基于GC-MS結(jié)合多元統(tǒng)計方法分析不同種類柑橘汁中香氣物質(zhì)

成傳香，王鵬旭，賈蒙，周心智，馬亞琴*

1(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712) 2(重慶市農(nóng)業(yè)科學院，果樹研究所，重慶，401329)

柑橘是世界第一大宗水果，其品種主要包括寬皮柑橘、橙類、柚類、檸檬和金柑等[1]。其中橙類在2018、2019年度全球產(chǎn)量預(yù)計達5 180萬t，中國為720萬t；寬皮柑橘全球產(chǎn)量預(yù)計達3 140萬t，中國為2 200萬t，占全球?qū)捚じ涕佼a(chǎn)量的70%以上[2]。中國柑橘種植以寬皮柑橘為主，主栽的三大柑橘品種為溫州蜜柑、椪柑和南豐蜜桔；橙類分為甜橙、血橙和臍橙等，其中甜橙是榨汁的主要品種。柑橘由于其風味獨特及富含營養(yǎng)物質(zhì)而深受消費者的喜愛，其中風味由香氣物質(zhì)的種類、含量及比例決定，是影響柑橘果實品質(zhì)最重要的特性之一。而香氣物質(zhì)是果實成熟過程中的次級代謝產(chǎn)物，主要為烯烴類、醇類、醛類、酮類和酯類等[3]。

感官評定是評價柑橘汁香氣品質(zhì)的常用方法之一，但其受評定者主觀因素影響較大，因此需結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法以確定香氣物質(zhì)的種類和含量。利用香氣值(odor activity value，OAV)，即香氣物質(zhì)的濃度與香氣閾值的比值來判斷香氣強度，從而可確定香氣物質(zhì)對整體風味的貢獻程度，其中OAV>1的香氣物質(zhì)被稱為香氣活性物質(zhì)。在對香氣物質(zhì)分析鑒定時，傳統(tǒng)的方差分析(analysis of variance, ANOVA)無法準確有效地鑒別重要香氣物質(zhì)，而多元統(tǒng)計分析學則可以彌補這一不足，目前在食品風味分析中已得到廣泛應(yīng)用，主要包括主成分分析(principle component analysis，PCA)和偏最小二乘回歸分析(partial least square regression，PLSR)等。其中PCA是將原來眾多且具有一定相關(guān)性的指標進行重新組合，從而得到一組新的互相無關(guān)的綜合指標來替代原來的指標。PCA的優(yōu)勢在于其對多項指標降維的同時能保留數(shù)據(jù)中的主要信息，從而減少了運算的復(fù)雜度和時間，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水果[4]、白酒[5]以及精油[6]的風味研究中。而偏最小二乘法是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法，是一種比較完善的基于因子分析的多變量校正方法。它在考慮自變量的同時也考慮了因變量的作用，同時通過折中各自空間內(nèi)的因子，使模型能較好地同時描述自變量和因變量，牛云蔚等[7]利用PLSR研究了櫻桃酒呈味物質(zhì)與感官質(zhì)量的相關(guān)性，確定了對每個感官屬性有顯著性貢獻的呈味物質(zhì)。林順順等[8]則利用PLSR研究了煙葉中化學成分與感官質(zhì)量的相關(guān)性。

本研究擬采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HS-SPME/GC-MS)檢測各類柑橘汁中香氣物質(zhì)的含量，通過OAV值篩選出香氣活性物質(zhì)，并比較品種和壓榨方式對香氣物質(zhì)種類及含量的差異，同時利用多元統(tǒng)計分析學分析柑橘種類、感官屬性和香氣活性物質(zhì)之間的相關(guān)性，以確定香氣物質(zhì)對風味的貢獻程度，為柑橘果實加工及種類辨別提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗共選用12種柑橘原料制汁(見表1)，其中南豐蜜桔分為2批榨汁，一批機器壓榨制汁(西南大學柑桔研究所中試車間FMC壓榨機壓榨)，另一批手榨制汁(家用錐式榨汁機壓榨)；哈姆林樣品汁從重慶忠縣派森百公司生產(chǎn)線上精濾加工單元取樣，其他果汁樣品均采取錐式壓榨。榨汁后經(jīng)80目無菌紗布過濾，存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

環(huán)己酮(分析純，純度≥99.5%，質(zhì)量濃度為0.95 mg/μL)、C5～C25正構(gòu)烷烴標準品，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；大茴香醛、葉醇、2-苯乙醇、癸醛和三乙酸甘油酯均為標準品，上海阿拉丁試劑有限公司。

表1 柑橘果實種類、分類及來源地Table 1 The species, classification and origin ofcitrus fruits

1.2 儀器與設(shè)備

7890A/5975C氣相色譜-單四極桿質(zhì)譜儀(配DB-5MS石英毛細管柱),美國Agilent公司；Combi PAL氣相色譜多功能自動進樣器,瑞士CTC公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng),美國Millpore公司；PB3002-S/FACT分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS 50/30 μm)萃取頭,美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香氣物質(zhì)測定

1.3.1.1 樣品萃取條件

參照鄭潔等[9]的方法，并加以修改。準確稱取5.0 g果汁，置于20 mL螺口玻璃瓶中，加入1.0 g干燥后的NaCl，再加入2 μL環(huán)己酮作為內(nèi)標物，用聚四氟乙烯隔熱墊密封瓶蓋旋緊備用，每個樣品測定3次。頂空固相微萃取條件：40 ℃平衡20 min；頂空吸附30 min；解析5 min。

1.3.1.2 色譜和質(zhì)譜條件

氣相色譜條件:色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：35 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至 240 ℃，保持2 min；進樣口溫度250 ℃；不分流進樣；載氣為He (純度>99.999%)；載氣流速1 mL/min。

質(zhì)譜條件:電子電離(electron ionization，EI)源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度 230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z35～400。

1.3.1.3 定性和半定量分析

利用圖譜庫(NIST 2008和Flavour 2.0)的檢索結(jié)果，并以C5-C25正構(gòu)烷烴的保留時間計算出化合物的相對保留指數(shù)，結(jié)合相關(guān)文獻[10-11]定性，確定相應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)。定量方法采用內(nèi)標法，內(nèi)標物為環(huán)己酮。通過各成分峰面積與內(nèi)標物峰面積對比進行半定量分析，含量單位為μg/g。

1.3.2 感官評價

根據(jù)ISO8589:2007標準在感官實驗室中進行感觀分析。參與感官的小組人員共計12人，其中6男6女，成員年紀在20～30歲之間。參考相關(guān)文獻[11]，確定本次研究的柑橘汁香氣描述詞依次為：甜香、果香、青香、花香、皮感和木香，之后對小組人員進行香氣訓(xùn)練。各感官屬性的定義及香氣訓(xùn)練標準見表2。

表2 各感官屬性的定義及香氣訓(xùn)練標準Table 2 Definition of sensory attributes and training criteria for aroma

感官實驗采用10點打分制(0～9)，即：0代表沒有嗅聞到該香氣，9代表該香氣強度極強；從0到9香氣強度呈遞增趨勢。本次感官評價實驗是在無異味的感官實驗室中進行，將準備好的果汁樣品盛放在無異味的品評杯中，經(jīng)隨機編碼后交給感官評價員對每種樣品的感官屬性進行打分，進行2次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 17.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，XLSTAT 2016軟件進行主成分分析，Unscrambler軟件進行偏最小二乘法分析，EXCEL 2013用于繪制圖表及數(shù)據(jù)整理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類柑橘汁香氣物質(zhì)的種類和含量

實驗中采用HS-SPME/GC-MS測定13種柑橘汁中的香氣物質(zhì)的種類和含量，共測得67種揮發(fā)性物質(zhì)，其中烯烴類物質(zhì)種類最多(15種)，其次為醇類(14種)、酯類(13種)和醛類(12種)物質(zhì)種類，酚類物質(zhì)種類最少，僅有2種。此外，另有4種酮類物質(zhì)和7種其他成分被檢測出來。

從表3中可以看出，在所有柑橘汁的香氣成分中，烯烴類物質(zhì)在種類和含量2方面都占比極大，其中含量所占百分比最高可達95%。3種寬皮柑橘的香氣物質(zhì)種類和含量要低于愛媛38號雜柑和大部分橙類(塔羅科血橙和奧林達夏橙除外)，其中椪柑和南豐蜜桔分別是香氣物質(zhì)含量最高和最低的寬皮柑橘，但南豐蜜桔的香氣物質(zhì)種類要高于其他2種寬皮柑橘。南豐蜜桔分為兩批榨取，分別為機榨和手榨，機榨汁中的香氣物質(zhì)種類和含量要遠高于手榨汁，原因是機榨過程中，柑橘果皮精油中的香氣物質(zhì)進入到汁中。愛媛38號雜柑香氣物質(zhì)含量雖高于寬皮柑橘，但明顯低于絕大部分橙類。在所有橙類中，紅夏橙和納塔爾晚熟甜橙的香氣物質(zhì)含量最高，塔羅科血橙和奧林達夏橙含量最低，并且所有甜橙類香氣物質(zhì)含量均高于塔羅科血橙。同為榨汁的主要品種，美國的新奇士橙和中國的江津長葉橙香氣物質(zhì)含量相差無幾。哈姆林作為國內(nèi)甜橙榨汁主要品種之一，其機榨樣品汁中香氣物質(zhì)種類最多，但含量并不高，原因可能是派森百公司車間榨汁采用的是切半式榨汁，因此沒有全果壓榨汁中其香氣物質(zhì)含量高。

表3 不同種類柑橘汁中各類香氣物質(zhì)含量及數(shù)量Table 3 The content and amount of various aroma substances in different citrus juices

注：括號里的數(shù)字表示香氣物質(zhì)的數(shù)量。

醇類香氣物質(zhì)主要是芳樟醇、α-松油醇和4-萜烯醇，橙花叔醇和苯乙醇分別只存在于南豐蜜桔手榨汁和機榨汁中，正庚醇是江安夏橙特有的醇類香氣物質(zhì)。醛類香氣物質(zhì)主要是反式-2-己烯醛、壬醛和癸醛，正己醛和α-甲基肉桂醛都是愛媛38號特有的醛類香氣物質(zhì)。香芹酮、香葉基丙酮和β-紫羅蘭酮作為主要的酮類香氣物質(zhì)在寬皮柑橘、雜柑和橙類分布中沒有顯著差異，而諾卡酮只存在于橙類果實中。酯類物質(zhì)作為一類重要的香氣物質(zhì)，存在于甜橙中的種類和數(shù)量要明顯高于寬皮柑橘和雜柑。烯烴類香氣物質(zhì)主要有檸檬烯、月桂烯和巴倫西亞橘烯等，與江倩[12]的研究結(jié)果一致。其中檸檬烯在所有香氣物質(zhì)中含量是最高的，對傘花烴只存于南豐蜜桔手榨汁和塔羅科血橙汁中。

2.2 不同種類柑橘汁中特征香氣物質(zhì)

含量高的香氣物質(zhì)其香氣強度不一定高，如含量高的檸檬烯對整體香氣貢獻程度并不高，利用OAV值可以較準確地判定香氣強度。OAV>1的香氣物質(zhì)稱為特征香氣物質(zhì)，也叫做香氣活性物質(zhì)，OAV值越高，香氣強度越大，對整體香氣的貢獻程度也就越大。查閱相關(guān)文獻[13-15]得到香氣物質(zhì)的香氣閾值，結(jié)合GC-MS的定量結(jié)果，計算所得OAV值。表4所示為13種柑橘汁中OAV>1的香氣物質(zhì)。

表4 不同種類柑橘汁中OAV>1的香氣物質(zhì)Table 4 Aroma substances of OAV>1 in different citrus juices

由表4可以看出，13種柑橘汁中OAV>1的香氣物質(zhì)總共37種，醇類、醛類、酮類、酯類、萜烯類和酚類分別有8、6、4、6、11和2種，其中OAV值較高的香氣物質(zhì)有芳樟醇、壬醛、癸醛、β-紫羅蘭酮、丁酸乙酯、巴豆酸乙酯、月桂烯和檸檬烯，與陳婷婷[16]的報道結(jié)果基本一致。檸檬烯雖然OAV值較高，但XIAO[11]利用GC-O發(fā)現(xiàn)，檸檬烯的強度得分為中等靠下，表明香氣強度并不高。機榨哈姆林橙汁包含最多的特征香氣物質(zhì)，為30種，其次為江津長葉橙，包含29種，3種寬皮柑橘低于其他種類柑橘汁，分別包含19、21和17種。TAKAYUKI[17]在5種雜交寬皮柑橘品種中共檢測到49種香氣活性物質(zhì)，其中醛類物質(zhì)種類最多。SERKAN等[18]在2種血橙中共檢測到了15種香氣活性物質(zhì)，OAV值較高的香氣物質(zhì)有芳樟醇、檸檬烯和諾卡酮。SHI等[19]認為丁酸乙酯、辛醛和癸醛等是甜橙的典型香氣物質(zhì)，芳樟醇、檸檬烯、辛醛和α-蒎烯是寬皮柑橘的典型香氣物質(zhì)。

2.3 感官評定

表5列出了13種柑橘汁中各感官屬性的打分結(jié)果，其中同列感官屬性評分上的不同字母表示不同種類的柑橘汁的感官屬性有明顯的差異性。方差分析結(jié)果表明，6種感官屬性中皮感和青香的差異性最顯著，其次是甜香、花香和果香，最后是木香。由感官評價結(jié)果可以看出，甜香和果香的評分較高，表明其特征香氣比較突出。椪柑的甜香評分最高，手榨的南豐蜜桔樣品汁果香評分最高，而青香評分最高的是納塔爾晚熟甜橙，甚至要高于2種機榨的柑橘汁，除此之外，花香評分最高的是江津長葉橙，木香評分最高的是機榨哈姆林甜橙樣品汁。由于機器壓榨的原因，南豐蜜桔和哈姆林的皮感評分最高。對13種柑橘汁感官評價結(jié)果繪制雷達圖,得到各汁樣品的感官屬性評分結(jié)果與雷達圖一致，表明這6種感官屬性可以較好的解釋柑橘汁的香氣特征。

表5 不同種類柑橘汁感官評價結(jié)果Table 5 Sensory evaluation results of different citrus juices

注：“a、b、c、d、e、f、g”代表不同種類柑橘汁中同一種感官屬性的差異性。

2.4 不同種類柑橘汁、感官和香氣物質(zhì)的相關(guān)性分析

本研究以柑橘汁樣品及感官屬性作為分析對象，采用主成分分析法對13個柑橘汁樣品的6種感官屬性進行分析。第F1主成分的貢獻率為66.06%，第F2主成分的貢獻率為18.48%，2個主成分的累計貢獻率已經(jīng)達到84.54%，表明第F1、第F2兩個主成分解釋了原香氣特征變量84.54%的方差信息。與第F1主成分呈現(xiàn)正相關(guān)的指標主要有甜香、果香和花香，與第F2主成分呈現(xiàn)負相關(guān)的指標僅有木香，其余均呈現(xiàn)正相關(guān)。

圖1 主成分載荷圖Fig.1 Principal component load diagram

由圖1可知，13種柑橘汁樣品根據(jù)距離遠近被分在不同的象限內(nèi)，第1主成分正半軸的NO.1、NO.2、NO.3、NO.4、N0.7、N0.8、NO.9和NO.10為一類，負半軸的NO.5、NO.6、N0.11、NO.12和NO.13為一類。第2主成分正半軸的NO.7、NO.9、NO.10、NO.12和NO.13為一類，負半軸的NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6和NO.8為一類。

在PC1軸正方向有3種寬皮柑橘、1種雜柑、1種血橙和3種甜橙以及花香、果香和甜香，負方向有2種機榨汁樣品、3種甜橙以及皮感、青香和木香。沿PC2軸，負方向僅有3種寬皮柑橘、2種機榨汁樣品和1種血橙以及木香，其他種類柑橘汁及感官屬性均對PC2的正方向工作效率較大。愛媛38號、椪柑和手榨南豐蜜桔汁樣品與甜香在PCA圖上距離較近，表明樣品感官屬性甜香較為突出。新奇士橙、江津長葉橙和奧林達夏橙與果香相關(guān)性較大，2種機榨汁樣品與木香相關(guān)性明顯，納塔爾晚熟甜橙與青香和皮感相關(guān)性明顯。13種柑橘汁樣品與花香距離均較遠，表明其與花香相關(guān)性較差。PC2軸可以明顯將寬皮柑橘、雜柑、血橙與甜橙區(qū)分開來，PC1軸可以將機榨汁樣品與手榨汁樣品區(qū)分開來。除此之外，甜香不明顯的溫州蜜柑樣品可以與另外2種寬皮柑橘區(qū)分開來，果香明顯的新奇士橙、江津長葉橙和奧林達夏橙以及青香和皮感明顯的納塔爾晚熟甜橙可以與其他甜橙樣品區(qū)分開。新奇士橙和江津長葉橙在PCA圖中位置相近，表明各感官屬性較為一致。YUAN等[20]通過PCA可以將寬皮柑橘、酸橙及血橙等13個柑橘品種區(qū)分開。LIVNAT等[21]利用PCA分析了柑橘雜交品種其香氣物質(zhì)的相似性。

以不同種類柑橘汁中的特征香氣物質(zhì)與感官屬性作為分析對象，采用偏最小二乘法對37種特征香氣物質(zhì)和6種感官屬性進行相關(guān)性分析。將特征香氣物質(zhì)含量作為X變量，每種柑橘汁樣品的感官屬性作為Y變量，建立PLSR模型，考察對每個感官屬性顯著性相關(guān)的特征香氣物質(zhì)，如圖2所示。

圖2 37種特征香氣物質(zhì)與6種感官屬性之間的相關(guān)性分析Fig.2 Analysis of correlation between 37 characteristic aroma substances and 6 sensory properties

從圖2中可以看出，甜香、青香以及花香與香氣物質(zhì)均有顯著相關(guān)關(guān)系，沒有香氣物質(zhì)與果香、皮感及木香顯著相關(guān)。其中，辛酸乙酯和巴豆酸乙酯對甜香的正相關(guān)性最為顯著，正辛醇、反式-2-己烯醛和丁酸乙酯對青香的正相關(guān)性最為顯著，而與花香正相關(guān)性最顯著的特征香氣物質(zhì)為香茅醇、葉醇、巴倫西亞橘烯和金合歡烯。而在陳佳瑩[22]的研究中，芳樟醇和橙花醇對花香有積極效應(yīng)。

3 結(jié)論

3種寬皮柑橘汁其香氣物質(zhì)的種類和含量均要低于雜柑和大部分橙類，南豐蜜桔機榨樣品汁中香氣物質(zhì)含量要遠高于手榨樣品汁。在所有柑橘汁樣品的香氣物質(zhì)中，共鑒定出37種特征香氣物質(zhì)，主要包括芳樟醇、月桂烯、壬醛等，其中包含特征香氣物質(zhì)最多的是哈姆林橙和江津長葉橙，最少的則為3種寬皮柑橘。

實驗采用主成分分析和偏最小二乘法回歸分析研究柑橘汁、感官屬性和特征香氣物質(zhì)的相關(guān)性，結(jié)果表明：多元統(tǒng)計分析可以明確將3種寬皮柑橘、8種橙類和1種雜柑區(qū)分開，同時可以將寬皮柑橘品種以及橙類品種具體劃分，還可以將機榨汁與手榨汁樣品區(qū)分。寬皮柑橘的甜香屬性較為突出，而與甜香具有積極效應(yīng)的特征香氣物質(zhì)為辛酸乙酯和巴豆酸乙酯；新奇士橙、江津長葉橙和奧林達夏橙與果香相關(guān)性較大，2種機榨汁樣品與木香相關(guān)性明顯，但沒有發(fā)現(xiàn)與果香及木香顯著相關(guān)的香氣物質(zhì)；納塔爾晚熟甜橙與青香和皮感相關(guān)性明顯，而與青香呈正相關(guān)的物質(zhì)有丁酸乙酯、正辛醇等。綜上，本研究主要利用GC-MS和多元統(tǒng)計分析研究柑橘的香氣物質(zhì)，比較品種、壓榨方式對香氣物質(zhì)種類和含量造成的差異，采用客觀、科學的鑒定手段分析香氣物質(zhì)對柑橘果實香氣品質(zhì)的貢獻程度，為柑橘果實品質(zhì)評價和加工提供了參考信息?；谠撗芯拷Y(jié)果，后續(xù)通過設(shè)計GC-O實驗以及香氣重組與缺失實驗，將對特征香氣物質(zhì)進一步驗證。除了主要賦香物質(zhì)外，同時還需關(guān)注在果實香氣構(gòu)成中起協(xié)調(diào)、修飾和定香作用，且含量極少的化合物。