運用Box-Behnken設計優(yōu)化核桃多肽制備工藝

張慶，袁源，鄧揚龍，周翔宇，樊桂靈，李玉鋒

(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)

在當今許多經濟型干果樹中，核桃具有良好持久的經濟、社會和生態(tài)效益。核桃油生產占據(jù)了核桃加工產業(yè)的主要地位，但榨油后殘余的核桃蛋白質利用率極低。在現(xiàn)有研究中指出，核桃仁含有豐富的核桃蛋白、脂肪酸、礦物質和維生素，具有延緩衰老、降低冠心病發(fā)病率、健腦益智、抑制炎癥等作用。對核桃仁的營養(yǎng)分析得出，核桃仁含有約65%的油和18%～24%的蛋白質[1-2]。根據(jù)相關文獻，核桃蛋白的蛋白質含量非常豐富，共有18種不同的氨基酸，其中谷氨酸含量最高，精氨酸次之[1]。而通過蛋白質水解得到的活性肽具有相對分子質量小、易吸收、無抗原性、避免耐藥、經消化道進入人體后無副作用等優(yōu)點。迄今，蛋白質水解后的多肽在功能特性與生物活性上都略勝一籌。例如溶解性、乳化性和起泡性都隨著適宜水解逐漸增加。所以，各國科學家和政府對生物活性肽的研究也越來越重視[3]，國內外對生物活性肽的研究發(fā)展進一步提升。

蛋白質的水解方式主要包括化學降解和酶法降解[4]。從100多年前就有學者提出化學降解這類研究辦法，而化學法分為酸降解與堿降解，但酸堿反應條件較為劇烈。酸水解可破壞其中色氨酸，堿水解則使胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸等受到損傷，還會引起氨基酸的外消旋化[5]。由此，酶法水解與化學法相比，具有效率高、條件溫和等優(yōu)點。在水解過程中，氨基酸的結構和構型保持不變，只破壞肽鍵，不產生有毒有害物質[6-7]。因此，采用酶解方法受到越來越多學者的青睞。

蛋白質水解度(degree of hydrolysis,DH)表示蛋白質分解即肽鍵斷裂的程度，是破壞的肽鍵數(shù)目與底物中肽鍵總數(shù)的百分比[8]。蛋白質在水解過程中會酶解成多肽以及氨基酸，適度水解可保證多肽得率效果極佳，而過度水解則會增加氨基酸的生成量，可根據(jù)在水解過程中加入的NaOH量來計算，以保持水解過程中的pH恒定[9]。多肽含量測定針對蛋白質水解后溶液中多肽的生成量，常規(guī)測定方法主要有凱氏定氮法(Kjeldahl determination, KD)[10]、考馬斯亮藍(Bradford) 染色法[11]、雙縮脲比色法(biuret assay, BA)[12]、Folin-酚試劑法(Lowry)[13]、紫外分光光度法(ultraviolet-spectrophotometric, UV-S)[14]。本研究采用雙縮脲比色法進行測定。

響應面法(response surface method，RSM)將試驗的目標響應值(如核桃多肽提取率)作為單個或多個試驗因素(如酶解時間、酶解溫度等)的目標函數(shù)，然后將上述函數(shù)關系通過多維圖形進行表達，通過圖形分析、函數(shù)求導等方式優(yōu)化試驗設計中的最佳條件[15]。響應面設計的最大優(yōu)點是通過更少的實驗次數(shù)和更佳的實驗組合接近最優(yōu)值。即采用響應面法對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

核桃，四川省巴中市。

1.2 主要試劑

丁烷、NaOH、HCl、三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶，上海瑞永生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

BT-423S分析天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；CBE-10L亞臨界流體萃取設備，河南省亞臨界生物技術有限公司；SHA-B振蕩水浴鍋，常州市金壇華偉儀器廠；101真空冷凍干燥機，上海躍進醫(yī)療機械廠；PHS-2C pH計，上海雷磁儀器公司；D-37520型高速冷凍離心機，美國Sigma公司；UV-1600型紫外分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；ZN-200A高速中藥粉碎機，長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠；移液槍，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；HWS24恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。

2 試驗方法

2.1 核桃蛋白的制備

將核桃干燥后粉碎，采用亞臨界丁烷萃取核桃油，重復3次，直至核桃油完全萃出，得到脫脂核桃粕。于4 ℃下低溫冷藏備用。

將烘干的核桃脫脂粉按一定的的料液比分散在蒸餾水中，配制成質量分數(shù)為5%的核桃蛋白溶液。混合物用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)至pH 8.5，55 ℃水浴攪拌2 h，8 000 r/min低溫離心20 min，棄去沉淀，保留上清液，用1 mol/L HCl溶液調節(jié)pH 4.5，攪拌1 h，8 000 r/min低溫離心20 min，沉淀用蒸餾水水洗至中性，調節(jié)pH至中性后,冷凍干燥24 h并儲存在干燥器內備用。

2.2 核桃蛋白酶解液制備及預處理

查閱相關文獻[16-18],按照各蛋白酶的最佳底物濃度稱取一定量的核桃蛋白,加蒸餾水配制成相應濃度的蛋白溶液，于水浴鍋中一定溫度和時間預處理后，調至最適pH，加入一定量各蛋白酶，于各蛋白酶最適水解溫度下反應一段時間，期間用1.0 mol/L的NaOH維持pH，酶解結束后放置于90 ℃水浴鍋 10 min滅活終止反應，8 000 r/min低溫離心20 min，保留上清液，測定水解度和多肽含量。

將上述試驗方法作為基礎，略作修改，得到木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶的最佳酶解條件如表1所示(%均表示為體積分數(shù))：

表1 每種蛋白酶的最佳酶解條件Table 1 Optimal enzymatic hydrolysis conditions of eachprotease

2.3 水解度的測定

采用pH-stat法測定核桃蛋白質的水解度，以滴定核桃蛋白所消耗標準NaOH溶液的體積計算水解度[19]，如公式(1)所示。

(1)

式中:DH,水解度；B,最適pH時所消耗NaOH的體積，mL；Nb,標準NaOH濃度，mol/L；Mp,加入水解蛋白質含量，g；htot,蛋白質中肽鍵的總數(shù)，mmol/g蛋白，本文核桃蛋白的htot為8.0 mmol/g；α,水解過程中核桃蛋白中的α-氨基的解離度，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：PK,水解過程中釋放的氨基的平均離解值，取決于溫度、肽鏈長度和末端氨基酸的性質。

2.4 多肽含量的測定

2.4.1 標準曲線的測定

依照相關試驗方法[20-21]，略作修改后測定蛋白水解液中多肽含量。準確量取體積分數(shù)5% TCA配制的0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準溶液于6支10 mL容量瓶中，加水補至刻度線，取上述溶液各6 mL，然后加入雙縮脲試劑4 mL，充分振蕩搖勻后，室溫孵育0.5 h，3 000 r/min離心5 min，于540 nm處測定吸光值。用第1支空白蛋白質溶液作為對照液。以蛋白質濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

2.4.2 樣品的測定

準確量取樣品溶液2.5 mL，加入相同量的10% TCA水溶液，充分振蕩均勻，室溫孵育10 min，然后在3 000 r/min下離心15 min，將上清液用5% TCA水溶液定容至50 mL容量瓶中，充分振蕩搖勻，后續(xù)操作按2.4.1進行，結果對照標準曲線求得樣品溶液中的多肽含量(mg/mL)。

2.5 單因素試驗設計

單因素分別選取酶解時間、酶解溫度、酶濃度以及酶解pH，考察各因素對蛋白質水解度以及多肽含量的影響，確定堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳工藝。

2.5.1 酶解時間的影響

在酶解溫度為50 ℃時，底物濃度為2%，酶解pH為7的條件下，探究酶解時間為2、3、4、5、6、7 h對蛋白質水解度以及多肽含量的影響。

2.5.2 酶解溫度的影響

在酶解時間為5 h，底物濃度為2%，酶解pH為7的條件下，探究酶解溫度為40、45、50、55、60、65 ℃對蛋白質水解度以及多肽含量的影響。

2.5.3 加酶量的影響

在酶解時間為5 h，酶解溫度為50 ℃，酶解pH為7的條件下，探究加酶量為1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%對蛋白質水解度以及多肽含量的影響。

2.5.4 酶解pH的影響

在酶解時間為5 h，酶解溫度為50 ℃，底物濃度為2%的條件下，探究酶解pH為4、5、6、7、8、9對蛋白質水解度以及多肽含量的影響。

2.6 響應面優(yōu)化酶解工藝

在單因素試驗中，酶解時間、加酶量、酶解溫度以及酶解pH對多肽含量以及水解度影響較大，因此以單因素實驗結果為根據(jù)，選取這4個因素進行響應面優(yōu)化試驗。以多肽含量為評價指標，確定響應面實驗因素和水平，優(yōu)化堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的工藝條件，每組試驗平行3次。按照Box-Behnken響應面試驗設計原理確定最佳提取條件。試驗設計中的因素水平編碼見表2所示。

表2 響應面試驗因素水平編碼表Table 2 Response surface test factor level coding table

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 9.0軟件進行響應曲面分析，采用Origin 9.1軟件進行線性回歸分析及作圖。

3 結果與分析

3.1 預處理測定結果

3.1.1 多肽標準曲線的繪制

以Gly-Gly-Tyr-Arg四肽的質量濃度為橫坐標(mg/mL)，其吸光度為縱坐標繪制標準工作曲線，得到Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準工作曲線如圖1所示。線性回歸方程為y=0.379 7x+0.017 4，相關系數(shù)R2為0.997 1，說明多肽質量濃度在0.02～1.6 mg/mL范圍內與其吸光度呈良好的線性關系。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準曲線Fig.1 Gly-Tyr-Arg tetrapeptide standard curve

3.1.2 各蛋白酶水解度、多肽含量對比

木瓜蛋白酶歸于巰基蛋白酶，它水解蛋白質和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基末端，優(yōu)先水解肽鍵與肽鍵N端有2個羧基的氨基酸或芳香族L-氨基酸。根據(jù)圖2、圖3可知，堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解度分別為19.56%、11.70%和9.24%，多肽含量為2.210、1.936、1.812 mg/mL。在各蛋白酶的最佳作用條件下對比上述結果可知，堿性蛋白酶在水解度和多肽含量方面都略勝一籌，故選擇其作為工藝優(yōu)化的原料酶。

圖2 各蛋白酶酶解核桃多肽水解度比較Fig.2 Comparison of hydrolysis degree of walnut peptideshydrolyzed by proteases

圖3 各蛋白酶酶解核桃多肽含量比較Fig. 3 Comparison of the contents of walnut peptideshydrolyzed by proteases

3.2 酶法提取核桃多肽含量單因素試驗結果

3.2.1 加酶量對酶解反應的影響

將不同梯度堿性蛋白酶進行測定，得到不同加酶量條件下多肽質量濃度對比如圖4所示。

圖4 加酶量對多肽濃度的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on polypeptideconcentration

由圖4可知，堿性蛋白酶加酶量在1%～3.5%之間，隨著加酶量的增加，核桃多肽含量增加，之后再增加酶量，其多肽含量逐漸降低。出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因可能是在核桃蛋白質酶解過程中，隨著加酶量的增加，過多的酶分子抑制了中間產物向酶解反應終產物的轉化。蛋白酶在一定范圍內，隨著加酶量的增加，酶與底物相互結合反應的能力隨之加大，酶促反應速度迅速增加，多肽含量也隨之快速增加。當酶量達到飽和后，過量的酶抑制酶解反應。以上現(xiàn)象說明不同的作用底物，其蛋白酶的最適添加量不同，人們一般選用酶最佳反應條件時，酶的利用率最高。

3.2.2 酶解時間對酶解反應的影響

將堿性蛋白酶不同酶解時間進行測定，得到不同酶解時間條件下多肽質量濃度對比如圖5所示。

圖5 酶解時間對多肽質量濃度的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on polypeptideconcentration

由圖5可以看出，適當?shù)拿附鈺r間有助于提高多肽質量濃度。在酶解時間2～4 h內，核桃多肽質量濃度隨著時間增加而迅速上升，4 h之后，隨著時間增加質量濃度反而呈下降的趨勢。出現(xiàn)以上結果的原因可能是在較短時間內，底物與酶的接觸反應時間較短，接觸面積不夠完全，整個溶液體系的流動性較小，限制了酶發(fā)揮作用，造成多肽并沒有被充分酶解出來，而時間過長之后，底物與酶接觸過大，溶液呈現(xiàn)過于飽和狀態(tài)，酶解過度成為了寡肽。所以，選擇pH 4作為最佳條件。

3.2.3 酶解pH對酶解反應的影響

將堿性蛋白酶按不同酶解pH進行測定，得到不同酶解pH條件下多肽質量濃度對比如圖6所示。

圖6 酶解pH對多肽濃度的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis of pH on peptideconcentration

根據(jù)圖6的曲線走勢可以看出，多肽濃度對于酶解pH是比較敏感的，多肽濃度最高的點位在pH 7。多肽濃度隨著pH變化而變化，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，pH較高會使酶失活。酶自身的活性基團受酸堿值影響，pH的升降都會對其活性部位在酶解反應中產生的作用做出相應的改變。所以，綜上，選擇pH為7作為本實驗最佳條件。

3.2.4 酶解溫度對酶解反應的影響

將堿性蛋白酶按不同酶解溫度進行測定，得到不同酶解溫度條件下多肽質量濃度對比如圖7所示。

圖7 酶解溫度對多肽濃度的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis temperature onpeptide concentration

當試驗酶解溫度從40 ℃開始逐漸增加時，溶液中多肽質量濃度也隨之增加，在50 ℃～60 ℃之間，多肽的質量濃度無顯著變化,但在55 ℃時多肽達到最高質量濃度。不同的酶作用的最適溫度不同，過高或者過低都會降低酶解反應的效率，經試驗，選擇55 ℃作為最適溫度。

3.3 響應面優(yōu)化核桃多肽工藝

根據(jù)上述各單因素實驗結果分析，選取四川薄皮核桃蛋白為實驗材料，確定Box-Benhnken響應面優(yōu)化實驗因素水平。以加酶量(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)、酶解pH(D)為自變量，以反應過后所得多肽濃度為目標函數(shù)值，建立對應函數(shù)關系。采用Design-Expert 10統(tǒng)計軟件進行響應面回歸分析，回歸方程的方差顯著性檢驗分析結果見表3，響應面模型的方差分析見表4。

表3 響應面實驗組合及結果Table 3 Response surface experiment combination andresults

由表3的實驗數(shù)據(jù)進行響應面分析，得到表4的方差分析表，并得到擬合方程

Y=2.42+0.054A+0.012B+4×10-3C-0.022D-0.035AB+0.040AC+0.016AD-5.5×10-3BC-2.5×10-3BD-0.018CD-0.076A2-0.025B2-0.059C2-0.051D2

表4 響應面模型的方差分析表Table 4 Variance analysis table of response surface model

注：*表示P值≤0.05，差異顯著；*表示P值≤0.01，差異極顯著。

上述擬合方程的R2=0.906 8,且該模型顯著值>0.000 1，線性關系表現(xiàn)優(yōu)良。由表4可知，一次項堿性蛋白酶加酶量影響極顯著，酶解pH影響顯著，而酶解時間和酶解溫度差異不顯著；二次項堿性蛋白酶加酶量、酶解溫度、酶解pH都是差異極顯著的、酶解時間差異顯著；在實驗的交互影響當中，堿性蛋白酶加酶量和酶解時間、加酶量和酶解溫度交互作用顯著；加酶量和酶解pH、酶解時間和酶解溫度、酶解時間和酶解pH、酶解溫度和酶解pH交互作用差異不顯著。

圖8～圖13為雙因素交互作用曲面圖和等高線圖，根據(jù)等高線的位點不同可判斷交互作用是否顯著，等高線呈橢圓形則說明交互作用顯著，并隨著橢圓長半軸變長交互越顯著，而圓形則表示交互不顯著。從圖8可以得到，堿性蛋白酶加酶量和酶解時間對提取多肽質量濃度影響交互作用顯著，隨著加酶量和酶解時間的增加，提取多肽濃度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。這是在反應達到飽和后加入過量的酶不能增加多肽質量濃度，而過長的酶解時間反而會影響反應中接觸面積從而降低多肽質量濃度。從圖9可知，堿性蛋白酶加酶量和酶解溫度交互作用對提取多肽質量濃度影響極顯著，當加酶量過大和酶解溫度過高后，提取多肽質量濃度反而減小，這是因為酶解溫度過大易使酶失活。

圖8 堿性蛋白酶加酶量和酶解時間對提取多肽濃度的影響Fig.8 Effect of alkaline protease addition enzyme andenzymatic hydrolysis time on extracted peptideconcentration

圖9 堿性蛋白酶加酶量和酶解溫度對提取多肽濃度的影響Fig.9 Effect of alkaline protease addition enzyme andenzymatic hydrolysis temperature on extracted peptideconcentration

圖10 堿性蛋白酶加酶量和酶解pH對提取多肽濃度的影響Fig.10 Effect of alkaline protease addition enzyme andenzymatic hydrolysis pH on extracted peptide concentration

圖11 酶解時間和酶解溫度對提取多肽濃度的影響Fig.11 Effect of enzymatic hydrolysis time and enzymatichydrolysis temperature on the concentration of extractedPeptide

圖12 酶解時間和酶解pH對提取多肽濃度的影響Fig.12 Effects of enzymatic hydrolysis time and enzymatichydrolysis pH on the concentration of peptides extracted

圖13 酶解溫度和酶解pH對提取多肽濃度的影響Fig.13 Effects of enzymatic hydrolysis temperature andenzymatic hydrolysis pH on the concentration of extractedpeptides

從圖10可知，加酶量和酶解pH交互作用極顯著，隨著加酶量和酶解pH的增加，提取多肽質量濃度先上升后略下降，加酶量升到一定值后對提取值的影響變化較小，因為加酶量和酶解pH過高也易導致堿性蛋白酶酶活性降低甚至失活。

從圖11可知，酶解時間和酶解溫度的交互作用極顯著，響應曲面反應的趨勢先上升后略下降，剛開始時反應不完全且酶解溫度低，提取不完全，酶解時間過長則可能導致多肽濃度飽和甚至是酶解過度。從圖12可知，酶解時間與酶解pH的交互作用顯著，等高線圖表明適宜酶解時間條件下，更高一些的酶解pH有利于多肽的提取。從圖13可知，酶解溫度與酶解pH的交互作用顯著，曲線與等高線表明酶解溫度適宜時，過高pH會使酶失活，導致酶解不適當，多肽濃度較低。

綜合分析得到酶解法提取多肽濃度的最佳條件為加酶量2.03%，酶解時間4.2 h，酶解溫度50.24 ℃，酶解pH 7.13,根據(jù)實際情況可將最佳工藝條件調整為加酶量2%，酶解時間4 h，酶解溫度50 ℃，酶解pH 7，在此條件下進行驗證得到核桃多肽提取質量濃度為2.55 mg/mL，與上述預測結果無偏差，說明預測結果良好。