紫甘薯結(jié)合酚提取工藝的優(yōu)化

王婧，陳紅宇，曙阿克·庫爾曼巴依，隋曉楠

(東北農(nóng)業(yè)大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱，150030)

植物中含有的多酚等活性成分由于其安全、生理活性優(yōu)良等特點[1]，在食品及化妝品中應(yīng)用漸廣，其提取分離技術(shù)也隨之發(fā)展成為研究熱點。不同種類果蔬所含多酚的穩(wěn)定性具有一定差異，近年來有研究證實紫甘薯中花色苷較穩(wěn)定[2]，耐光耐熱性能優(yōu)于蘋果、草莓中花色苷[3]。紫甘薯肉色呈紫色，富含多酚化合物，具有良好的保健功效[4]。多酚在植物內(nèi)的存在形式通常有游離酚和結(jié)合酚2種[5]，游離酚對水和有機溶劑有良好溶解性，與基質(zhì)中其他大分子不發(fā)生互作，結(jié)合酚難萃取，是與基質(zhì)中其他物質(zhì)發(fā)生互作的多酚[6]。多酚的存在形式能夠影響提取的難易程度，因結(jié)合酚難直接萃取，在傳統(tǒng)酚類物質(zhì)提取的研究中易被忽略，這使得多酚提取損失增大。因此對結(jié)合酚提取的工藝研究能夠為實際生產(chǎn)中多酚的提取提供理論基礎(chǔ)，有利于提高多酚提取原料的利用度，降低生產(chǎn)成本。

食品中的結(jié)合酚多為多酚與細胞壁、多糖類物質(zhì)結(jié)合形成[7]，單采用溶劑萃取無法得到，因此需先經(jīng)水解使細胞壁等物質(zhì)與多酚分離后再萃取?，F(xiàn)有的水解方式有酸水解法、酶水解法、堿水解法，其中堿水解法為研究最多的結(jié)合酚提取方式，酸水解法與酶水解法相對較少[8]，但對于上述3種水解方式目前尚未明確哪種最優(yōu)，關(guān)于水解方式對結(jié)合酚提取的影響仍需進一步探究。因此本研究通過正交試驗法聯(lián)合響應(yīng)面法對紫甘薯結(jié)合酚的提取工藝進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山東紫羅蘭紫甘薯、河北赤霞珠紅葡萄、江西信豐臍橙、乾縣紅富士蘋果、丹東九九草莓(采收時間：前三者為2018年10月、后兩者為11月)，市售；乙酸乙酯、甲醇，天津北科化學品有限責任公司；HCl、NaOH、Na2HPO4，北京新光化工試劑廠；纖維素酶(10 μg/mg)，日本Solarbio；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三吡啶基三嗪(TPTZ)，美國Sigma-Aldrich；FeCl3、乙醇、H2SO4、福林酚試劑、Na2CO3，沈陽化學試劑廠；沒食子酸、檸檬酸、醋酸鈉，上海吉至生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD 5-3型冷凍干燥機，美國SIM公司；GL-25 MS超速高速冷凍離心機，上海盛析儀器設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海皖寧精密科學儀器有限公司；TU-1800紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；PHS-25型酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；AL 204型分析天平，梅勒特-托利多儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，雙捷試驗儀器廠；增力電動攪拌器，江蘇金城國勝儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 游離酚及結(jié)合酚提取工藝

1.3.1.1 游離酚提取

參考譚暢[9]的方法并稍加修改。將紫甘薯或紅葡萄、草莓、橙子、蘋果的可食用部分洗凈并切為小塊薄片，經(jīng)凍干后粉碎過50目篩。取20 g凍干粉溶于500 mL體積分數(shù)為60%的乙醇溶液，在50 ℃中水浴2 h以提取游離酚。于4 000 r/min離心25 min，取上清液并用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7，以體積比1∶1加入乙酸乙酯萃取，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)萃取液后溶于體積分數(shù)為50%的甲醇溶液，再轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶內(nèi)定容，得游離酚的樣品溶液。凍干粉經(jīng)游離酚提取后，所得殘渣干燥(含結(jié)合酚)備用。

1.3.1.2 結(jié)合酚提取-酸水解法

將1.3.1.1所得殘渣以設(shè)定液料比加入體積分數(shù)為10% H2SO4溶液中，在設(shè)定溫度水解相應(yīng)時間后以4 000 r/min離心25 min，萃取及樣品溶液制備等步驟與上述游離酚提取相同。

1.3.1.3 結(jié)合酚提取-酶水解法

取1.3.1.1中殘渣與300 mL質(zhì)量分數(shù)為0.5 %的檸檬酸溶液混合，再加入設(shè)定質(zhì)量的纖維素酶并調(diào)節(jié)酶解pH值，于設(shè)定溫度下攪拌酶解，酶解一定時間后靜置冷卻，以4 000 r/min離心25 min，萃取及樣品溶液制備等步驟與上述游離酚提取相同。

1.3.2 游離酚及結(jié)合酚提取量測定

參考MUSCI等[10]的方法。從樣品溶液中吸取2.5 mL加至25 mL容量瓶定容，并取5 mL定容后樣液于試管中，加入0.5 mL福林酚試劑，再加0.5 mL Na2CO3溶液(1 mol/L)，混勻后靜置1 h，于725 nm測吸光度并以空白調(diào)零。樣品溶液中多酚濃度以沒食子酸(gallic acid equivalents, GAE)為標曲換算[10]，表示為毫克沒食子酸當量/mL樣品溶液(mg GAE/mL)，得線性方程：A=5.012C-0.014，R2=0.998 12，方程中為吸光度，為樣品溶液多酚濃度。再按下述公式(1)計算游離酚或結(jié)合酚提取量，結(jié)果表示為毫克沒食子酸當量/g干重(mg GAE/g DW)：

(1)

式中：C，多酚質(zhì)量濃度，mg GAE/mL；25，容量瓶容量，mL;2.5，樣品溶液吸取體積，mL；50，樣品溶液總體積，mL；20，凍干粉質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

1.3.3.1 酸水解法的單因素試驗

試驗固定條件為：水解時間30 h、液料比30∶1、水解溫度55 ℃，保持其余條件不變，分別以水解溫度、液料比、水解時間為變量進行單因素試驗?？疾旄饕蛩貙λ崴夥ńY(jié)合酚提取量的影響。

1.3.3.2 酶水解法的單因素試驗

試驗固定條件為：酶解時間50 min、酶解溫度40 ℃、酶添加量0.8%、酶解pH值4.5，保持其余條件不變，分別以酶解溫度、酶解時間、酶添加量、酶解pH值為變量，考察各因素對酶水解法結(jié)合酚提取量的影響。

1.3.4 正交試驗設(shè)計

以單因素試驗為基礎(chǔ)，選擇L9(34)正交表分別對酸水解法和酶水解法進行正交試驗設(shè)計，2種方法的因素水平表如表1、表2所示。

表1 酸水解法正交試驗因素水平表Table 1 Acid hydrolysis method orthogonal experimentalfactor level table

表2 酶水解法正交試驗因素水平表Table 2 Enzymatic hydrolysis method orthogonalexperimental factor level table

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化-酸水解法

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對酸水解法進行BOX-Behnken Design響應(yīng)面優(yōu)化。選取水解時間、水解溫度、液料比3因素，以結(jié)合酚提取量為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗因素水平及編碼如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗因素水平及編碼Table 3 Response surface test factor level and coding

1.3.6 DPPH自由基清除能力測定—DPPH法

參考馮悅等[11]的方法。將Trolox溶于體積分數(shù)為50%的甲醇溶液中，取等量的不同濃度Trolox或稀釋樣品與DPPH溶液混合后于暗處反應(yīng)30 min，后在517 nm測吸光值。以50%甲醇為空白，Trolox當量(trolox equivalents,TE)計算每克樣品干重的DPPH自由基清除能力(mg TE/g DW)。得y(吸光值)和x(Trolox濃度)方程：y=-12.317x+0.074 0，R2=0.987 1。

1.3.7 鐵離子抗氧化能力測定-FRAP法

參考SILVA等[12]的方法并稍做修改。試劑均現(xiàn)用現(xiàn)配，將醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)、TPTZ溶液(含TPTZ 10 mmol/L、HCl 40 mmol/L)、FeCl3溶液(20 mmol/L)以體積比10∶1∶1混合制得FRAP溶液并避光加熱至37 ℃。取稀釋樣品或不同濃度Trolox與FRAP溶液以體積比1∶9混合，于37 ℃下避光保持40 min后在593 nm測吸光值，以體積分數(shù)50%甲醇為空白，Trolox為當量(mg TE/g DW)，得y(吸光值)和x(Trolox濃度)方程：y=2.285x-340.131 6，R2=0.861 2。

1.3.8 紫甘薯結(jié)合酚提取物穩(wěn)定性試驗

1.3.8.1 pH對結(jié)合酚穩(wěn)定性影響

將酸水解法提取的結(jié)合酚樣品溶液pH用Na2HPO4和檸檬酸調(diào)節(jié)為1.0、3.0、5.0、7.0，并在65 ℃加熱2、4 h時記錄顏色、測定300～700 nm的最大吸收波長及對應(yīng)吸光值。

1.3.8.2 溫度對多酚保留率影響

將pH為3.0的樣品溶液分別于40、60、80、100 ℃加熱5 h，每1 h測定多酚保留量，并按公式(2)計算多酚保留率:

(2)

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次，表示為平均數(shù)±標準差。采用IBM SPSS Statistics 23進行單因素方差分析(ANOVA)及Turkey檢驗，顯著性水平為P<0.05，Origin 2018 64 Bit和Design-Expert.V8.0.6.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸水解法單因素試驗分析

酸水解法使糖苷鍵斷裂以提取結(jié)合酚[13]。圖1-A、圖1-B、圖1-C分別為水解時間、水解溫度、液料比等影響因素的單因素試驗結(jié)果。由圖1-A可知，25 h之前隨著酸水解法的水解時間延長，結(jié)合酚的提取量顯著增加(P<0.05)，這表明水解時間的延長有利于糖苷鍵的斷裂。在25 h達到最大值后，結(jié)合酚提取量稍有降低，這可能是由于加熱提取時間過長，釋放的結(jié)合酚在較高的酸水解溫度下降解[14]。由圖1-B可知，隨著水解溫度的逐漸升高，依據(jù)擴散原理，溫度升高時結(jié)合酚提取量應(yīng)逐漸升高[15]，而圖1-B中結(jié)合酚提取量呈先上升后下降的趨勢，這可能與多酚自身性質(zhì)有關(guān)，水解溫度升高有利于糖苷鍵斷裂，但溫度過高對釋放出的結(jié)合酚破壞效應(yīng)更明顯[14]。由圖1-C可知在液料比20∶1～30∶1，結(jié)合酚提取量顯著升高，而隨著液料比繼續(xù)增大，過量的溶劑對結(jié)合酚提取不顯示促進作用，這時結(jié)合酚提取量與液料比呈負相關(guān)。相似的，李興武等[16]也發(fā)現(xiàn)，溶劑比例過大導(dǎo)致提取茶多酚濃度降低。

A-水解時間；B-水解溫度；C-液料比圖1 酸水解法的單因素試驗Fig.1 Single factor experiment of acid hydrolysis注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 酶水解法單因素試驗分析

酶水解法一般通過特定的酶水解破壞細胞壁和細胞膜[8]。圖2-A、圖2-B、圖2-C、圖2-D分別為酶解溫度、酶解時間、酶添加量、酶解pH對結(jié)合酚提取量的影響。由圖2-A可知，酶解溫度50 ℃時結(jié)合酚的提取量最高，而其余溫度提取量均較低，這表明50 ℃下纖維素酶的活性適中，結(jié)合酚的溶出提取效果最好，當溫度過低或過高，纖維素酶的活性低，對細胞壁破壞程度不足，結(jié)合酚不易于溶出細胞。由圖2-B可知，最適酶解時間為60 min。酶解時間越長，細胞壁破壞程度越高，但結(jié)果表明，細胞壁破壞程度過高不利于結(jié)合酚提取，這可能是由于細胞內(nèi)容物對結(jié)合酚釋放有阻礙作用[17]，試驗現(xiàn)象也表明酶解時間越長，酶解所得溶液越稠。由圖2-C，隨酶添加量的增加，結(jié)合酚提取量呈上升后平緩趨勢，由此可見在底物濃度一定時，酶添加量升高有利于纖維素酶解，當酶添加量過多時，則不一定對酶解產(chǎn)生促進作用。由圖2-D可知，結(jié)合酚提取量隨酶解pH升高而逐漸降低。上述現(xiàn)象表明低pH環(huán)境更有利于結(jié)合酚提取，這可能是由于pH對酶活、多酚的穩(wěn)定性均有影響[18-19]。

A-酶解溫度；B-酶解時間；C-酶解添加量;D-酶解pH值圖2 酶水解法的單因素試驗Fig.2 Single factor experiment of enzymatic hydrolysis

2.3 正交試驗設(shè)計-酸/酶水解法

正交試驗可得最佳因素水平組合[18]。分別對酸水解法、纖維素酶水解法進行正交試驗，對2種方法的結(jié)合酚提取效果進行分析，綜合評價后選出較優(yōu)方法進行響應(yīng)面優(yōu)化。由表4、表5可知，酸水解法中影響結(jié)合酚提取量的主次因素為：C>B>A，最佳組合為A3B2C2，對應(yīng)的實際結(jié)合酚提取量為2.593 mg/g；酶水解法中影響的主次因素為：D>A>B>C，最佳組合為A2B3C3D1，對應(yīng)的實際結(jié)合酚提取量為1.987 mg/g。正交試驗中酸水解法結(jié)合酚提取量普遍高于酶水解法，這可能是由于酸水解法的酸性條件下多酚更加穩(wěn)定，而酶水解法時纖維素酶具有專一性使結(jié)合酚提取受限[20]。如進行綜合考量，酸水解法雖耗時，但具備生產(chǎn)穩(wěn)定且提取量較高的特點，纖維素酶水解法雖用時短，但提取量較低，生產(chǎn)成本高，酶的回收利用系統(tǒng)不完善[21]，因此選擇將酸水解法于響應(yīng)面中進一步優(yōu)化。

表4 酸水解法正交試驗設(shè)計結(jié)果表Table 4 Acid hydrolysis method orthogonalexperimental design result table

表5 酶水解法正交試驗設(shè)計結(jié)果表Table 5 Enzymatic hydrolysis method orthogonalexperimental design result table

2.4 響應(yīng)面分析-酸水解法

2.4.1 Box-Behnken設(shè)計(BBD)及響應(yīng)模型建立

選用BBD設(shè)計進行酸水解法試驗設(shè)計得到表6，建立響應(yīng)模型，得水解時間(A)、水解溫度(B)、液料比(C)和結(jié)合酚提取量(響應(yīng)值Y)的回歸方程為：Y=-57.154 38+0.286 03A+1.788 4B+0.115 37C-0.002 12AB+0.000 615AC+0.000 835BC-0.003 15A2-0.014 510B2-0.002 845C2。

表6 BBD試驗設(shè)計結(jié)果表Table 6 BBD experimental design results table

表7 回歸方程方差分析Table 7 Regression equation analysis of variance

2.4.2 響應(yīng)面分析優(yōu)化及模型驗證

根據(jù)回歸方程得到響應(yīng)面圖和等高線圖，由圖3-a、3-b、3-e、3-f可知，隨水解時間增加，不同水解溫度、液料比下的結(jié)合酚提取量均呈升高趨勢，這表明水解時間和溫度、水解時間和液料比間交互作用均不顯著。由圖3-c、3-d知，在不同液料比下，結(jié)合酚提取量均隨水解溫度升高，呈先升高后降低的趨勢，表明液料比及水解溫度間交互作用不顯著。

分析得到最佳因素參數(shù)為：水解時間28.19 h、水解溫度60.5 ℃、液料比32.2，預(yù)測得結(jié)合酚提取量2.829 mg GEA/g DW，為方便操作設(shè)置參數(shù)為：水解時間28.15 h、水解溫度60.5 ℃、液料比32，實際結(jié)合酚提取量(2.784±0.013) mg GEA/g DW，與預(yù)測值差1.6%，模型可以較好地進行預(yù)測。

a、b-水解溫度和水解時間；c、d-水解溫度和液料比；e、f-水解時間和液料比圖3 水解時間、水解溫度和液料比對結(jié)合酚提取量交互作用影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour maps of the effectsof hydrolysis time, hydrolysis temperature and liquid-to-liquid ratio on the bound phenolic compounds extraction

2.5 酸水解法工藝提取效果分析

紫甘薯多酚可分為游離酚、結(jié)合酚[2]。在游離酚提取的基礎(chǔ)上，再應(yīng)用酸水解法工藝提取結(jié)合酚，獲得總酚(即結(jié)合酚、游離酚之和)。因此游離酚量與總酚量的差異可表明酸水解法工藝對多酚提取量的影響，如表8，結(jié)合酚酸水解法提取使紫甘薯多酚提取量升高36.5%。相似的，PENG等[13]研究表明酸水解法有助于黑豆的總酚提取。

結(jié)合酚的酸水解法提取導(dǎo)致DPPH自由基清除能力、鐵離子抗氧化能力分別提高1.16、4.37 mg TE/g DW，這是由于紫甘薯結(jié)合酚具有抗氧化性[5]。

注：游離酚提取后，再應(yīng)用酸水解法進行結(jié)合酚提取以得到總酚。表9同。

水果是多酚的主要來源，尤其是漿果類水果(如葡萄、草莓等)的多酚含量更是豐富[22]。為探究酸水解法工藝是否也適用于其他富含多酚的水果，測定酸水解法工藝應(yīng)用前后多酚提取量及抗氧化性差異，如表9，酸水解法應(yīng)用后，蘋果與草莓多酚提取量升高均小于6%，2種方法所測抗氧化性增加均小于0.15 mg TE/g DW；紅葡萄與橙子多酚提取量升高均大于29%，2種抗氧化性增加均大于0.85 mg TE/g DW。上述分析表明，酸水解法結(jié)合酚提取工藝在紅葡萄與橙子的多酚提取中有一定應(yīng)用潛力。

表9 水果的游離酚量、總酚量及其抗氧化性測定結(jié)果Table 9 Determination of free phenolic amount, totalphenolic amount and its antioxidant activity of fruits

2.6 pH對酸水解法提取的紫甘薯結(jié)合酚穩(wěn)定性影響

由表10可知，pH為1.0、3.0的樣品經(jīng)4 h加熱后顏色、最大吸收波長均未發(fā)生改變，吸光值變化不顯著，這表明結(jié)合酚在pH為1.0、3.0條件下較穩(wěn)定。pH為5.0、7.0的樣品經(jīng)加熱后最大吸收波長未發(fā)生變化，但顏色變淺、吸光度下降顯著(P<0.05)，這表明pH為5.0、7.0條件下的結(jié)合酚較不穩(wěn)定[14]。出現(xiàn)表中結(jié)果的原因可能是紫甘薯多酚物質(zhì)中綠原酸、花色苷、槲皮素等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)受pH影響而發(fā)生改變[23-25]，進而對穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

表10 65 ℃下結(jié)合酚在不同pH條件的顏色、最大吸收波長及吸光值Table 10 Color, maximum absorption wavelengthand absorbance of bound phenolic compounds indifferent pH conditions at 65 ℃

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.7 溫度對酸水解法提取紫甘薯結(jié)合酚穩(wěn)定性影響

由圖4可知，在pH 3.0時加熱5 h，結(jié)合酚樣品在35、55 ℃的多酚保留率在90%以上，隨時間變化不顯著(P>0.05)，結(jié)合酚樣品能夠保持較高穩(wěn)定性。經(jīng)75、95 ℃加熱處理的多酚保留率隨時間延長不斷降低，但95 ℃熱處理1 h后多酚保留率也在60%以上，這表明結(jié)合酚的熱穩(wěn)定性較好[2]。上述現(xiàn)象的原因可能是結(jié)合酚在不同溫度處理下會得到不同的產(chǎn)物，高溫時可能發(fā)生降解，生成無色的原兒茶酸、對羥基苯甲酸及間苯三酚甲醛等[26]。

圖4 pH 3.0下不同溫度對結(jié)合酚的多酚保留率影響Fig.4 Effect of different temperatures on polyphenol retention rate of bound phenolic compounds at pH 3.0

3 結(jié)論

正交試驗中酸水解法的結(jié)合酚提取量普遍高于纖維素酶水解法。選擇酸水解法進行響應(yīng)面優(yōu)化，得到最佳參數(shù)：水解時間28.15 h、水解溫度60.5 ℃、液料比32∶1。實際結(jié)合酚提取量(2.784±0.013) mg GAE/g DW，與預(yù)測值差1.6%，模型可較好預(yù)測。

酸水解法工藝的加用使多酚提取量在單純的游離酚提取基礎(chǔ)上提升36.5%，DPPH自由基清除能力與鐵離子抗氧化能力也分別增加1.16、4.37 mg TE/g DW。此外，酸水解法工藝在水果多酚提取中也具有一定的應(yīng)用潛力。紫甘薯結(jié)合酚于65 ℃加熱4 h，pH較低時(1.0、3.0)穩(wěn)定，pH較高時(5.0、7.0)則不穩(wěn)定；結(jié)合酚在pH 3.0加熱5 h，多酚保存率在溫度較低時(35、55 ℃)保持在90%以上，結(jié)合酚有較高穩(wěn)定性，而溫度較高時(75、95 ℃)多酚保留率隨時間延長不斷降低，結(jié)合酚穩(wěn)定性降低。本研究可以為紫甘薯高附加值的精深加工提供一定理論依據(jù)。