齊寧利,程志華,龔霄*,楊濤華,靜瑋,周偉,李積華
1(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江,524001) 2(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,湖北 武漢, 430070)3(海南省果蔬貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江,524001)
番荔枝(AnnonasquamosaL.)屬番荔枝科(Annonaceae)番荔枝屬(Annona)植物,又稱釋迦果、洋波羅、佛頭果,呈圓球狀或圓錐形,果皮黃綠色,外表有瘤狀凸起,薄白蠟粉[1]。番荔枝廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū),現(xiàn)我國海南、廣東、廣西、福建、臺灣等熱帶地區(qū)廣泛種植[2]。其果肉鮮嫩美味,濃甜爽口,營養(yǎng)豐富而深受消費(fèi)者的喜愛。但番荔枝是典型的呼吸躍變型果實(shí),對乙烯極敏感,呼吸速率呈峰型變化,出現(xiàn)呼吸高峰,采后易受機(jī)械損傷和病害侵染[3],與大多數(shù)熱帶亞熱帶園藝產(chǎn)品一樣,番荔枝在低溫冷藏過程中容易發(fā)生生理失調(diào),誘發(fā)冷害現(xiàn)象發(fā)生,導(dǎo)致果肉組織木質(zhì)化,木質(zhì)素積累,伴隨營養(yǎng)成分的流失質(zhì)地糙硬少汁、內(nèi)部組織褐變和裂果等一系列劣變現(xiàn)象,影響了番荔枝果實(shí)的外觀品質(zhì)和商品價(jià)值,限制了番荔枝果實(shí)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[4-6]。
1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)是一種有效的乙烯拮抗劑,通過阻止乙烯與乙烯受體結(jié)合,導(dǎo)致乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻,從而抑制果蔬的生理生化反應(yīng),可延長果蔬的呼吸高峰,延緩果蔬后熟化[7]。若能在植物體內(nèi)乙烯作用之前施用1-MCP,1-MCP會首先與乙烯受體蛋白結(jié)合,從而阻止乙烯與其結(jié)合[8],因此1-MCP會顯著影響呼吸躍變型果實(shí)的采后生理。
硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)作為NO的載體化合物,通常被用來研究外源NO對植物生長的作用[9]。外源NO作為一種氣調(diào)保鮮劑,廣泛應(yīng)用于果蔬產(chǎn)品的保鮮。NO處理延長果蔬的貯藏期主要通過2個(gè)途徑,一方面是通過NO作用抑制果蔬內(nèi)源乙烯的生成,抑制果蔬的呼吸速率,從而延長貨架期;另一方面是NO處理可以提高果蔬的抗氧化酶活性,提高果實(shí)的抗氧化能力,從而達(dá)到保鮮的目的[10-11]。
目前國內(nèi)關(guān)于番荔枝保鮮的研究主要集中在冷藏、氣調(diào)貯藏、涂膜保鮮和成熟度等對品質(zhì)的影響,而有關(guān)1-MCP和SNP等化學(xué)保鮮劑對番荔枝采后果實(shí)的研究較少。本文預(yù)實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上,探究1-MCP和SNP處理對冷藏番荔枝果實(shí)呼吸速率、營養(yǎng)品質(zhì)、木質(zhì)素含量及與木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性的影響,以期為番荔枝果實(shí)貯藏保鮮提供參考。
大目番荔枝,采摘于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所果園,當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,選擇大小一致,七八成熟,無病蟲害,無機(jī)械損傷的番荔枝果實(shí)。
考馬斯亮藍(lán)、苯酚、濃H2SO4、葡萄糖、苯酚、濃HCl、甲醇、乙醇、正己烷、冰醋酸、NaOH均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
SY-1022果蔬呼吸測定儀,遼寧賽亞斯科技有限公司;UV-1780型紫外可見分光光度計(jì),日本Shimadzu公司;3-30K型低溫高速離心機(jī),德國Sigma公司;GY-4果實(shí)硬度計(jì),智取精密儀器有限公司;TP-214電子天平,北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司。
1.3.1 番荔枝保鮮處理
1-MCP處理:設(shè)置0.8、1.8、2.8 μL/L,共3個(gè)濃度梯度,于25℃下密閉熏蒸處理24 h,處理完畢后,打開培養(yǎng)箱通風(fēng)0.5 h,4℃相對濕度80%條件下貯藏18 d;SNP處理:設(shè)置0.25、0.5、1.0 mmol/L,共3個(gè)濃度梯度,避光浸泡30 min后,室溫下晾干,4℃相對濕度80%條件下貯藏18 d;每2 d從各處理組取樣,并用液氮速凍,于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?,重?fù)3次測定。在以上預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定以1.8 μL/L 1-MCP、0.5 mmol/L SNP保鮮劑處理和對照組,進(jìn)一步探究不同保鮮劑對冷藏番荔枝的營養(yǎng)品質(zhì)及木質(zhì)素合成代謝相關(guān)酶活性的變化。
1.3.2 呼吸速率的測定
采用果蔬呼吸測定儀測定,各處理組中挑選3個(gè)果實(shí),置于容積為2 L的呼吸室中,進(jìn)行測定,結(jié)果以mg/(kg·h)表示。
1.3.3 硬度和失重率的測定
硬度:采用GY- 4型果實(shí)硬度計(jì)測定。隨機(jī)選取3個(gè)果實(shí),去皮,于果實(shí)最大橫徑處,將探針垂直指向平面,均勻施加壓力至刻度線,讀取數(shù)值,單果重復(fù)10次。結(jié)果以N表示。
失重率:各處理組中挑選3個(gè)果實(shí),每天同一時(shí)間對其進(jìn)行稱重,計(jì)算公式如式(1):
(1)
式中:W1為貯藏前質(zhì)量,g;W2為貯藏后質(zhì)量,g。
1.3.4 可溶性蛋白和糖的測定
參考曹建康等[12]方法,可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行測定,在波長595 nm處比色測定吸光值,結(jié)果以mg/g表示;可溶性糖采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定,在波長485 nm處比色測定吸光值,結(jié)果以%表示。
1.3.5 總酚和類黃酮的測定
參考曹建康等[12]方法,提取液用1% HCl-甲醇溶液稀釋10倍后,在波長280 nm處吸光度表示總酚含量,結(jié)果以O(shè)D280/g表示;提取液用1% HCl-甲醇溶液稀釋5倍后,在波長325 nm處吸光度表示類黃酮含量,結(jié)果以O(shè)D325/g表示。
1.3.6 木質(zhì)素的測定
參考陳發(fā)河等[13]的方法,取1 g樣品,加5 mL 95%的乙醇研磨,于3 000×g離心7 min,沉淀物以95%乙醇沖洗3次,再用95%乙醇與正乙烷混合液(V(95%乙醇)∶V(正乙烷)=1∶2)沖洗3次,干燥后,溶于25%溴乙酰冰醋酸溶液中,70 ℃恒溫水浴中加塞保溫30 min,然后加入0.9 mL、2 mol/LNaOH溶液終止反應(yīng),加5 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L羥胺鹽酸,并以冰醋酸定容至10 mL,再用冰醋酸稀釋125倍得到樣品提取液,取上清液在280 nm處測定吸光度值,以O(shè)D280/g FW表示木質(zhì)素的含量。
1.3.7 PAL、PPO、POD、SOD活性的測定
苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)活性測定:參考KOUKOL等[14]的方法。取1.0 g番荔枝果肉,加入5 mL提取緩沖液(含40 g/L PVP、2 mmol/L EDTA、5 mmol/L β-巰基乙醇),冰浴條件下研磨。于4℃,10 000×g離心20 min,收集上清液,即為粗酶提取液,低溫保存?zhèn)溆谩2ㄩL290 nm處測定吸光度,以每克樣品(鮮重)在每毫升反應(yīng)體系中吸光度290 nm變化0.01為一個(gè)酶活力單位,結(jié)果以U/g鮮重表示。
多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性測定:參照GALEAZZI等[15]的方法。反應(yīng)15 s開始記錄反應(yīng)體系在波長420 nm的吸光度值,然后每隔1 min 記錄1次,連續(xù)測定至少6組。以每克樣品(鮮重)吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位,結(jié)果以U/g鮮重表示。
過氧化物酶(peroxidase,POD)活性測定:參照HAMMERSCHMIDT等[16]的方法。反應(yīng)15 s時(shí)記錄反應(yīng)體系在波長470 nm的吸光度值,然后每隔1 min記錄1次,連續(xù)測定至少6組。以每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg底物酶量為一個(gè)酶活力單位,結(jié)果以U/mgprot表示。
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性測定:取5.0 g番荔枝果肉,加入5 mL提取緩沖液(含4% PVPP和5 mmol/L DTT)冰浴條件下研磨。4℃,10 000×g離心20 min,收集上清液,即為粗酶提取液,低溫保存?zhèn)溆?。?支試管中均加入1.7 mL 0.05 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液,再分別加入0.3 mL 130 mmol/L蛋氨酸溶液、0.75 mmol/L氮藍(lán)四唑溶液、0.1 mmol/L EDTA-Na2溶液和0.02 mmol/L核黃素溶液以及0.1 mL酶液,立即混合后,將其中2支試管置于暗處,其他各管用光強(qiáng)3 000 lx的熒光燈光照15 min后,置于暗處終止反應(yīng)。以未光照管調(diào)零,于波長560 nm處測定吸光度值。以每克組織在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)酶活力單位,結(jié)果以U/mg prot表示。
采用Graphpad軟件繪圖,利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,用Duncan法檢驗(yàn)差異顯著性(P<0.05)。
呼吸作用是衡量采后果蔬新陳代謝強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[17]。由圖1可知,各處理組番荔枝的呼吸速率均呈先上升后下降的趨勢,在第9天出現(xiàn)呼吸高峰,對照組、1-MCP和SNP處理組呼吸速率分別為274.54,172.65和207.45 mg/(kg·h),與對照組差異顯著(P<0.05)。在0~3 d和12~18 d,1-MCP和SNP處理組間差異不顯著(P> 0.05)。上述結(jié)果表明,1-MCP和SNP處理可以抑制冷藏番荔枝的呼吸速率,其中1-MCP處理抑制呼吸高峰效果更好。
圖1 不同處理對番荔枝呼吸速率的影響Fig.1 Effects of different treatments on respiratory rate of Annona squamosa L.
失重率和硬度的變化直接反映采后番荔枝品質(zhì)的變化,失重率越高表明果蔬品質(zhì)下降越嚴(yán)重[18]。由圖2-A 可知,番荔枝果實(shí)硬度隨著貯藏時(shí)間的延長而下降,在第18天,對照組果實(shí)硬度為4.63 N,分別是1-MCP和SNP處理的45.3%和39.7%,顯著高于對照組(P<0.01),說明1-MCP和SNP處理可以有效維持番荔枝果實(shí)的硬度水平,兩處理組間差異不顯著(P>0.05)。
由圖2-B可知,番荔枝果實(shí)的失重率隨貯藏時(shí)間的延長而增加,在整個(gè)貯藏期間,1-MCP和SNP處理失重率顯著低于對照組(P<0.05),而兩處理組間差異不顯著(P>0.05)。綜上表明,1-MCP和SNP處理均可以抑制番荔枝果實(shí)硬度的下降及失重率的上升,減少重量損失,從而保持果實(shí)品質(zhì)。
圖2 不同處理對番荔枝硬度和失重率的影響Fig.2 Effects of different treatments on firmness and fruit weight loss of Annona squamosa L.
由圖3-A可知,0~9 d,1-MCP和SNP處理可溶性蛋白質(zhì)含量迅速上升,到第9天,1-MCP處理可溶性蛋白含量達(dá)4.52 mg/g,分別是對照組、SNP處理1.4倍和1.1倍。到第18天,對照組的可溶性蛋白質(zhì)含量比1-MCP和SNP處理低27.2%和21.6%,差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明,1-MCP和SNP處理可以維持冷藏番荔枝較高的可溶性蛋白質(zhì)含量,其中1-MCP能更好地提高貯藏中期果實(shí)的可溶性蛋白質(zhì)含量。
可溶性糖通過呼吸代謝作用為果實(shí)組織提供能量,主要包括葡萄糖和果糖,是評價(jià)果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[19]。由圖3-B可知,對照組番荔枝采后果實(shí)糖含量總體呈緩慢下降趨勢,均顯著低于1-MCP和SNP處理(P< 0.05)。在第9 天,1-MCP處理可溶性糖含量達(dá)到最大值,為14.72%,分別比對照組和SNP處理高35.3%和8.0%,在0~3 d和15~18 d,1-MCP和SNP組差異不顯著(P> 0.05)。表明2種處理均能保持果實(shí)可溶性糖含量且1-MCP處理有效提高貯藏中期的可溶性糖含量。
總酚和類黃酮都是植物組織產(chǎn)生的主要次生代謝產(chǎn)物,與果蔬的成熟衰老有著密切的關(guān)系[20]。同時(shí),番荔枝總酚的含量與木質(zhì)素的合成緊密相關(guān)[21]。由圖3-C可知,在貯藏第0~9天,對照組總酚含量迅速上升,番荔枝果實(shí)褐變程度嚴(yán)重與總酚含量相關(guān);在第9~18天,總酚含量變化平緩,且顯著高于1-MCP和SNP處理(P<0.05)。1-MCP和SNP處理在貯藏前期總酚含量基本一致,在第9~18天,1-MCP組總酚含量顯著低于SNP處理組(P<0.05)。
由圖3-D可知,對照組類黃酮含量呈先迅速上升后緩慢下降的變化趨勢,在第9天時(shí)達(dá)到最大值,是1-MCP和SNP處理組的1.63和1.58倍,在整個(gè)貯藏期間均顯著高于1-MCP和SNP處理組(P<0.05)。貯藏過程中,1-MCP處理類黃酮含量較低于SNP處理,其中在第6、第12和第15天顯著低于SNP處理(P<0.05)。表明1-MCP和SNP處理能有效抑制果實(shí)總酚和類黃酮含量,從而抑制木質(zhì)素含量的上升,以1-MCP處理效果更佳。
圖3 不同處理對番荔枝營養(yǎng)成分的影響Fig.3 Effects of different treatments on nutrient contents of Annona squamosa L.
木質(zhì)素作為植物組織的次生代謝產(chǎn)物,是構(gòu)成細(xì)胞壁的主要成分[22],木質(zhì)素的積累是導(dǎo)致采后果實(shí)品質(zhì)劣變的主要原因之一。如圖4所示,番荔枝的木質(zhì)素含量逐步上升,貯藏第12天,對照組木質(zhì)素含量達(dá)到最大值,1-MCP處理的1.48倍,顯著高于1-MCP和SNP處理(P<0.05)。1-MCP和SNP處理木質(zhì)素含量基本保持一致,在第9天,SNP處理顯著高于1-MCP處理(P<0.05)。表明1-MCP和SNP處理明顯抑制番荔枝果實(shí)木質(zhì)素的合成,從而延緩果實(shí)木質(zhì)化進(jìn)程。
圖4 不同處理對番荔枝木質(zhì)素含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on lignin content of Annona squamosa L.
PAL是苯丙烷類物質(zhì)代謝過程中的起始酶,在木質(zhì)素沉積中起著重要的作用。由圖5-A可知,PAL活性呈先上升后下降的趨勢,對照組在貯藏第9天達(dá)峰值,為29.16 U/g,是 1-MCP和SNP處理組1.61和1.48倍;在整個(gè)貯藏過程中,對照組PAL活性始終顯著高于1-MCP和SNP處理組(P<0.05),在0~9 d,1-MCP和SNP處理差異不顯著(P>0.05),在12~15 d,1-MCP處理PAL活性顯著低于SNP處理(P< 0.05),結(jié)果表明,1-MCP和SNP處理有利于抑制番荔枝PAL活性的增加,且1-MCP對抑制貯藏后期PAL活性較SNP處理效果更好。
PPO活性直接反映了果實(shí)的褐變情況。由圖5-B 可知,在整個(gè)冷藏期間,對照組番荔枝果PPO活性均顯著高于1-MCP和SNP處理組(P< 0.05),這也是對照組果實(shí)褐變程度明顯高于1-MCP和SNP處理的原因。1-MCP和SNP處理PPO活性在貯藏期間呈緩慢下降的趨勢,在貯藏第6~15天,1-MCP處理PPO活性顯著低于SNP處理(P<0.05)。結(jié)果表明,1-MCP和SNP處理能抑制果實(shí)PPO活性,其中1-MCP處理抑制效果更佳。
POD在木質(zhì)素合成過程中起關(guān)鍵作用,催化H2O2分解促使木質(zhì)素單體聚合[23]。由圖5-C可知,貯藏前3 d,番荔枝POD活性迅速增加,可以認(rèn)為是果實(shí)的逆境脅迫所致,抵御自由基的傷害。對照組POD活性在第9天達(dá)到峰值,隨后呈下降趨勢,且顯著高于1-MCP和SNP處理(P<0.05)。由此可見,1-MCP和SNP處理對冷藏番荔枝POD活性具有抑制作用,但1-MCP和SNP處理果實(shí)POD活性在貯藏過程中差異不明顯(P<0.05)。
SOD是植物組織體內(nèi)酶促活性氧清除系統(tǒng)中的細(xì)胞保護(hù)酶。由圖5-D可知,SOD活性呈先上升后下降的變化趨勢。在貯藏前期,1-MCP和SNP處理SOD活性無顯著差異(P< 0.05),在貯藏第9天,1-MCP處理組達(dá)到峰值,為433.29 U/mgprot,分別是對照和SNP處理組的1.24和1.10倍。1-MCP和SNP處理SOD活性顯著高于對照組(P< 0.05),貯藏第9~15天,1-MCP處理顯著高于SNP處理(P<0.05)。表明1-MCP和SNP處理提高了冷藏番荔枝SOD活性,可以更好地清除細(xì)胞的活性氧和自由基,其中1-MCP處理更好。
A-PAL活性;B-PPO活性;C-POB活性;D-SOD活性圖5 不同處理對番荔枝PAL、PPO、POD和SOD活性的影響Fig.5 Effects of different treatments on the PAL, PPO,POD and SOD activities of Annona squamosa L.
呼吸是生命的基本特征,提供各種代謝活動(dòng)所需能量。對于呼吸躍變型果實(shí)來說,當(dāng)呼吸高峰出現(xiàn)后,果實(shí)的品質(zhì)就會迅速下降,包括物理特性(硬度和失重率等)和營養(yǎng)指標(biāo)(可溶性蛋白和糖等)。其中,木質(zhì)素的形成和積累是導(dǎo)致番荔枝采后果實(shí)品質(zhì)劣變的主要原因,已在枇杷[24]、獼猴桃[25]等果實(shí)研究可知。本試驗(yàn)中,1-MCP和SNP處理在貯藏過程中失重率均呈上升趨勢,這可能是由于果實(shí)受到機(jī)械損傷以及成熟衰老進(jìn)程中,導(dǎo)致水分流失,并且伴隨著果實(shí)變軟和果皮變黑等癥狀,但與對照組相比,保鮮劑處理能更好地減少果實(shí)質(zhì)量損失。可溶性糖含量貯藏前期呈上升趨勢,可能是由于果實(shí)在成熟階段有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為糖類,而貯藏后期下降可能與番荔枝采后成熟衰老相關(guān),果實(shí)為維持正常的生理活動(dòng),通過氧化分解可溶性糖,提供能量。酚類物質(zhì)是木質(zhì)素合成所必需的前體物質(zhì)。酚類物質(zhì)調(diào)控木質(zhì)素合成,主要是通過氧化交聯(lián)作用,增厚果實(shí)的細(xì)胞壁,導(dǎo)致木質(zhì)化程度加劇,總酚含量前期上升可能是番荔枝果實(shí)表面受到輕微的機(jī)械損傷以及成熟階段果實(shí)組織內(nèi)酶活性提高,導(dǎo)致酚類物質(zhì)合成加快;而貯藏后期輕微下降可能是由于酚類物質(zhì)參與酶促褐變和木質(zhì)素合成所消耗的量大于生成量。
番荔枝果實(shí)發(fā)生木質(zhì)化現(xiàn)象是多種因素綜合作用的結(jié)果,果肉的PAL,PPO,POD和SOD等木質(zhì)素合成代謝相關(guān)酶都參與酚類物質(zhì)代謝,與果實(shí)木質(zhì)化的發(fā)生密切相關(guān)。其中,PAL是木質(zhì)素生物合成的起始酶,催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸;PPO是酶促褐變發(fā)生的主要酶,參與酚類物質(zhì)的氧化過程,從而影響木質(zhì)素的合成;POD在木質(zhì)素合成過程中起關(guān)鍵作用,催化H2O2分解氧化酚類物質(zhì);SOD廣泛存在于植物體內(nèi),是酶促活性氧清除系統(tǒng)重要的細(xì)胞保護(hù)酶。本研究發(fā)現(xiàn),1-MCP和SNP處理有利于抑制番荔枝PAL活性的增加,且1-MCP對抑制貯藏后期PAL活性較SNP處理效果更好;1-MCP和SNP處理果實(shí)的PPO活性一直保持在較低的水平,一方面是由于番荔枝果實(shí)在后熟衰老進(jìn)程中,果實(shí)軟熟甚至裂果時(shí),其果肉顏色仍然潔白,另一方面可能是低溫抑制了果實(shí)的呼吸作用和生物代謝;1-MCP和SNP處理對冷藏番荔枝POD活性具有抑制作用,從而減緩H2O2分解生成木質(zhì)素單體;1-MCP和SNP處理提高了貯藏前期冷藏番荔枝SOD活性,可能是由于果實(shí)的抗逆境反應(yīng),從而更好地清除細(xì)胞的活性氧和自由基,當(dāng)番荔枝果實(shí)開始變軟時(shí)達(dá)到最高值,隨后逐漸下降,其中1-MCP處理更好。
綜上,1-MCP和SNP處理方式都降低了果實(shí)的呼吸速率,維持較高的硬度,可溶性蛋白和糖含量,減少質(zhì)量損失,且降低了多酚和類黃酮含量,以及抑制了與木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性,從而抑制木質(zhì)素含量的上升,達(dá)到延緩木質(zhì)化進(jìn)程的目的。但1-MCP處理在降低果實(shí)呼吸高峰,提高貯藏中期果實(shí)的可溶性蛋白質(zhì)和糖含量,抑制PAL和PPO活性,提高SOD活性,抑制木質(zhì)素合成方面效果更佳。