酸肉發(fā)酵中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化及對品質(zhì)的影響

范曉文，常榮，趙珠蓮，周才瓊,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

酸肉是利用微生物自然發(fā)酵而成的、流行于渝黔川湘等地的少數(shù)民族及少數(shù)民族與漢族雜居地區(qū)的一種傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵肉制品；通過發(fā)酵產(chǎn)酸形成了酸肉特殊的風(fēng)味、色澤和質(zhì)地。傳統(tǒng)酸肉采用發(fā)酵的方式長期保藏，直至食用完畢，發(fā)酵時長至半年或更長。目前關(guān)于酸肉的報道主要集中在酸肉發(fā)酵工藝的優(yōu)化、酸肉發(fā)酵過程中品質(zhì)特點及酸肉發(fā)酵中的優(yōu)勢菌群篩選及鑒定[1-4]、酸肉長時間發(fā)酵中蛋白質(zhì)的變化對酸肉品質(zhì)影響的報道[5-6]，有少量酸肉揮發(fā)性風(fēng)味的報道，黃群等[7]實驗分析了烹飪前后酸肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究；陳曦等[8]實驗表明了植物乳酸菌影響酸肉的風(fēng)味品質(zhì)，而對于酸肉在長時間發(fā)酵保藏過程中風(fēng)味品質(zhì)的變化研究未見報道。

為此，擬采用渝黔地區(qū)傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵工藝制備酸肉并以發(fā)酵的方式保藏酸肉，以SPME[9]結(jié)合GC-MS聯(lián)用法系統(tǒng)分析酸肉在長時間發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，并結(jié)合模糊數(shù)學(xué)感官評價研究酸肉的感官接受性。從風(fēng)味和感官品質(zhì)角度研究傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵保藏中的品質(zhì)變化，為傳統(tǒng)酸肉以發(fā)酵的方式保藏提供有關(guān)風(fēng)味化學(xué)的研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮豬肉、湖北秈米、食鹽，重慶北碚區(qū)天生永輝超市。

米粉制備，大米置于鍋中，炒至微黃，自然冷至室溫，粉碎過40目篩備用。

1.2 試劑與儀器

2,4,6-三甲基吡啶(色譜純)，日本TCI公司。FA2004A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；GC-MS2010氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；固相微萃取，美國Supelo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

新鮮豬肉，洗凈切薄片，加入5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))食鹽和10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))米粉后揉制裝壇，用新鮮棕葉塞住壇口，倒置，20%鹽水密封，于(20±3)℃條件下控溫發(fā)酵。分別取不同發(fā)酵時段樣品(肥瘦各半)，于-18℃冰箱保存?zhèn)溆茫?℃解凍后分析。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

SPME-GC-MS聯(lián)用法。準(zhǔn)確稱取樣品2 g(精確到0.001)置20 mL螺口玻璃瓶中，用聚四氟乙烯襯里的硅橡膠墊密封。吸附前加入2,4,6-三甲基吡啶3 μg為內(nèi)標(biāo)。然后用手動固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)進樣器，靜態(tài)頂空法吸附40 min后，進行GC-MS分析。

色譜條件：色譜柱：HP-5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)。載氣為氦氣，流量1.0 mL/min，不分流，進樣口溫度250℃，進樣解析5 min。升溫程序：起始溫度35℃，保持3 min后以3℃/min升溫速度升至90℃后保持1 min，再以10℃/min升溫速度升至140 ℃后保持1 min，最后以7 ℃/min升溫速度升至250 ℃，保持1 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度260℃，離子源溫度260℃，電子能量70 eV，掃描速率0.5 s/scan。

定性定量：標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST05和Wiley對化合物進行檢索匹配，選擇匹配度>80物質(zhì)并參考相關(guān)文獻定性；內(nèi)標(biāo)法定量，根據(jù)公式(1)進行計算：

(1)

特征揮發(fā)性風(fēng)味成分[10]：根據(jù)參考文獻各揮發(fā)性物質(zhì)風(fēng)味閾值，計算出表征風(fēng)味化合物的貢獻大小的氣味活性值(odor activity value，OAV)。

1.3.3 感官評價

感官評價小組的建立參考文獻[11]；模糊數(shù)學(xué)模型的建立參考文獻[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理，Origin 8.0進行作圖。使用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析(Tukey法，P≤0.05)、載荷分析和主成分分析(principal component analysis,PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在酸肉發(fā)酵中的變化

不同發(fā)酵時段的酸肉進行GC-MS分析后得到了各階段的總離子流色譜圖見圖1?？梢钥闯鏊崛庠诎l(fā)酵保藏過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)存在差異，表明發(fā)酵保藏過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生了動態(tài)變化。定性定量分析結(jié)果見表1，隨發(fā)酵進行，酸肉揮發(fā)性物質(zhì)種類數(shù)增加。全發(fā)酵時段共檢出104種風(fēng)味物質(zhì)，分別為碳?xì)浠衔铩⒋碱?、酸類、醛、酮、酯?/p>

和其他類。如表2所示，碳?xì)浠衔铩⑼?、酯類在發(fā)酵各階段差異性顯著(P≤0.05)；醇類、醛類、酸類、其他類在發(fā)酵各階段差異性不顯著(P≥0.05)。這些風(fēng)味物質(zhì)的變化表明酸肉在發(fā)酵加工中的品質(zhì)形成以及采用發(fā)酵方式保藏中品質(zhì)的持續(xù)變化。

a-發(fā)酵0 d;b-發(fā)酵30 d;c-發(fā)酵60 d;d-發(fā)酵90 d;e-發(fā)酵120 d;f-發(fā)酵150 d;g-發(fā)酵180 d圖1 酸肉不同發(fā)酵時段的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of different fermentation stages of sour meat

表1 酸肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵中的變化Table 1 Changes of volatile flavor substances in sour pork fermentation

續(xù)表1

序號保留時間/化合物名稱發(fā)酵時間/d序號保留時間/化合物名稱發(fā)酵時間/dmin0306090120150180min03060901201501801127.409十二烷-0.080.03----636.125十一酸-------1227.4112,3,5-三甲基癸烷--0.040.190.220.320.04736.132十四烷酸---0.530.220.280.291327.5838-甲基-1-癸烯-----0.07-838.5752,3,4-三甲基戊酸------0.031427.7092,4,4-三甲基己烷-----0.05-939.076正十六酸---2.060.40.850.261527.8582,6,10-三甲基十三烷-----0.76-1041.7629,12-十八碳二烯酸---0.06---1628.0612,6,10,15-四甲基十七烷-----0.430.121141.845十八酸-------1728.2583,3-二甲基己烷-----0.13-酯類(37種)1828.9331-(己基氧基)-3-甲基己烷-0.06-----14.026丙酸乙酯---1.59---1928.9462,4 -二甲基-1-癸烯-------215.008N-己酸乙烯酯-0.270.12----2029.582十五烷------0.02315.667己酸乙酯-2.320.552.782.862.262.092129.592十六烷---0.03--0.19417.642草酸環(huán)丁基辛酯----0.04--2230.8013,7-二甲基壬烷-0.230.040.070.060.120.02520.494己酸叔戊酯-0.08-----2331.0491-氯十二烷-----0.10.04620.5己酸丙酯-----0.08-2431.5782,6,10-三甲基十二烷-0.03-0.120.130.1-720.651庚酸乙酯-0.08-0.30.27-0.062533.43,8-二甲基癸烷---0.12--0.09824.775甲酸辛酯-----0.22-2633.404二十七烷-------924.922辛酸乙酯-1.560.374.782.643.53.372734.1963,9-二甲基十一烷0.010.030.010.04-0.09-1026.326己酸丁酯----0.060.13-2834.4833,8-二甲基十一烷------0.021126.334己酸異戊酯-----0.13-醇類(13種)1226.383己酸2-甲基丁酯-----0.05117.6223,5-辛二烯-2-醇--0.07----1326.726亞硫酸-2-乙基己酯-----0.12-220.4915-甲基-2-己烯-4-醇---1.03---1426.867亞硫酸丁基戊酯-------320.4934-5-二甲基-2-庚烯-3-醇--0.07----1526.875草酸戊酯----0.01--420.9862-烯丙基-1-醇-----0.89-1627.172亞硫酸-2-乙基己基異己酯-----0.16-524.7673-甲基-1-己醇------0.11727.326壬酸乙酯-0.080.01--0.38-625.2053-甲基-1,5-戊二醇-----0.15-1827.917癸酸甲酯-----0.57-726.6431-十一醇-0.09---0.22-1929.3069-癸烯酸乙酯-0.240.051.010.481.021.02828.9422-丁基-1-辛醇--0.04----2029.477癸酸乙酯-1.380.445.483.499.015.4931.043,7-二甲基-1-辛醇---0.05---2130.532辛酸3-甲基丁酯-----0.03-1031.053,7-二甲基-1,7-辛二醇----0.02--2233.279十二酸乙酯----1.811.84-1134.6032-丁基-1-辛醇------0.022333.29十一酸乙酯-0.020.010.26--0.571236.7942-異丙基-5-甲基-1-己醇0.01------2435.137亞硫酸-2-乙基己基壬酯---0.230.190.330.51339.5831,14-十四烷二醇---0.07---2535.145亞硫酸-2-乙基己基十一酯0.040.090.04-0.150.22-醛類(18種)2636.581十四酸乙酯---0.530.662.960.7413.633戊醛---0.27---2736.778亞硫酸丁基癸酯---0.06--0.1126.501己醛3.241.712.488.234.18-3.22836.783亞硫酸丁酯壬基酯----0.05--310.832庚烷醛---0.38---2937.613鄰苯二甲酸二異丁基酯------0.07413.4912-庚烯醛-0.480.414.40.89-1.13037.618鄰苯二甲酸4-溴苯基庚酯-----0.07-513.675苯甲醛------0.483138.567十三酸甲酯-----0.04-615.848辛烷醛0.07-0.161.530.95-1.673239.2139-十六碳烯酸乙酯---0.870.461.580.41717.827苯乙醛---0.44--0.293339.501十五烷酸乙酯-------818.6232-辛烯醛0.080.180.232.870.580.430.583439.508十六酸乙酯---0.990.64.010.79920.975壬醛0.220.770.423.031.68-1.573541.761亞油酸乙酯-----0.43-1023.6762-壬烯醛------0.273641.841(E)-9-十八碳烯酸乙酯-----1.47-1123.6872-壬醛--0.04-0.31--3742.185二十烷酸乙酯-0.090.02--0.14-1225.5252,4-壬二烯醛---0.350.08--其他類(4種)1326.623癸醛---1.270.07-3.3711.467L-丙氨酸乙酰胺-0.004-0.04-13.97-1426.6542-癸醛----0.58--215.092-戊基呋喃-0.32-----1527.8432,4-癸二烯醛---1.971.69-2.96315.1132,4,6-三甲基吡啶1.51.51.51.51.51.51.51628.8652-十二烯醛--0.050.750.420.30.46420.4752-丁基四氫呋喃-------1736.98十七醛---0.560.490.9-1839.922十五醛-0.120.030.060.040.090.3

表2 酸肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵期間的顯著性差異Table 2 Significant differences in the fermentation of sour meat volatile flavors during fermentation

注：ND表示未檢測到；不同小寫字母表示不同時期揮發(fā)性成分差異顯著，P<0.05。

2.1.1 揮發(fā)性成分種類及含量在發(fā)酵中的變化

酯類、醛類、酮類、碳?xì)浠衔锖退犷愇镔|(zhì)逐漸增加，發(fā)酵90 d時揮發(fā)性物質(zhì)總數(shù)較高并保持穩(wěn)定(圖2)。前期研究顯示酸肉合適發(fā)酵加工時段在30 d左右，不宜超過60 d[13-14]。為此，我們比較分析發(fā)酵30 d和后期以發(fā)酵方式保藏酸肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化。

酯類隨發(fā)酵快速增加，30 d時檢出12種，隨后波動變化并在90 d后持續(xù)增加，30～180 d，酯類數(shù)占比為27.3%～46.3%，含量占比為29.0%～75.3%。數(shù)量和含量首個峰值出現(xiàn)在發(fā)酵30 d，這也是酸肉風(fēng)味形成的適合發(fā)酵加工時間，發(fā)酵保藏酸肉至90 d后，含量和種類繼續(xù)上升，150 d時含量最高。己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯在整個過程中均有檢出且含量較高。己酸乙酯有曲香和菠蘿香型香氣，辛酸乙酯有白蘭地酒香味，癸酸乙酯有果香和酒香氣，共同促成了酸肉特色香味。

醛類在發(fā)酵中先增加后趨緩，90 d達峰值，主要有戊醛、己醛、庚醛、2，4-癸二烯醛等。其中2，4-癸二烯醛是亞油酸降解產(chǎn)物，有強雞香和雞油香味，對肉的特征香氣形成有一定作用，同時它在熱反應(yīng)作用下會繼續(xù)降解，最終生成乙醛和己醛等[15]。有報道2-庚烯醛、2-辛烯醛、苯甲醛、乙酸、己酸、2-辛烯酸、戊烷等物質(zhì)也都是2，4-癸二烯醛降解中間產(chǎn)物[16]。此外，辛醛有強的干酪味，苯乙醛氣味香甜，有玫瑰香味和發(fā)酵韻味[17]，共同促成了酸肉特色香味。

碳?xì)浠衔?、酸類物質(zhì)種類和含量隨發(fā)酵進行均有一定增加。碳?xì)浠衔锔咧党霈F(xiàn)在發(fā)酵150 d，主要是不具芳香性的1,3,5,7-環(huán)辛四烯；酸類主要有辛酸、正癸酸、正十六酸、十二酸等。辛酸在高濃度時有不舒適氣味，稀釋后有水果香味，己酸、癸酸、正十六酸、十二酸等屬動物油脂氧化降解的產(chǎn)物，也是酯類物質(zhì)形成的重要反應(yīng)物[18]，同時也有助于形成酸肉特有的酸味。酸類含量在發(fā)酵過程中呈波動變化，說明脂肪的氧化、酯類物質(zhì)的合成、醛類物質(zhì)的生成都處在動態(tài)變化過程中。

圖2 揮發(fā)性物質(zhì)種類在酸肉發(fā)酵中的變化Fig.2 Changes of volatile compounds variation in sour pork fermentation

圖3 揮發(fā)性物質(zhì)含量在酸肉發(fā)酵中的變化Fig.3 Changes of volatile matter content in sour pork fermentation

2.1.2 特征性風(fēng)味成分在酸肉發(fā)酵中的變化

以O(shè)AV≥1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對風(fēng)味有顯著貢獻，0≤OAV<1的風(fēng)味物質(zhì)對整體風(fēng)味有修飾和改善作用進行分析[19]，結(jié)果見表3。發(fā)酵30 d時，酸肉中共13種特征風(fēng)味性物質(zhì)，在發(fā)酵30～90 d，酸肉中共有22種特征性風(fēng)味物質(zhì)，其中己醛、2-庚烯醛、2-辛烯醛、壬醛等4種醛類和己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等3種酯類化合物是酸肉在不同發(fā)酵期共有的特征性風(fēng)味物質(zhì)，它們的OAV值均遠(yuǎn)大于1，說明這些物質(zhì)對酸肉整體上風(fēng)味的貢獻比較大。發(fā)酵30 d后，呈味特征為椰香和脂肪味的癸酸乙酯對酸肉風(fēng)味貢獻最大，說明發(fā)酵保藏階段在微生物作用下，酸肉脂肪和蛋白質(zhì)降解以及美拉德反應(yīng)發(fā)生[20]，發(fā)酵肉香成為酸肉主體風(fēng)味。不同發(fā)酵時期的酸肉也有其特有的風(fēng)味成分，己酸戊酯是發(fā)酵30 d時的特有物質(zhì)，其主體風(fēng)味為菠蘿味、蘋果味等水果香味，但其OAV值較低，對酸肉風(fēng)味只是輔助作用。丙酸乙酯、苯乙醛、2，4-辛二烯醛、癸醛、棕櫚酸乙酯等是發(fā)酵90 d時酸肉中的特有成分，丙酸乙酯、苯乙醛、2，4-辛二烯醛分別呈菠蘿味、玫瑰味、黃瓜味等清香味，且OAV值均超過1，對酸肉風(fēng)味貢獻較大，這些清香味道可緩解酸肉脂肪的油膩感。

2.1.3 酸肉特征風(fēng)味的剖面分析

由圖4-a可知，酸肉發(fā)酵30 d青草味占主導(dǎo)位置，90 d后脂肪味的風(fēng)味物質(zhì)含量占主導(dǎo)位置，這可能與脂肪的氧化有關(guān)，同時各類特征性風(fēng)味物質(zhì)含量均最高。由圖4-b可知，青草味和脂肪味的風(fēng)味化合物OAV值在各發(fā)酵階段占主導(dǎo)位置，由于某些脂肪味化合物的閾值較低，所以脂肪味成為酸肉各發(fā)酵階段主要特征風(fēng)味，同時有青草味及瓜果清香等味道輔助，構(gòu)成了酸肉獨特的風(fēng)味特征。

a-特征風(fēng)味含量;b-特征風(fēng)味OVA值圖4 酸肉不同發(fā)酵時段特征風(fēng)味變化Fig.4 Profile analysis of characteristic flavor content and OAV value of sour pork

表3 不同發(fā)酵期的酸肉的氣味活性值及其風(fēng)味描述Table 3 OAVs and flavor description of sour meat in different fermentation periods

注：編號中Z表示酯類，X表示烯類，Q表示醛類，S表示酸類，W表示烷烴類，T表示酮類。

2.1.4 酸肉發(fā)酵期間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

采用SPSS 24.0軟件以7個不同時段7類香氣構(gòu)成7×7矩陣對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行主成分分析，提取出前 2個主成分。由表4可知，第一主成分與碳?xì)浠衔镱?、醇類、酯類和其他類高度正相關(guān)，酯類對第一主成分貢獻最大；載荷量0.932；第二主成分與酮類、酸類高度正相關(guān)，酮類對第二主成分貢獻最大，載荷量0.979。

表4 酸肉發(fā)酵期間主成分的特征向量與載荷Table 4 Characteristic vector and load of principal components during sour meat fermentation

根據(jù)表1各時期樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量、表4兩個主成分特征向量和載荷值對酸肉進行主成分分析，見圖5。PC1和PC2貢獻率分別為54.5%和31.3%，累計貢獻率85.8%，說明前兩個主成分能較客觀反映發(fā)酵過程中原有變量信息，可知不同發(fā)酵時段主成分存在差異。揮發(fā)性成分載荷分析(圖6)顯示酮類在第2主成分上起主要作用，對發(fā)酵60 d酸肉風(fēng)味起作用較大；酯類和醇類對發(fā)酵30 d和150 d時酸肉風(fēng)味起的作用較大；碳?xì)浠衔锖推渌悓Πl(fā)酵120 d和180 d酸肉風(fēng)味起較大的作用；酸類對90 d時酸肉的風(fēng)味作用較大；醛類對未發(fā)酵肉的風(fēng)味起的作用較大。以發(fā)酵的方式保藏酸肉，受微生物及產(chǎn)酸引發(fā)的持續(xù)降解作用，酸肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及特征風(fēng)味處于動態(tài)變化中，這些變化可能影響感官可接受性。

2.2 不同發(fā)酵時段酸肉感官評價

各發(fā)酵階段酸肉感官接受度模糊數(shù)學(xué)感官評價得到對應(yīng)的等級票數(shù)分布見表5。結(jié)合表5，計算色澤、香氣、滋味、口感質(zhì)地的得分集合，通過取各等級分?jǐn)?shù)中間值為該等級得分，即V={9，7，5，2}，再將綜合評分結(jié)果集中的各數(shù)值分別乘以各等級相應(yīng)分值并進行加和，不同發(fā)酵時間酸肉總得分見圖7。酸肉發(fā)酵30 d時且繼續(xù)發(fā)酵保藏到90 d時為良好，60 d感官評價最高。發(fā)酵保藏到120 d后的酸肉感官評分快速下降，不被感官評價員所接受。

圖5 酸肉發(fā)酵期間揮發(fā)性成分PCA圖Fig.5 PCA map of volatile components during sour fermentation

圖6 酸肉不同發(fā)酵期間揮發(fā)性成分載荷分析圖Fig.6 Analysis of the loading of volatile components during different fermentations of sour meat

表5 不同發(fā)酵時段酸肉感官評價票數(shù)分布Table 5 Vote distribution of sensory evaluation of sour meat

注：V1、V2、V3和V4分別代表優(yōu)、良、中和差；編號1～6分別表示發(fā)酵30、60、90、120、150、180 d的酸肉樣品。

圖7 不同發(fā)酵時段酸肉綜合感官評價得分及排名Fig.7 Comprehensive sensory evaluation score of sour meat in different fermentation periods

3 結(jié)論

酸肉在長時間不同發(fā)酵時段的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量均處于動態(tài)變化中，這些變化導(dǎo)致酸肉以發(fā)酵的方式保藏時不同時段的風(fēng)味差異。結(jié)合特征風(fēng)味成分變化、剖面分析及主成分分析顯示不同種類的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對各發(fā)酵時段酸肉的影響程度，表明酸肉在發(fā)酵加工中的品質(zhì)形成以及采用發(fā)酵方式保藏中品質(zhì)的持續(xù)變化。綜合酸肉發(fā)酵中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化及模糊數(shù)學(xué)感官評價，酸肉以發(fā)酵方式保藏時間不宜超過90 d，以發(fā)酵60 d左右風(fēng)味品質(zhì)較好，當(dāng)發(fā)酵保藏超過120 d時可接受性快速下降，至150 d時不被接受。