李銳,張海玲,李旭艷,孫玉林,李興華,李想*
1(嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣東 湛江,524048)2(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,廣東 湛江,524088) 3(四川旅游學(xué)院,四川 成都,610100)
魚露又叫魚醬油或蝦醬油,主要是以低價值的魚蝦類(如沙丁魚、鯷魚、小蝦等)或水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物(魚頭、魚內(nèi)臟、蝦頭等)為原料,與食鹽按照一定的比例混合,通過原料中自身內(nèi)源酶和微生物的共同作用,經(jīng)過長時間(6~12月甚至更長時間)發(fā)酵后得到的一種調(diào)味品[1-3]。魚露滋味鮮美、香氣濃郁、營養(yǎng)豐富,富含人體所必需的8種氨基酸、生物活性肽和?;撬?,還含有礦物質(zhì)元素及多種維生素,深受國內(nèi)外人民的喜愛[4-5]。
目前生產(chǎn)魚露所使用的發(fā)酵方法主要有3種:傳統(tǒng)發(fā)酵法、快速發(fā)酵法和復(fù)合發(fā)酵法。傳統(tǒng)發(fā)酵法生產(chǎn)的魚露色澤紅亮、風(fēng)味濃郁,缺點在于生產(chǎn)周期長、含鹽量高[6]。針對傳統(tǒng)發(fā)酵法的弊端,快速發(fā)酵法逐漸成為魚露生產(chǎn)技術(shù)的研究熱點。一些學(xué)者研究了保溫發(fā)酵[7]、外加酶發(fā)酵[8]、加曲發(fā)酵[9]等方法,可以縮短魚露的生產(chǎn)周期,同時降低產(chǎn)品鹽度??焖侔l(fā)酵得到的產(chǎn)品,由于發(fā)酵時間不足,其風(fēng)味遠低于傳統(tǒng)法生產(chǎn)的魚露,因此近些年多采用傳統(tǒng)發(fā)酵與快速發(fā)酵結(jié)合的方法[10]。白政澤等[11]以秋刀魚為原料,采用加曲和保溫復(fù)合發(fā)酵法生產(chǎn)魚露,所得產(chǎn)品富有魚露特殊香氣,能達到商品要求,并且大大縮短了發(fā)酵周期。張雪花等[12]采用復(fù)合發(fā)酵法,以鰱魚及其加工副產(chǎn)物為原料,添加不同的醬油曲作為種曲,大大縮短了發(fā)酵時間,得到了風(fēng)味良好的魚露。目前國內(nèi)外關(guān)于魚露的研究多集中在制備工藝和品質(zhì)優(yōu)化,而關(guān)于魚露中鮮味物質(zhì)含量和組成的研究鮮有報道。
遠東擬沙丁魚(Sardinopssagax),又名斑點莎腦魚,價格低廉且資源豐富,年捕撈量達500萬t左右,通常加工為飼料,其資源并未得到充分利用[13]。本文以遠東擬沙丁魚為原料,通過傳統(tǒng)發(fā)酵法、快速發(fā)酵法和復(fù)合發(fā)酵法制備魚露,采用感官評價和理化指標(biāo)來分析3種發(fā)酵魚露中鮮味物質(zhì)的差異,以期為改進魚露的生產(chǎn)技術(shù)提供理論依據(jù)。
遠東擬沙丁魚(Sardinopssagax),購于廣東省茂名市博賀港,選擇平均體長15~18 cm的沙丁魚,置于加冰的密封泡沫箱中運至實驗室,然后分裝保存于-20℃?zhèn)溆?。食鹽(食品級),市售;面粉、豆粕,廣東正大康地有限公司;米曲霉AS3.951,購于中國微生物菌種保藏中心;風(fēng)味蛋白酶,廣西南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;甲醇、乙腈,均為色譜純;核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品(IMP、GMP、ATP、ADP、AMP、HxR、Hx,純度≥99.0%),美國Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
BSC-250型恒溫培養(yǎng)箱,上海博訊實業(yè)有限公司;L-8900型氨基酸分析儀,日本Hitachi公司;Agilent 1200型高效液相色譜儀,美國Agilent公司;LS-50LD型蒸汽滅菌鍋,江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;自動凱氏定氮儀,德國Thermo公司;PB-10型酸度計,德國SartoriuS公司;CF16RX型高速冷凍離心機,日本Hitachi公司;MBL50型高速均質(zhì)機,上海默格機械有限公司。
1.2.1 豆粕大曲制備
參照FENG等[14]的方法,稍作改動。取米曲霉AS3.951接種于豆汁斜面培養(yǎng)基上,置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,待菌種活化至斜面長滿綠色孢子后,取出備用。將60 g豆粕,15 g面粉和55 mL的水混合均勻,裝入三角培養(yǎng)瓶中,于121℃滅菌30 min,然后冷卻至40 ℃以下。將米曲霉接種于三角培養(yǎng)基中,搖勻后置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h,待菌體長出后搖動培養(yǎng)基,再次培養(yǎng)24 h,直至菌種長滿曲料。
1.2.2 魚露制備工藝
本研究分別采用傳統(tǒng)發(fā)酵法(traditional fermentation,TF)、快速發(fā)酵法(rapid fermentation,RF)和復(fù)合發(fā)酵法(compound fermentation,CF)制備遠東擬沙丁魚魚露,主要步驟如下:
(1)傳統(tǒng)發(fā)酵法
魚露由廣東省惠州大亞灣東泳魚露廠有限公司提供。冷凍沙丁魚先經(jīng)過解凍、清洗,瀝干水分后添加質(zhì)量分數(shù)為25%的食鹽混合均勻,于(30±5)℃溫度下自然發(fā)酵12個月,發(fā)酵期間每隔2 d攪拌1次。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液攪拌混勻,用定性濾紙過濾,取濾液保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
(2)快速發(fā)酵法
參照XU等[15]的方法,稍作改動。沙丁魚解凍、清洗并瀝干水分,先通過絞肉機粉碎成小塊,然后按m(沙丁魚)∶m(水)=1∶0.6加入蒸餾水混合,經(jīng)均質(zhì)機粉碎成肉糜。按魚體重的0.2%加入風(fēng)味蛋白酶,于50℃下攪拌酶解6 h,然后85℃滅酶20min。肉糜冷卻至30 ℃以下,然后按一定比例與豆粕大曲(m(沙丁魚)∶m(豆粕大曲)=1∶0.2)混合,于40 ℃靜置30min,然后按照混合物質(zhì)量的10%加入食鹽,混合均勻后置于35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱,靜置發(fā)酵30 d,發(fā)酵期間每隔2 d攪拌1次。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液先用200目紗布過濾,然后用定性濾紙過濾,取濾液保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
(3)復(fù)合發(fā)酵法
參照JOUNG等[16]的方法,稍作改動。將冷凍沙丁魚先解凍、清洗、瀝水,用絞肉機切成小塊,然后按照一定比例m(沙丁魚)∶m(蒸餾水)∶m(食鹽)=1∶0.5∶0.2添加蒸餾水和食鹽,用均質(zhì)機粉碎成肉糜,然后按一定比例與豆粕大曲m(沙丁魚)∶m(豆粕大曲)∶m(食鹽)=1∶0.2混合,于40 ℃靜置30 min?;旌衔镅b于發(fā)酵罐中,于(30±5)℃溫度下自然發(fā)酵210 d,發(fā)酵期間每隔2 d攪拌1次。自然發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵罐轉(zhuǎn)移至45℃的恒溫培養(yǎng)箱,繼續(xù)保溫發(fā)酵15 d。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液先用200目紗布過濾,然后用定性濾紙過濾,取濾液保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 樣品調(diào)配
3種發(fā)酵魚露含水質(zhì)量分數(shù)分別為:TF (67.54±1.35)%,RF (83.27±2.51)%,CF(78.86±1.09)%。由于樣品間的水分含量差異較大,無法直接比較三者鮮味物質(zhì)的差異,因此以含水量最高的RF為基準(zhǔn),將其他2種魚露稀釋至水分含量為83.27%。調(diào)配好的樣品儲存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.4 感官評價
魚露的感官評價參考JIANG等[17]的方法,采用定量描述分析法。感官評價前,3種魚露置于60℃恒溫水浴加熱10 min,然后稀釋10倍并用統(tǒng)一的容器盛裝50 g,隨機取樣進行感官評價。感官評定小組由12人組成(6男6女,年齡20~25歲),根據(jù)感官評定標(biāo)準(zhǔn)(表1),先多次對風(fēng)味描述進行統(tǒng)一認定和培訓(xùn),然后對每個樣品的風(fēng)味特征(鮮味,咸味,腥異味,香味,醇厚感,后味)進行評分,每項總分為10分,逐項評分后取平均值。在評價前12 h,禁止評價員吸煙、飲酒,吃刺激性食物。
表1 魚露感官評定標(biāo)準(zhǔn)表Table 1 Standard of sensory evaluation of fish sauces
1.2.5 總氮含量的測定
總氮的測定參照GB/T 5009.5—85中凱氏定氮法。
1.2.6 氨基態(tài)氮含量測定
氨基態(tài)氮含量的測定參考NILSANG等[18]的方法。
1.2.7 小分子肽含量的測定
小分子肽含量的測定參考JANG等[19]的方法。
1.2.8 游離氨基酸測定
魚露中游離氨基酸含量的測定參考李銳等[20]的方法。
1.2.9 呈味核苷酸測定
呈味核苷酸含量的測定參考李銳等[20]的方法。
1.2.10 味精當(dāng)量的測定
味精當(dāng)量(equivalent umami concentration,EUC)的測定參考YAMAGUCHI等[21]的方法。
1.2.11 滋味強度值的測定
滋味強度值(taste activity value,TAV)的測定參考YAMAGUCHI等[21]的方法。
實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(n=3),使用Origin 8.0和SPSS 22.0 軟件進行作圖和數(shù)據(jù)分析。
通過鮮味、咸味、腥異味、香味、醇厚感和后味5個方面來評價3種魚露的感官特征,結(jié)果如圖1所示。
圖1 三種發(fā)酵魚露的感官評價Fig.1 Sensory evaluation of fish sauces prepared by three fermentation processes
據(jù)報道,咸味和鮮味是魚露呈味的主體。魚露中的咸味物質(zhì)以NaCl主,而鮮味主要來自于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的鮮味和甜味氨基酸。此外,谷氨酸與呈味核苷酸及其鈉鹽的協(xié)同作用,以及小分子肽的增鮮作用,對魚露中的鮮味均有一定影響[22]。結(jié)果表明,不同發(fā)酵方法制備的魚露整體呈味特征都以鮮咸味為主。TF在鮮味、醇厚感和后味這3個方面要優(yōu)于其他2種魚露,其香味和腥異味的評分要稍弱于CF,而咸味的評分最低,可能是由于在發(fā)酵過程中添加大量食鹽導(dǎo)致最終產(chǎn)品咸味過重。有研究表明,發(fā)酵過程中高鹽濃度雖然抑制了魚自身蛋白酶活性,延長了發(fā)酵時間,但有利于嗜鹽和耐鹽微生物產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì),且發(fā)酵時間越長,風(fēng)味越好[23]。RF在生產(chǎn)過程中通過酶解和加曲的方法,加速蛋白分解從而大大縮短了發(fā)酵周期,同時降低了產(chǎn)品的含鹽量,咸味的評分要高于其他2種魚露,但其他5種感官特征評分均為最低,風(fēng)味整體較差。CF在香味和腥異味的評分最高,鮮味和醇厚感稍弱于TF,而在后味和咸味的評分較低。CF整體風(fēng)味要優(yōu)于RF,但在鮮味和后味與TF尚有一定差距。
魚露中總氮、氨基態(tài)氮和小分子肽含量是影響產(chǎn)品整體滋味和口感的重要因素??偪扇苄缘渴窃u判魚露質(zhì)量好壞的重要參考標(biāo)準(zhǔn),其主要來源于小分子肽、游離氨基酸等蛋白類氮以及尿素、三甲胺、二甲胺等非蛋白類氮[17]。如圖2所示,根據(jù)魚露的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10324—1999,3種魚露產(chǎn)品均達到魚露的商業(yè)一級標(biāo)準(zhǔn)。其中RF的總氮含量最高,為3.54 g/100 g,其次為TF(2.98 g/100 g),CF的含量最低(2.38 g/100 g)。魚露中的氨基態(tài)氮用來反映產(chǎn)品中小分子肽和氨基酸總體水平的重要指標(biāo),其含量對于產(chǎn)品的風(fēng)味層次和醇厚感有重要影響[24]。小分子肽是一種分子質(zhì)量介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間的物質(zhì),其鮮味要弱于氨基酸,能與其他呈味物質(zhì)相互協(xié)調(diào)賦予食物可口的味覺和令人愉悅的后味,如Glu-Glu與IMP有協(xié)同效應(yīng)[25-26]。
由圖2可知,在3種魚露中,TF中氨基態(tài)氮和小分子肽的含量最高,分別為0.94、1.43 g/100 g。RF中的總氮含量最高,但其氨基態(tài)氮(0.45 g/100 g)和小分子肽(0.77 g/100 g)的含量要低于其他2種魚露,CF介于2種魚露之間,含量分別為0.87、1.12 g/100 g。根據(jù)前人的報道,魚露中氨基酸的代謝過程與發(fā)酵過程中微生物活動密切相關(guān)。發(fā)酵液中大多數(shù)耐鹽酵母菌、耐鹽乳酸菌和醋酸菌等都有脫氨和脫羧作用[23]。在微生物的作用下,魚體中蛋白質(zhì)被降解,氨基酸和小分子肽的含量隨著發(fā)酵時間延長而增加。TF在生產(chǎn)過程中蛋白得以充分降解,能積累大量鮮味物質(zhì),產(chǎn)品風(fēng)味濃郁。CF由于發(fā)酵時間不足,鮮味物質(zhì)含量要稍低于傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品。而RF通過加曲和酶解的方法可以達到更高的總氮含量,但其中對呈味有重要作用的氨基態(tài)氮和小分子肽的含量并沒有得到顯著提升,這與感官評價的分析結(jié)果相一致。
圖2 三種發(fā)酵魚露中總氮、氨基態(tài)氮和小分子肽的含量Fig.2 Total nitrogen, amino nitrogen and oligopeptide content in fish sauces prepared by three fermentation processes
游離氨基酸是魚露中鮮味物質(zhì)的重要組成部分,也是評價其營養(yǎng)價值的重要標(biāo)準(zhǔn),同時能與食品體系中的其他成分協(xié)同,影響其整體風(fēng)味。在食品體系中,游離氨基酸的呈味特性與其含量、閾值密切相關(guān)。氨基酸中有一些能呈現(xiàn)特殊鮮味和甜味的L型天然氨基酸,如谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala),其中谷氨酸一鈉(MSG)是鮮味物質(zhì)的典型代表[27]。除此之外,苯丙氨酸和酪氨酸具有特殊的鮮甜味,對魚露的整體鮮味也有重要作用。
3種發(fā)酵魚露中游離氨基酸含量如表2所示。TF中游離氨基酸總量最高(108 695.08 mg/kg),其次為CF(84 521.13 mg/kg),而RF中總量最低(67 893.44 mg/kg)。根據(jù)GAO等[28]對不同游離氨基酸的呈味特性進行分類, 3種發(fā)酵魚露中,TF中鮮甜味氨基酸的比例最高,占總量的48.2%,這可能是其風(fēng)味要優(yōu)于其他兩種魚露的主要原因。在RF中,必須氨基酸的比例要高于其他2種產(chǎn)品,占總量的43.04 %,營養(yǎng)價值最高。在TF中,谷氨酸對整體的滋味貢獻最大,TAV值高達57.42,其次為賴氨酸和丙氨酸(26.46和17.35)。在RF中,苦味氨基酸的比例為47.44%,而鮮甜味氨基酸的比例僅為22.31%,對其滋味貢獻最大的氨基酸為精氨酸,TAV值為17.57,其次為谷氨酸(15.07)。RF中苦味氨基酸比例過高,是造成其風(fēng)味較差的重要原因。在CF中,鮮甜味氨基酸的比例為34.53%,苦味氨基酸比例為31.52%,對其滋味貢獻最大的氨基酸為精氨酸,TAV值為31.17,其次為谷氨酸(28.40)。精氨酸是略帶苦味的氨基酸,在較低濃度時與其他氨基酸相互協(xié)調(diào),可以增加產(chǎn)品的醇厚感,但濃度過高,會產(chǎn)生苦味[29]。由這些結(jié)果可知,在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中,魚露能積累較多的鮮甜味氨基酸,形成鮮美醇厚的滋味。而快速發(fā)酵法雖然能加速蛋白的水解,但同時產(chǎn)生較多的苦味氨基酸,影響魚露的產(chǎn)品風(fēng)味。復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)品中鮮甜味氨基酸與苦味氨基酸含量基本持平,其風(fēng)味較協(xié)調(diào)。
表2 三種發(fā)酵魚露中游離氨基酸的含量Table 2 The content of free amino acids in fish sauces prepared by three fermentation processes
注:鮮味氨基酸包括天門冬氨酸、谷氨酸;甜味氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸;必需氨基酸包括賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸;(+)為表示味道令人愉悅,(-)為表示味道不好。下同。
核苷酸及其關(guān)聯(lián)化合物是影響魚露中鮮味的另一關(guān)鍵成分。一般認為,鳥苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)具有突出的鮮味,是食品工業(yè)中常用的鮮味劑[27]。其中IMP具有呈味力強,呈味豐富等特點,一般認為是魚露發(fā)酵過程中耐鹽微生物的核苷酸酶分解作用產(chǎn)生的。AMP具有協(xié)調(diào)整體滋味的作用,能夠壓抑苦味增強整體的醇厚感,使食物產(chǎn)生較為柔和的甜味和鮮味。ATP降解得到的一種最終產(chǎn)物——次黃嘌呤會產(chǎn)生苦味,會使產(chǎn)物整體滋味變差[30-31]。
由表3結(jié)果可知,CF中核苷酸總量最高,為796.64 mg/kg,其次是TF,含量為775.82 mg/kg,而RF中含量最低,為579.86 mg/kg。與鮮味有著密切聯(lián)系的核苷酸有GMP、IMP和AMP,魚露中GMP對風(fēng)味貢獻最高,其中TF和CF中GMP的TAV值大于1,分別為1.71和2.64,對產(chǎn)品的鮮味有貢獻作用。研究表明,魚露中核苷酸的含量與自身降解作用以及微生物的次級代謝活動密切相關(guān)。據(jù)報道,在魚蝦貝等生物體內(nèi),ATP的降解存在兩條途徑[32]:(1)ATP→ADP→AMP→ADR→HxR →Hx;(2)ATP→ADP→ AMP→IMP→HxR→Hx。核苷酸的降解途徑以及降解程度對其含量和組成有較大影響。有研究表明,在魚露發(fā)酵中后期,耐鹽微生物在胞內(nèi)積累大量的小分子極性物質(zhì),如甘油、單糖、氨基酸、核苷酸及它們的衍生物作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),幫助細胞從高鹽環(huán)境中獲取水分[2]。這些次級代謝產(chǎn)物的積累,能促進魚露風(fēng)味的形成。伍蓉莉等[33]從魚露中分離出1株表皮葡萄球菌和4株嗜鹽四聯(lián)球菌,這些細菌具有產(chǎn)生核苷酸的能力。UCHIDA等[34]研究發(fā)現(xiàn),魚露發(fā)酵過程中微生物的生物合成途徑能產(chǎn)生核苷酸,高鹽環(huán)境和延長發(fā)酵時間有助于魚露積累更多的核苷酸物質(zhì)。發(fā)酵過程中含鹽量和發(fā)酵時間的不同,可能是造成3種發(fā)酵魚露中核苷酸含量差異的原因。
表3 三種發(fā)酵魚露中ATP以及關(guān)聯(lián)化合物的含量Table 3 Contents of ATP related compounds of fish sauces prepared by three fermentation processes
注:ND表示無檢出。
呈味核苷酸與鮮味氨基酸之間存在協(xié)同作用,相當(dāng)于一定濃度的味精所產(chǎn)生的鮮味強度,這種分析方法廣泛應(yīng)用于食品鮮味特征的研究中。有報道指出,IMP可以與甜味氨基酸(丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸)產(chǎn)生協(xié)同作用,使鮮味增強,甜味抑制劑也不能阻止這種效應(yīng)[21]。EUC值是基于游離氨基酸與呈味核苷酸之間相互作用,并以此進行大量的感官試驗后得到的綜合滋味評價指標(biāo),在食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用和認可。3種發(fā)酵魚露中EUC值如圖3所示,其EUC值均在10 g MSG/100 g以上,而TF中EUC值最高,為33.42 g MSG/100 g,其次為CF中EUC值為18.96 g MSG/100 g,RF中EUC值最低,為10.12 g MSG/100 g。味精的閾值僅為 3×10-4g/mL,TF中EUC分別為RF和CF的3.3倍和1.76倍,因此TF的鮮味程度遠高于其他2種魚露。
圖3 三種發(fā)酵魚露中的味精當(dāng)量Fig.3 Equivalent umami concentration of fish sauces prepared by three fermentation processes
鮮味是魚露質(zhì)量的重要參考標(biāo)準(zhǔn)之一。本實驗對傳統(tǒng)發(fā)酵法、快速發(fā)酵法和復(fù)合發(fā)酵法3種工藝生產(chǎn)的魚露中鮮味物質(zhì)進行比較分析,結(jié)果表明,3種魚露的感官特征均以鮮咸味為主,其中TF在鮮味、醇厚感和后味的評分最高。3種魚露總氮含量均達到魚露商業(yè)一級標(biāo)準(zhǔn),其中RF的總氮含量最高,而TF中氨基態(tài)氮和小分子肽的含量高于其他兩種魚露。TF中鮮甜味氨基酸的比例最高,占總量的48.2%。TF中鮮甜味氨基酸的比例最高,占總量的48.2%,其中谷氨酸對其整體的滋味貢獻最大,TAV值高達57.42,而RF和CF的魚露中精氨酸TAV值最高,分別為17.57和31.17。核苷酸中GMP對魚露滋味有重要影響,其中TF和CF中GMP的TAV值大于1,分別為1.71和2.64。3種魚露的EUC值均在10 g MSG/100 g以上,TF中EUC值最高,為33.42 g MSG/100 g。
快速發(fā)酵魚露在風(fēng)味方面遠遠不如傳統(tǒng)發(fā)酵法,復(fù)合發(fā)酵法兼顧了傳統(tǒng)發(fā)酵和快速發(fā)酵的優(yōu)點,但在總體風(fēng)味上與傳統(tǒng)發(fā)酵魚露尚有一定差距。低鹽化、風(fēng)味化是今后魚露生產(chǎn)的發(fā)展趨勢,采取相關(guān)有效措施改良速釀工藝,篩選產(chǎn)蛋白酶活力高、發(fā)酵產(chǎn)物鮮味醇厚、香味濃郁的菌種,優(yōu)選多種發(fā)酵方法相結(jié)合,將會成為研究魚露發(fā)酵的新方向。