞增生及軟骨降解等組織學改變。但是，研究中并未詳細交代關(guān)節(jié)炎大鼠受累的關(guān)節(jié)數(shù)目、部位和關(guān)節(jié)變形等情況，在組織學上也未詳細描述其滑膜增生程度、炎細胞浸潤程度、骨侵蝕等病理改變。這可能與該研究的側(cè)重點不在于評價關(guān)節(jié)炎模型特點，而在于明確關(guān)節(jié)炎大鼠血清中抗CCP抗體等ACPAs的存在以及免疫前后關(guān)節(jié)軟骨、細胞上是否存在瓜氨酸化蛋白沉積以及對關(guān)節(jié)炎發(fā)病、嚴重程度的影響。該研究最終證實瓜氨酸化蛋白具有更強的免疫原性和致關(guān)節(jié)炎性，它們在關(guān)節(jié)中的沉積與關(guān)節(jié)炎的嚴重程度呈正相關(guān)。

1.2以轉(zhuǎn)基因小鼠建立的關(guān)節(jié)炎模型 第2種類型的瓜氨酸化蛋白誘導性關(guān)節(jié)炎模型則是選擇HLA-DRB1*0401(HLA-DR4 IE)轉(zhuǎn)基因小鼠作為造模載體，以此克服人類RA疾病遺傳易感因素。在瓜氨酸化蛋白的獲取上，與2005年Lew.1AV1大鼠關(guān)節(jié)炎模型瓜氨酸化Ⅱ型膠原相似，同樣是在體外37℃的瓜氨酸化緩沖液中，通過PADs催化原型蛋白獲得，其差別在于PADs與蛋白催化反應的用量、時間有所不同。而其造模方法與傳統(tǒng)的CIA模型基本相同，即首次免疫以含等容量完全弗氏佐劑的瓜氨酸化蛋白乳化液在小鼠的大腿、腹部內(nèi)側(cè)或尾根部皮下注射，加強免疫則在首次免疫后的第21天以含等容量的不完全弗氏佐劑的瓜氨酸化蛋白乳化液皮下注射。那么，第1個小鼠模型是2008年Hill等[4]建立的瓜氨酸化纖維蛋白原誘導性HLA-DR4 IE轉(zhuǎn)基因小鼠關(guān)節(jié)炎模型。該模型的發(fā)病率較低，為35.5%，受累關(guān)節(jié)主要在后足踝關(guān)節(jié)，僅有1只小鼠在前足出現(xiàn)一個趾炎。其關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)為一個漸進的慢性發(fā)病過程：首次免疫的第3周小鼠踝關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)輕度腫脹，持續(xù)加重伴明顯發(fā)紅，至第10周關(guān)節(jié)紅腫達高峰，隨后逐漸消退，150 d觀察到關(guān)節(jié)強直，部分小鼠于免疫后200 d仍有關(guān)節(jié)腫脹。免疫學分析顯示關(guān)節(jié)炎小鼠具有瓜氨酸化蛋白特異性T淋巴細胞增殖反應以及釋放大量的IFN-γ、IL-10等炎癥細胞因子，產(chǎn)生針對瓜氨酸化蛋白的特異性IgG抗體，揭示其免疫病理是以Th1細胞為主導，B淋巴細胞參與的免疫應答過程。組織學表現(xiàn)為早期以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤、滑膜細胞增生、血管翳形成以及隨后出現(xiàn)的軟骨、骨質(zhì)侵蝕，后期則出現(xiàn)滑膜組織纖維化。接著，2011年Kinloch[5]在探討人類α烯醇酶和牙齦卟啉單胞菌烯醇酶致關(guān)節(jié)炎研究中建立人和牙齦卟啉單胞菌瓜氨酸化α烯醇酶誘導性DR4-IE轉(zhuǎn)基因小鼠模型。這兩個模型特點相似，發(fā)病率分別為75%和100%(人9/12，牙齦卟啉單胞菌6/6),均具有快速致關(guān)節(jié)炎的特點，即首次免疫后2～3 d小鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫，緩慢加重至第24天達高峰，此時盡管踝關(guān)節(jié)發(fā)紅消退但腫脹依然存在；血清產(chǎn)生針對瓜氨酸化α烯醇酶的特異性ACPAs;而實驗中作為對照的MHCⅡ基因缺失的C57BL/6小鼠和野生型C57BL/6小鼠均無關(guān)節(jié)炎發(fā)生，血清中也沒有產(chǎn)生ACPAs，揭示RA遺傳易感基因在該關(guān)節(jié)炎模型發(fā)病中的重要意義。進一步的關(guān)節(jié)病理學顯示該模型踝關(guān)節(jié)甚至在部分跗骨關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯滑膜增生、軟骨侵蝕和骨質(zhì)破壞，但是缺乏明顯的中性粒細胞浸潤，這與瓜氨酸化纖維蛋白原誘導性轉(zhuǎn)基因小鼠模型的組織學表現(xiàn)相似。

1.3不含佐劑的瓜氨酸化Ⅱ型膠原誘導性關(guān)節(jié)炎模型 2012年Thiele[6]以無佐劑的瓜氨酸化鼠Ⅱ型膠原免疫DBA/1j小鼠誘導出關(guān)節(jié)炎模型。其造模方法與先前的瓜氨酸化蛋白誘導性關(guān)節(jié)炎模型最大的區(qū)別在于作為誘導劑的瓜氨酸化Ⅱ型膠原不與佐劑進行乳化，而直接對小鼠進行免疫注射，并且采用每周1次注射，連續(xù)4周的誘導方式。眾所周知，弗氏佐劑本身可誘導佐劑性關(guān)節(jié)炎，而采用不含佐劑的瓜氨酸化蛋白進行免疫誘導可排除佐劑對關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的干擾，進一步確定瓜氨酸化Ⅱ型膠原的致病作用。此外，采用同源的瓜氨酸化鼠Ⅱ型膠原作為抗原誘導劑，同樣表明瓜氨酸化蛋白具有更強的免疫原性和致關(guān)節(jié)炎性。這對確立瓜氨酸化蛋白可能作為關(guān)節(jié)炎的啟動抗原提供更好的依據(jù)。

該DBA/1j小鼠模型的發(fā)病率為100%，關(guān)節(jié)炎累及四肢關(guān)節(jié)，但以后足關(guān)節(jié)為主且較嚴重。典型的關(guān)節(jié)炎體征在首次免疫后3周出現(xiàn)，第5周紅腫達高峰，第6周逐漸消退。病理學見關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜增生、炎癥細胞浸潤、軟骨與骨質(zhì)侵蝕。影像學顯示受累關(guān)節(jié)軟骨與骨質(zhì)侵蝕、骨量丟失、骨破壞等征象。免疫學分析顯示瓜氨酸化Ⅱ型膠原特異性的T淋巴細胞明顯增殖，并釋放IL-6、IL-23等炎癥細胞因子，分泌ACPAs且以抗CCP抗體明顯升高為特點，這表明細胞免疫和體液免疫在該模型的免疫病理過程發(fā)揮重要作用。后來Thiele的研究團隊重復該關(guān)節(jié)炎模型，進一步揭示病變關(guān)節(jié)出現(xiàn)更嚴重的軟骨膠原降低、軟骨侵蝕等骨損傷表現(xiàn)，并與血清中總ACPAs和抗瓜氨酸化Ⅱ型膠原抗體滴度呈正相關(guān)[7]。這與人類RA的發(fā)病特點極為相似，提示瓜氨酸化蛋白抗原與ACPAs的產(chǎn)生可直接介導骨損傷。

2 以瓜氨酸化蛋白短肽建立的關(guān)節(jié)炎模型

由于上述這些模型所選用的瓜氨酸化蛋白種類、免疫誘導方法不盡相同，特別是體外PADs催化效率不明確、所獲取的瓜氨酸化蛋白需經(jīng)過一系列純化、鑒定等繁瑣過程，各個模型間差異較大?？v觀近10年來，這些瓜氨酸化蛋白誘導性關(guān)節(jié)炎鼠模型并沒能得到更深入的研究。因此，繼續(xù)尋找一種合適的抗原及合適的造模方法，是進一步開發(fā)該模型所面臨的問題。早在1994年Brand等[8]就已證明Ⅱ型膠原蛋白肽段具有很強的刺激DBA/1小鼠產(chǎn)生T淋巴細胞增殖的能力，而且以CB11(CⅡ124-420)多肽段成功誘導DBA/1小鼠產(chǎn)生CIA。這提示多肽具有致關(guān)節(jié)炎的潛能。并且，已有研究表明瓜氨酸化蛋白短肽同樣具有免疫原性，而且人工合成的環(huán)狀瓜氨酸化蛋白短肽較線性形式免疫原性更強，它們均可以誘導瓜氨酸化蛋白特異性的T淋巴細胞增殖反應[9,10]，但是這些短肽能否誘導關(guān)節(jié)炎，國內(nèi)外尚未見報道。

于是，我們的團隊率先開展以環(huán)狀瓜氨酸化蛋白短肽誘導關(guān)節(jié)炎模型的探索，并已證實偶聯(lián)血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)的環(huán)狀瓜氨酸化波形蛋白短肽能誘導DBA/1小鼠產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎，而未偶聯(lián)KLH的環(huán)狀短肽未能誘導小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎[11]。首先我們篩選具有免疫原性的瓜氨酸化波形蛋白的第26～44位氨基酸序列為基礎(chǔ)短肽[10]，人工合成環(huán)瓜氨酸化波形蛋白短肽，并將KLH與該環(huán)狀短肽進行偶聯(lián)合成偶聯(lián)肽。接著將上述環(huán)狀短肽、偶聯(lián)肽分別與弗氏佐劑進行乳化，形成終濃度為1 mg/ml的乳化液。小鼠分別于第0天接受首次免疫注射乳化液0.2 ml及第21天進行強化免疫注射乳化液0.1 ml，采用鼠尾根部、背部多點皮下注射，并以CIA模型作為陽性對照。首次免疫后第5周偶聯(lián)肽組小鼠開始觀察到1只小鼠單個后足趾中度紅腫，逐漸減輕，持續(xù)2周后恢復正常；另2只小鼠于第6周才出現(xiàn)輕度的后足跖部紅腫，持續(xù)至第8周急速加重，以雙后足明顯紅腫為主，伴關(guān)節(jié)活動受限，隨后又快速減輕，約1周后紅腫基本消退，其發(fā)病率僅為25%(3/12)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)最高僅為8分，觀察周期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)畸形。這顯然與既往的瓜氨酸化蛋白誘導性鼠模型及CIA模型特點不同。而單純的環(huán)狀短肽組未發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，這表明偶聯(lián)KLH的環(huán)狀短肽具有更強的免疫原性，能誘導關(guān)節(jié)炎發(fā)生。進一步的關(guān)節(jié)病理顯示病變關(guān)節(jié)僅有輕度的滑膜增生，缺乏明顯的炎癥細胞浸潤，也無明顯骨質(zhì)破壞，這與上述轉(zhuǎn)基因小鼠關(guān)節(jié)炎模型的病理特點相似，與CIA模型明顯不同。在對血清ACPAs的檢測上，偶聯(lián)肽組可以檢測到抗CCP抗體、AKA等自身抗體的存在。有趣的是，偶聯(lián)肽組3只關(guān)節(jié)炎小鼠血清中均產(chǎn)生AKA抗體，另3只無關(guān)節(jié)炎的小鼠血清AKA也出現(xiàn)陽性，而CIA組小鼠血清的陽性率僅為16.67%(2/12)。這個臨床表現(xiàn)與血清學表現(xiàn)相對應正好證明該偶聯(lián)肽關(guān)節(jié)炎模型的可靠性，提示那些血清AKA陽性而未發(fā)展為關(guān)節(jié)炎的小鼠已經(jīng)對瓜氨酸化蛋白短肽產(chǎn)生特異性免疫應答。如果延長觀察周期，或許可以發(fā)現(xiàn)更多的小鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎。盡管該偶聯(lián)環(huán)狀短肽誘導性關(guān)節(jié)炎模型與CIA以及人類RA尚存在較大的差別，但我們的研究證實偶聯(lián)肽具有更強的免疫原性和致關(guān)節(jié)炎作用，對建立短肽誘導性關(guān)節(jié)炎模型的進一步探索提供方向。

3 問題與展望

人類RA是一種異質(zhì)性較強的慢性自身免疫性疾病，其發(fā)病涉及遺傳易感因素、環(huán)境、感染、自身免疫狀態(tài)等多種因素的影響。現(xiàn)有的RA疾病動物模型包括CIA、AIA等多種常見關(guān)節(jié)炎模型都無法全面模擬人類RA發(fā)病過程的所有特點；作為誘導CIA、AIA的Ⅱ型膠原蛋白、佐劑也并不是RA發(fā)病的真正啟動抗原。因此，建立一種能較全面模擬人類RA發(fā)病經(jīng)過的實驗動物模型，不僅要克服疾病易感的遺傳背景，還需要找到一種能啟動人類RA免疫病理改變的始動抗原。縱觀這些瓜氨酸化蛋白及其短肽誘導性關(guān)節(jié)炎動物模型的建立過程，可以看出作為實驗對象的鼠類大多已轉(zhuǎn)入HLA-DRB1*0401(HLA-DR4 IE)基因或自身攜帶有H-2q基因以克服RA疾病易感的遺傳因素。盡管眾多研究表明瓜氨酸化蛋白是人類RA發(fā)病的候選靶抗原，但是造模所用的瓜氨酸化蛋白均來自體外PADs的催化反應獲取，難以模擬體內(nèi)瓜氨酸化作用以及瓜氨酸化蛋白在體內(nèi)的免疫病理過程。人工合成的瓜氨酸化蛋白短肽具有比瓜氨酸化蛋白易獲得、易純化等優(yōu)勢，但其免疫原性同樣受空間結(jié)構(gòu)的影響。研究表明具有β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的環(huán)狀短肽具有更好的誘導免疫應答的性能[12]，而我們的研究中所采用的環(huán)狀短肽并未能確保該結(jié)構(gòu)的成功合成；并且，單純的環(huán)狀短肽氨基酸序列少，分子量小，其免疫原性弱，這也是我們采用偶聯(lián)KLH來增強其免疫原性的原因。正是由于存在上述諸多缺陷，使得這些瓜氨酸化蛋白及其短肽誘導性關(guān)節(jié)炎模型在造模成功率、關(guān)節(jié)炎特點、病理特征等方面存在較多差異，也沒有顯示出更多比CIA、AIA等模型更能代表人類RA病情特點的優(yōu)勢。然而，這些模型卻有著以瓜氨酸化蛋白特異性的T淋巴細胞增殖、產(chǎn)生高水平ACPAs及相關(guān)炎癥細胞因子的共同免疫學特征以及慢性病理過程，甚至后期出現(xiàn)明顯的軟骨侵蝕、骨質(zhì)破壞等表現(xiàn)；這些似乎更符合人類RA的病情特點。因此，進一步尋找合適的瓜氨酸蛋白及其短肽作為免疫誘導劑，優(yōu)化造模方法，選擇遺傳背景、解剖學、免疫學等與人類更親近的實驗動物作為研究對象，有望建立一個更能反映人類RA發(fā)病全過程的瓜氨酸化蛋白誘導性關(guān)節(jié)炎模型，這對深入探討RA的發(fā)病機制，特別是瓜氨酸化蛋白及ACPAs如何啟動免疫應答的發(fā)病機制具有重要作用。