黑曲霉脂肪酶tglE的基因克隆與生化特征解析

叢珊滋，田康明,2,3，張新，路福平,王正祥,2

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津，300457)3(北京農(nóng)學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，102206)

脂肪酶，三酰基甘油?；饷?EC.3.1.1.3)，可催化甘油三酯,使其水解為甘油和脂肪酸[1-2]。1834年，EBERLE首次在胰腺中發(fā)現(xiàn)脂肪酶，隨后，EIJKMANN首次分別從Serratiamarcescens、Pseudomonasaeruginosa和Pseudomonasfluorescens中分離到脂肪酶[3]。脂肪酶是繼蛋白酶和淀粉酶之后第三大工業(yè)化應(yīng)用酶制劑。脂肪酶不僅可催化水解反應(yīng)，還可催化無(wú)水混合物的合成反應(yīng)，包括酯化和酯交換(酸解、醇解)等[4-5]。因此，脂肪酶可應(yīng)用于食品、油脂加工、生物柴油、洗滌劑、生物醫(yī)藥、化妝品和皮革加工等工業(yè)領(lǐng)域[6-7]。

脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中[1-2]。微生物來(lái)源的脂肪酶因其催化特異性強(qiáng)、種類豐富、胞外分泌表達(dá)和易于回收等特征，成為脂肪酶最主要的來(lái)源[3]。2007年，黑曲霉CBS513.88基因組解析完成并公布[8]，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法預(yù)測(cè)到黑曲霉具有豐富的脂肪酶，但功能未知，絕大部分仍停留在生物信息學(xué)推斷水平與組學(xué)分析階段。我國(guó)學(xué)者于2007年進(jìn)行了黑曲霉F044脂肪酶的基因克隆和其在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源表達(dá)[9]；通過(guò)兩步基因合成優(yōu)化密碼子，實(shí)現(xiàn)了黑曲霉lip2基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)[10]；通過(guò)同源比對(duì)篩選黑曲霉中新型活性脂肪酶基因an1-1，并在EscherichiacoliBL21中實(shí)現(xiàn)表達(dá)[11]。2012年，NAKAJIMA-KAMBE等[12]克隆了A.nigerMTCC 2594中l(wèi)ipA基因，在畢赤酵母中表達(dá)，并研究了其在洗滌劑行業(yè)中的應(yīng)用潛力。

本研究在黑曲霉基因組分析的基礎(chǔ)上，對(duì)其中一個(gè)編碼功能未知的脂肪酶編碼基因tglE進(jìn)行了基因克隆和表達(dá)，并對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)和酯化功能進(jìn)行了解析。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉(A.niger)CICIM F0215由江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源與信息中心(http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)提供。大腸桿菌(E.coli)JM109、畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115和質(zhì)粒pPIC9k保藏于天津科技大學(xué)生物催化與生物轉(zhuǎn)化研究室。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶和LATaqDNA多聚酶，大連寶生物工程有限公司；T4DNA連接酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒、小量DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒和cDNA合成試劑盒(1ststrand cDNA synthesis kit)，ThermoFisher公司；G418，Invitrogen公司；氨芐青霉素鈉，Sigma公司；C4～C16系列對(duì)硝基苯酚羧酸酯，Sigma公司；其他生化試劑為分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.3 脂肪酶基因的生物信息分析

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查詢脂肪酶的氨基酸序列。序列比對(duì)采用Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序。信號(hào)肽分析采用SignalP 4.1軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。

1.4 黑曲霉脂肪酶基因克隆與表達(dá)

1.4.1 基因克隆與重組菌構(gòu)建

1.4.2 重組酶的制備與純化

根據(jù)畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)(Invitrogen EasyselectTMPichiaExpression Kit)制備發(fā)酵液。在4 ℃下，10 000g離心5 min，獲得粗酶液。進(jìn)一步利用硫酸銨沉淀、GE系列PD-10脫鹽柱除鹽和G75凝膠色譜法對(duì)酶液進(jìn)行純化，純化后經(jīng)冷凍干燥，留酶樣備用。通過(guò)SDS-PAGE分析蛋白純化情況，按照文獻(xiàn)方法[14]進(jìn)行。

1.5 重組酶酶活測(cè)定與酶學(xué)性質(zhì)分析

1.5.1 脂肪酶酶活測(cè)定方法

脂肪酶酶活測(cè)定參照GUPTA等方法，并作改進(jìn)[15]。在一定溫度和pH下，1 h生成1 μmol的對(duì)硝基苯酚為1個(gè)酶活力單位。

1.5.2 最適溫度

在不同溫度下(25～70 ℃)，測(cè)定重組脂肪酶tglE的酶活力。以最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5.3 最適pH

在不同反應(yīng)pH下(pH 4.0～10.0)，測(cè)定重組脂肪酶tglE的酶活力。以最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5.4 溫度穩(wěn)定性

將酶液分別放在不同溫度下(20～60 ℃)保溫，分別在不同時(shí)間取樣，測(cè)定殘余酶活。以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5.5 pH穩(wěn)定性

稱取一定量純化后的酶樣，用不同pH(pH 5.0～9.0)的緩沖液溶解(終濃度一致)，于室溫下放置，在不同時(shí)間取樣，測(cè)定殘余酶活。以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5.6 金屬離子及螯合劑對(duì)酶活力的影響

將酶液分別與不同的金屬離子、螯合劑混合，室溫放置2 h。測(cè)定不同金屬離子對(duì)酶活力的影響。金屬離子在反應(yīng)體系中的終濃度為1 mmol/L。以未加金屬離子的反應(yīng)體系的酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5.7 有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響

按照文獻(xiàn)[16]，在500 μL反應(yīng)體系中，加入40 μL酶液和10 μL有機(jī)溶劑，于150 r/min，30 ℃下放置2 h。測(cè)定殘余酶活力。以未加有機(jī)溶劑的反應(yīng)體系的酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5.8 底物特異性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

1.6 重組酶酯化活性鑒定

1.6.1 重組酶合成辛酸乙酯和乳酸乙酯

1.6.1.1 辛酸乙酯反應(yīng)體系

按照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。配制辛酸和無(wú)水乙醇摩爾濃度分別為1.2 mol/L和1.44 mol/L(溶劑為正庚烷)，分別加入2.5 mL制備好的辛酸和乙醇和10 mg酶粉，于40 ℃，150 r/min下振蕩反應(yīng)12 h，以高溫滅活的酶為對(duì)照。并離心，取上清液，留作氣相分析。

1.6.1.2 乳酸乙酯反應(yīng)體系

按照文獻(xiàn)[19]。配制乳酸和乙醇摩爾濃度分別為1.17 mol/L和4.68 mol/L，溶劑為叔丁醇，分別加入5 mL制備好的乳酸和乙醇和10 mg酶，于40 ℃，150 r/min反應(yīng)12 h。以高溫滅活的酶為對(duì)照。并離心，取上清液。留作氣相分析。

1.6.2 辛酸乙酯和乳酸乙酯的檢測(cè)

采用氣相色譜法進(jìn)行。檢測(cè)條件是：色譜柱為HP-INNOWax，30 m×0.32 mm×0.5 μm毛細(xì)血管柱，檢測(cè)器為FID。進(jìn)樣口的溫度為200 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃，H2流量為40 mL/min，空氣流量為300 mL/min，尾吹流量為25 mL/min。進(jìn)樣量條件：進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1。載氣為N2，色譜柱流速為0.8 mL/min。升溫程序：起始柱溫50 ℃，保持8 min，以5 ℃/min的速度上升至200 ℃，保持5 min[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉脂肪酶基因克隆及重組菌的獲得

依據(jù)黑曲霉CBS 513.88基因組序列信息(EMBL AM270980-AM270998)并采用Blast等分析方法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)疑似編碼脂肪酶的基因，但功能未知。為此以黑曲霉F0215的cDNA為模板，對(duì)該基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增(如圖1-A)，并命名為tglE，將其連接到載體pPIC9K上，獲得重組質(zhì)粒pPIC-tglE，使用限制性內(nèi)切酶SalI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，獲得2條大小約為7.6 kb和2.5 kb的條帶(如圖1-B)。經(jīng)進(jìn)一步序列測(cè)定與分析發(fā)現(xiàn)，tglE編碼的氨基酸序列與黑曲霉CBS 513.88基因組中相應(yīng)序列僅有1個(gè)氨基酸殘基存在差異(在275位上，CBS 513.88基因序列堿基為C， F0215基因序列堿基為G)，該差異導(dǎo)致了1個(gè)氨基酸序列不同(在92位上，CBS 513.88的氨基酸殘基為S，F(xiàn)0215的氨基酸殘基為C)，但其對(duì)酶催化活性中心(S139、D195、H248)、GXSXG保守序列和“蓋子”結(jié)構(gòu)無(wú)影響(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。重組質(zhì)粒pPIC -tglE使用限制性內(nèi)切酶SacI進(jìn)行線性化，轉(zhuǎn)化在畢赤酵母GS115中，獲得了tglE重組菌，命名為ANL-TglE。

M-DNA Marker;A1-tglE;B1-pPIC-tglE/Sal I圖1 目的基因及重組質(zhì)粒驗(yàn)證電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of target gene andrecombination vectors

2.2 重組酶的制備與純化

根據(jù)畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)，制備發(fā)酵酶液，酶液經(jīng)硫酸銨沉淀、PD-10脫鹽柱除鹽和G75凝膠色譜純化后，在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶(圖2)。重組酶tglE的分子質(zhì)量約為32 kDa，略大于預(yù)測(cè)的28 kDa，可能與重組酶tglE表達(dá)過(guò)程中被糖基化修飾有關(guān)。純化后的tglE，其比酶活為136.42 U/mg，純化倍數(shù)和得率分別為13.95倍和13.36%(表1)。

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1-GS115發(fā)酵液;2-ANL-tglE發(fā)酵液;3-純化后的脂肪酶tglE圖2 脂肪酶tglE SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE analysis of tglE

表1 脂肪酶tglE的純化結(jié)果Table 1 Purification on tglE

2.3 黑曲霉脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)解析

2.3.1 最適溫度和最適pH

在不同溫度或pH下測(cè)定tglE的酶活。當(dāng)溫度高于25 ℃時(shí)，酶活力開(kāi)始急劇上升，在40 ℃時(shí)達(dá)到最大酶活力，超過(guò)40 ℃后，酶活力開(kāi)始下降(圖3-A)，表明40 ℃為該酶的最適溫度。在30～60 ℃之間，該酶的酶活力保持在60%以上。當(dāng)溫度在25 ℃或者高于65 ℃，酶活力低于50%。當(dāng)pH高于5.5，酶活力急劇上升，在pH為7.0時(shí)，達(dá)到最大酶活力，在pH 6.5～9.0之間，酶活力保持在60%以上(圖3-B)?？梢?jiàn)，該酶的最適溫度和pH分別為40 ℃和7.0。

圖3 tglE的最適作用溫度和最適作用pHFig.3 The optimum temperature and pH of tglE

2.3.2 熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

tglE在不同溫度或pH下孵育，定時(shí)取樣檢測(cè)殘余酶活。tglE在20 ℃和30 ℃時(shí)，4 h內(nèi)殘余酶活均在80%以上；隨著溫度的上升，酶活力下降速率明顯上升；在30 ℃以下保溫3 h，tglE的殘余酶活力高于60%(圖4-A)。tglE在pH為7.0的緩沖體系下最穩(wěn)定，4 h內(nèi)殘余酶活在80%以上；在3 h內(nèi)，該酶在pH為6.0～8.0的緩沖體系中，殘余酶活均大于60%(圖4-B)?？梢?jiàn)，該酶在20～30 ℃和pH 6.0～8.0穩(wěn)定性良好。

圖4 tglE溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性Fig.4 Effect of temperature and pH on enzymestability of tglE

2.3.3 金屬離子及螯合劑對(duì)重組脂肪酶活力的影響

將tglE與金屬離子或螯合劑混勻，反應(yīng)的終濃度為1 mmol/L，保溫2 h。Ca2+、Sn2+、K+、Cu2+、Mg2+、Mn2+對(duì)TglE的水解活性有促進(jìn)作用，其中Ca2+的促進(jìn)作用最明顯；Fe3+、Zn2+和EDTA對(duì)酶的水解活性有抑制作用，其中EDTA最強(qiáng)(表2)。EDTA為金屬離子螯合劑，可吸附體系中的金屬離子，嚴(yán)重抑制酶的水解活性，表明脂肪酶tglE屬于金屬酶。

表2 金屬離子及EDTA對(duì)tglE的影響Table 2 Effects of metal ions and chelate agent on theactivities of tglE

2.3.4 有機(jī)溶劑耐受性分析

將tglE與有機(jī)溶劑混合(有機(jī)溶劑占總體積的20%)。庚烷、甲醇和二甲基亞砜對(duì)tglE的水解活性有一定的促進(jìn)作用；乙酸甲酯、十二烷則對(duì)該酶有抑制作用。甲苯、乙腈、乙醇、丙酮、四氯化碳、正己烷和氯仿對(duì)酶有輕微抑制作用(圖5)。

圖5 有機(jī)溶劑對(duì)tglE酶活的影響Fig.5 Effects of organic solvent on the activities of tglE

2.3.5 底物特異性分析

tglE水解不同碳鏈長(zhǎng)度合成底物發(fā)現(xiàn)，其最適反應(yīng)底物為C4，其次依次為C8、C12、C2和C16(圖6)。

圖6 tglE脂肪酸特異性Fig.6 Substrate specificity of tglE

酶對(duì)C2-C16底物均有不同程度的水解作用，說(shuō)明該酶具有寬底物譜。以不同濃度的對(duì)硝基苯酚丁酸酯為底物，采用雙倒數(shù)法，繪制tglE的動(dòng)力學(xué)曲線，求得tglE的Km值為14.40 mmoL/L，Vmax為46.72 mmol/(mL·h)。

tglE對(duì)于不同的植物油，酶活力不同(圖7)。其中以橄欖油為底物時(shí)，酶活最高，表明tglE對(duì)橄欖油的水解程度最高；以棕果油和菜籽油為底物時(shí)，酶活較低，相對(duì)于橄欖油為底物時(shí)，酶活分別為45%和47%，表明該酶對(duì)菜籽油和棕果油的水解程度較低；對(duì)其他植物油的水程度略有不同，相對(duì)于以橄欖油為底物，其水解活性在65%～85%之間。

2.4 酯化活性鑒定

以辛酸、乳酸和乙醇為底物，利用tglE催化合成乳酸乙酯和辛酸乙酯，經(jīng)氣相色譜檢測(cè)可知，酶可合成2種酯，但合成辛酸乙酯的效率要明顯高于乳酸乙酯(圖8)。其中，合成乳酸乙酯和辛酸乙酯的轉(zhuǎn)化率，分別為0.45%和12.40%。

圖7 tglE天然底物特異性Fig.7 Natural substrate specificity of tglE

圖8 tglE催化合成乳酸乙酯和辛酸乙酯氣相圖Fig.8 GC profiles of synthesis of ethyl lactate and ethyl caprylate by tglE

3 結(jié)論

本研究對(duì)黑曲霉F0215來(lái)源的但功能未知的一種脂肪酶進(jìn)行分子克隆、異源表達(dá)，首次系統(tǒng)地解析了該脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)并研究其酯化活性。經(jīng)克隆表達(dá)與純化后，該酶的比酶活為137.08 U/mg，純化倍數(shù)為13.95倍，得率為13.36%，與前人在其它脂肪酶研究的結(jié)果類似[21]。研究中發(fā)現(xiàn)，EDTA明顯抑制tglE的水解活性，提示該酶是一種金屬酶，后續(xù)將進(jìn)一步就這一屬性進(jìn)行深入分析。本研究獲得的tglE具有較好的有機(jī)溶劑的耐受性，與來(lái)源于Proteussp. SW1[22]、Acinetobactersp. XMZ-26[23]和StaphylococcusepidermidisAT2[24]脂肪酶相似。這一屬性使其在有機(jī)相催化反應(yīng)中，具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。tglE對(duì)C4底物表現(xiàn)出最高的水解活性，以C4為底物時(shí)的Km為14.40 mmol/L，Vmax為46.72 mmol/(mL·h)；對(duì)不同的天然植物油也表現(xiàn)出不同的水解活性。這一屬性與來(lái)源于Yersiniaenterocolitica[25]、Psychrobacterpacificensis[26]、Candidarugosa[27]和Geotrichumcandidum[27]的脂肪酶相似。且本文鑒定出的tglE，具有較好的低溫合成辛酸乙酯的酯化活性，預(yù)示著該酶在相關(guān)食品加工中也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。