低頻超聲靶向微泡破壞技術(shù)的協(xié)同抗腫瘤機(jī)制研究及應(yīng)用進(jìn)展

牛梓涵，趙辰陽，姜玉新

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，北京 100730

近半個(gè)世紀(jì)以來惡性腫瘤的發(fā)病率、死亡率不斷增高，在全世界范圍嚴(yán)重威脅著人類健康。國家癌癥中心發(fā)布了2015年全國368個(gè)腫瘤登記處(共覆蓋人口309 553 499人)惡性腫瘤的發(fā)病率為285.83/10萬，死亡率為170.05/10萬，且不論城市還是農(nóng)村，惡性腫瘤都是中國居民歸因死亡的主要原因[1- 2]。目前臨床上抗腫瘤主要方法有手術(shù)、化療、放療、免疫治療，然而，每種治療方法都有其局限性，手術(shù)治療難以徹底治愈轉(zhuǎn)移的腫瘤組織；化療具有全身毒性、低選擇性、耐受性；放療會(huì)出現(xiàn)放射性皮炎、骨髓抑制等毒副作用；免疫療法會(huì)產(chǎn)生皮膚、胃腸、肝等臟器毒性。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前提出了“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”的概念，即針對(duì)腫瘤特征進(jìn)行個(gè)體化、精準(zhǔn)化治療，可顯著提高惡性腫瘤的治療效果[3]。低頻超聲靶向微泡破壞技術(shù)(low-frequency ultrasound-targeted microbubble destruction，LF-UTMD)作為一種精準(zhǔn)治療腫瘤的方式得到發(fā)展，提高了腫瘤區(qū)域活性物質(zhì)遞送效率、減少了正常組織中藥物的副作用。本文主要綜述LF-UTMD的協(xié)同抗腫瘤的機(jī)制研究及應(yīng)用進(jìn)展。

LF-UTMD

低頻超聲(low-frequency ultrasound，LFUS)作為一種安全、非侵入性的方式在超聲介導(dǎo)的藥物輸送中有巨大潛力，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤診斷治療學(xué)[4]，一般認(rèn)為用于治療腫瘤的頻率低于2 MHz，其具有穿透力強(qiáng)、衰減少、可聚焦深部局部組織的特點(diǎn)。微泡(microbubbles，MBs)是一種超聲顯像的造影劑，外殼由磷脂、表面活性劑、白蛋白等構(gòu)成，中心填充高分子量氣體，直徑小于10 μm，性質(zhì)穩(wěn)定。經(jīng)外周循環(huán)靜脈注射后對(duì)腫瘤組織進(jìn)行顯像，最終通過肺循環(huán)代謝出體外，具有安全、無毒害等優(yōu)點(diǎn)[4]。將LFUS與MBs相聯(lián)合，即LF-UTMD，可使灌注于特定部位的微泡在超聲波輻照下發(fā)生物理生物效應(yīng)，使致密結(jié)締組織和細(xì)胞膜等屏障破壞，是一種高效、無創(chuàng)遞送外源性物質(zhì)到特定部位的有效方式[5]。

LF-UTMD協(xié)同抗腫瘤的作用機(jī)制

LF-UTMD作用機(jī)制復(fù)雜，存在空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，其中空化效應(yīng)起重要作用?？栈?yīng)是指液體中的微小氣泡(空化核)在超聲波的照射下被激活，出現(xiàn)震蕩、膨脹、收縮、崩潰等一系列動(dòng)力學(xué)過程。同樣，超聲造影劑中MBs也可作為空化核在超聲作用下被激活增強(qiáng)空化效應(yīng)，從而產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)，可破壞組織屏障、提高包膜滲透性、促使局部血管破裂閉塞等[6]?？栈?yīng)的同時(shí)產(chǎn)生聲孔效應(yīng)使細(xì)胞膜表面形成微孔，直徑為幾至150 nm，有利于藥物通過該微孔進(jìn)入細(xì)胞。此外，熱效應(yīng)導(dǎo)致局部瞬態(tài)溫度升高，影響磷脂雙層流動(dòng)性，進(jìn)而影響細(xì)胞通透性[4，6- 8]。

LF-UTMD提高運(yùn)轉(zhuǎn)效率，促進(jìn)化學(xué)、基因、免疫治療MBs除用于檢測(cè)組織灌注情況外，還可作為活性物質(zhì)(如基因、藥物、蛋白質(zhì)等)載體，在LFUS作用下，MBs發(fā)生破裂，在提高包膜滲透性的同時(shí)，釋放附著在MBs上的外源性物質(zhì)，使之更易進(jìn)入腫瘤組織發(fā)揮作用，通過提高轉(zhuǎn)運(yùn)效率增強(qiáng)化學(xué)、基因、免疫治療[9]。 將納米顆粒包裹活性物質(zhì)通過物理或化學(xué)方式連接到MBs表面，或?qū)⒑奢d活性物質(zhì)的微泡制成納米顆粒，更有利于活性物質(zhì)腫瘤部位的積累和運(yùn)轉(zhuǎn)。納米顆粒具有低致病性、低免疫原性、生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)，可延長血液循環(huán)時(shí)間，通過高通透性和滯留效應(yīng)(腫瘤微血管通透性增加和淋巴回流不良)提高腫瘤周圍納米顆粒濃度。此外，納米顆粒的直徑是細(xì)胞直徑的1/60～1/60 000，有助于其進(jìn)入細(xì)胞和組織內(nèi)部[10- 12]。

LF-UTMD增強(qiáng)化學(xué)治療：將化療藥物與微泡連接，可降低化療藥物的副作用，提高治療效果和用藥安全性[5，13]。Goertz等[14]用多西他賽(docetaxel，DTX)聯(lián)合LFUS(1 MHz)對(duì)荷前列腺癌小鼠進(jìn)行治療，LFUS+MBs-DTX組在第4～6周腫瘤縮小，相對(duì)于僅LFUS+MBs組和僅DTX組，可顯著抑制腫瘤生長，延長存活時(shí)間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。UTMD因其具有無侵入性、可局部用藥的特點(diǎn)，作為一種抗腫瘤的給藥方式得到了越來越多的關(guān)注。Lentacker等[15]通過制備含阿霉素(doxorubicin，DOX)脂質(zhì)體的微泡，在體外LFUS(1 MHz)照射下用于治療黑色素瘤細(xì)胞，與DOX-脂質(zhì)體相比，使用微泡負(fù)載的DOX-脂質(zhì)體在殺死的黑色素瘤細(xì)胞至少要多兩倍。Chen等[16]制備了負(fù)載阿霉素脂質(zhì)納米粒及其與微泡復(fù)合物聯(lián)合LFUS(1 MHz)治療荷肝腫瘤VX2新西蘭兔，相比僅接受生理鹽水治療的對(duì)照組，負(fù)載阿霉素脂質(zhì)納米粒組及其與微泡復(fù)合物組細(xì)胞凋亡率增高，且與微泡復(fù)合物組細(xì)胞凋亡率明顯高于負(fù)載阿霉素脂質(zhì)納米粒組，表明LF-UTMD技術(shù)提高了化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)效率，在腫瘤治療中發(fā)揮了重要作用。

LF-UTMD增強(qiáng)基因治療：MBs帶正電荷脂質(zhì)基團(tuán)通過靜電相互作用可將質(zhì)粒DNA偶聯(lián)到微泡表面，在UTMD作用下實(shí)現(xiàn)向深部腫瘤細(xì)胞特異性運(yùn)送基因，同時(shí)非靶向區(qū)域中的質(zhì)粒被降解，有助于提高基因轉(zhuǎn)染效率[17]。Chang等[18]將微泡和wtp53質(zhì)粒合成一種靶向微泡制劑，在LFUS(1 MHz)照射下，體外治療卵巢癌細(xì)胞，結(jié)果顯示與其他治療組相比，使用LF-UTMD可使質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率增多，細(xì)胞凋亡率顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在LF-UTMD作用下可將基因包裹于納米微膠囊內(nèi)治療腫瘤。Sonoda等[19]體內(nèi)外研究表明，在LFUS(1 MHz)作用下包裹于納米微膠囊的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)移到兔角膜細(xì)胞的含量顯著增加，且沒有明顯的組織損傷。

LF-UTMD促進(jìn)免疫治療：免疫治療中的免疫因子(如癌癥疫苗、抗體、細(xì)胞因子等)可負(fù)載到微泡上激活免疫反應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用，直接攻擊腫瘤細(xì)胞而不損傷正常細(xì)胞。微泡脂質(zhì)體與LFUS聯(lián)合應(yīng)用可作為腫瘤免疫治療的一種有效的給藥方式，目前已開發(fā)出多種基于微泡脂質(zhì)體納米顆粒的藥物傳遞系統(tǒng)[20]。Suzuki等[21]發(fā)現(xiàn)負(fù)載白介素(interleukin，IL)- 12的微泡脂質(zhì)體與LFUS(1 MHz)結(jié)合能有效地將IL- 12基因?qū)肽[瘤組織，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，顯著抑制腫瘤生長。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)作為一種獨(dú)特的抗原遞呈細(xì)胞可有效誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)反應(yīng)[22]。Oda等[23]和Suzuki等[ 24]采用外源性卵清蛋白(ovalbumin，OVA)作為抗原和微泡脂質(zhì)體(bubble liposomes，BLs)制成納米顆粒，經(jīng)過LFUS(2 MHz)照射，發(fā)現(xiàn)OVA利用DCs抗原遞呈系統(tǒng)直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)作為內(nèi)源性抗原誘導(dǎo)抗腫瘤的CTLs反應(yīng)，該研究開發(fā)了一種利用BLs和LFUS將抗原導(dǎo)入DCs的新系統(tǒng)，用于基于DCs的癌癥免疫治療。

LF-UMMD技術(shù)可以增加藥物、基因、抗體和細(xì)胞因子等轉(zhuǎn)運(yùn)效率，降低對(duì)正常組織的損傷，增強(qiáng)化學(xué)、基因、免疫療法，在癌癥免疫治療中具有巨大潛力。

LF-UTMD抑制腫瘤新生血管生成，增強(qiáng)抗血管治療與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞快速增殖(直徑超過100～200 μm)需要新生血管提供充足的氧氣和營養(yǎng)，在各種細(xì)胞因子共同作用下腫瘤組織生成發(fā)育不成熟、結(jié)構(gòu)不規(guī)則的新生血管，使腫瘤組織易于缺氧和壞死，增加腫瘤的惡性程度，降低治療效果。1972年?？寺岢隹寡苤委?，通過抑制新生血管可減少腫瘤細(xì)胞的增殖[25- 27]。UTMD導(dǎo)致腫瘤新生血管形成局部血栓、毛細(xì)血管不可逆性擴(kuò)張、細(xì)胞間質(zhì)水腫，為抗血管治療提供了一種物理途徑[28]。Liu等[29]使用LFUS(831 KHz)治療大鼠Walker 256腫瘤，超聲造影結(jié)果顯示當(dāng)聲強(qiáng)為4.8 MPa時(shí)，腫瘤組織循環(huán)可以完全阻斷24 h，組織學(xué)顯示腫瘤微血管系統(tǒng)彌漫性血管破壞。

內(nèi)載抗血管生成藥物的微泡與超聲空化治療同時(shí)使用可增強(qiáng)抗腫瘤效果。Zhang等[30]和Huang等[31]探討同時(shí)給予抗血管生成藥物和LFUS(238 KHz)對(duì)人結(jié)腸癌(細(xì)胞株HT29-GFP)小鼠模型的療效，結(jié)果顯示LFUS照射下裸微泡對(duì)腫瘤的抗血管作用僅持續(xù)7 d后血流恢復(fù)正常，但使用連接抗血管藥物恩度的微泡聯(lián)合UTMD治療未見血流恢復(fù)，對(duì)腫瘤生長的抑制作用大于裸微泡，表明LF-UTMD可增加抗血管生成藥物的藥理活性，增強(qiáng)治療效果。

因此，LF-UTMD為抗血管治療提供了一種新的、簡便的物理方法。

LF-UTMD在抗腫瘤中的應(yīng)用進(jìn)展

LF-UTMD技術(shù)應(yīng)用于聲動(dòng)力治療1989年，Yumita等[32]觀察到血卟啉在超聲作用下具有細(xì)胞毒性作用。Umemura等[33]于1992年提出了“聲動(dòng)力治療”這一術(shù)語來描述卟啉在超聲空化效應(yīng)下的毒性作用。近年來很多研究通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)聲動(dòng)力治療(sonodynamic therapy，SDT)在腫瘤治療中有廣闊的前景[8]。UTMD作用于相關(guān)物質(zhì)可釋放活性氧(reactive oxygen species，ROS)殺死腫瘤細(xì)胞，這類物質(zhì)稱為聲敏劑。聲敏劑在UTMD作用下吸收能量發(fā)生電子躍遷，從低能態(tài)激發(fā)到高能態(tài)，當(dāng)電子回到低能態(tài)時(shí)，釋放出大量ROS，可使腫瘤細(xì)胞膜破壞、線粒體腫脹和染色質(zhì)凝集[8]。Wang等[34]使用低頻超聲(1.43 MHz)照射原卟啉IX治療荷肝癌(H- 22)實(shí)體瘤小鼠，15 d后腫瘤體積抑制率為53.84%，處死小鼠后計(jì)算腫瘤重量抑制率為45.86%。

SDT常用的聲敏劑有無機(jī)聲敏劑和有機(jī)聲敏劑兩種，將聲敏劑包裹或連接在納米顆粒上可改善有機(jī)聲敏劑疏水性、延長血液循環(huán)時(shí)間[10]。有研究使用LFUS(1 MHz)照射載有新型聲敏劑微泡復(fù)合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行治療，體外實(shí)驗(yàn)中載有新型聲敏劑微泡復(fù)合物聯(lián)合LFUS可顯著改變細(xì)胞形態(tài)，促使線粒體損傷、細(xì)胞凋亡，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可明顯抑制腫瘤生長[35]。

因此，LF-UTMD技術(shù)可實(shí)現(xiàn)SDT，并在抗腫瘤中發(fā)揮巨大作用。

多功能載體協(xié)同治療在抗腫瘤中的應(yīng)用進(jìn)展由于腫瘤具有復(fù)雜性、多樣性和異質(zhì)性，目前臨床研究的趨勢(shì)已逐漸從單一治療轉(zhuǎn)向協(xié)同治療，以提高治療效果。協(xié)同治療即聯(lián)合兩種或兩種以上的治療方式，可產(chǎn)生顯著的超相加效應(yīng)(即“1+1>2”)[36]。近年來，納米材料除具有高轉(zhuǎn)運(yùn)率、高效藥物荷載率的特點(diǎn)外，還可將多種類型的治療劑通過物理吸附和化學(xué)結(jié)合力組裝在一起，形成多功能納米顆粒，為協(xié)同治療的實(shí)現(xiàn)構(gòu)建一體化平臺(tái)[37]。

以聲敏劑、微泡為基礎(chǔ)，聯(lián)合化療藥物、基因、免疫因子、抗血管藥物構(gòu)建多功能納米顆粒，可實(shí)現(xiàn)SDT+化療/基因/免疫/抗血管協(xié)同治療。McEwan等[38]將聲敏劑玫瑰紅(rose bengal，RB)和化療藥物5-氟尿嘧啶連接到內(nèi)芯為氧氣的MBs表面，在LFUS(1 MHz)照射下對(duì)人胰腺癌模型(BxPc- 3)進(jìn)行體內(nèi)外治療，結(jié)果顯示相比于僅RB組、僅MBs組和含六氟化硫MBs-RB組，含氧MBs-RB組治療效果顯著，含氧MBs-RB在通過增加腫瘤附近氧氣輸送量促進(jìn)ROS生成的同時(shí)，SDT和化療聯(lián)合運(yùn)用也顯著提高了腫瘤的治療效果。高慧潔等[39]將化療藥物多西環(huán)素聯(lián)合聲敏劑Ce6在LFUS(1 MHz)照射下體外對(duì)人乳腺癌MDA-MB- 231細(xì)胞進(jìn)行治療，相比對(duì)照組，SDT聯(lián)合化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。

此外，在SDT基礎(chǔ)上可聯(lián)合其他非侵入性治療，如光動(dòng)力治療(photodynamic therapy，PDT)、光熱治療(photothermal therapy，PTT)，從而構(gòu)建致敏劑(聲敏劑/光敏劑/熱敏劑)+藥物/基因/免疫因子/抗血管藥物的多功能納米顆粒，實(shí)現(xiàn)SDT/PDT/PTT+化療/基因/免疫/抗血管治療的協(xié)同治療。 Zhao等[40]制備負(fù)載小干擾核糖核酸(small interfering ribonucleic acid，siRNA)、卟啉的微泡，在LFUS(1.03 MHz)和激光照射下治療乳腺癌，卟啉被激活實(shí)現(xiàn)SDT、PDT，同時(shí)siRNA下調(diào)叉頭框架蛋白A1(forkhead-box protein A1，F(xiàn)OXA1)的表達(dá)，從而抑制雌激素依賴性乳腺癌細(xì)胞的增殖、實(shí)現(xiàn)基因治療，相對(duì)于單獨(dú)療法，SDT+PDT+基因治療大大提升了對(duì)乳腺癌的治療效果。Miyoshi等[41]使荷鱗狀細(xì)胞癌小鼠口服兩種增敏劑，0.2% 二氧化鈦納米粒子用于SDT和1 mmol/L 5-氨基乙酰丙酸用于PDT，相比單一治療組，SDT聯(lián)合PDT組ROS產(chǎn)生最多，腫瘤活性顯著下降，對(duì)腫瘤治療效果最強(qiáng)。Nomikou等[42]研制了一種具有聲敏劑、光敏劑雙重效果的由血卟啉和吲哚菁綠構(gòu)成的多功能生物可降解納米顆粒，研究表明相比單一治療組，在低頻超聲(1 MHz)和激光聯(lián)合作用下該納米顆粒產(chǎn)生的活性氧顯著上升、腫瘤細(xì)胞活力顯著下降。Han等[43]研究顯示氧缺乏黑鈦可作為同時(shí)聲動(dòng)力治療和光熱治療的納米制劑，體外細(xì)胞水平和體內(nèi)荷瘤小鼠異種移植瘤的系統(tǒng)評(píng)價(jià)表明SDT(1 MHz)和PTT具有很高的協(xié)同效應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)腫瘤的完全根除且無明顯的復(fù)發(fā)，證明PTT與SDT聯(lián)合應(yīng)用在腫瘤治療中的優(yōu)越性。

低頻超聲作為一種非侵入性、安全的治療方式在癌癥治療中顯示出巨大的潛力。低頻超聲靶向微泡破壞技術(shù)通過空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)提高包膜通透性，增強(qiáng)藥物、基因、免疫治療；通過物理方式破壞腫瘤新生血管系統(tǒng)，增強(qiáng)抗血管治療法。此外，低頻超聲靶向微泡破壞技術(shù)可激活相關(guān)致敏物質(zhì)實(shí)現(xiàn)聲動(dòng)力治療，通過釋放活性氧局部精準(zhǔn)殺傷腫瘤細(xì)胞。納米技術(shù)的快速發(fā)展使多種類型的治療劑通過物理吸附和化學(xué)結(jié)合力組裝成多功能納米顆粒，可產(chǎn)生顯著的超相加效應(yīng)，為實(shí)現(xiàn)多模態(tài)協(xié)同治療奠定了基礎(chǔ)，協(xié)同治療在抗腫瘤中發(fā)揮了巨大作用。低頻超聲靶向微泡破壞技術(shù)為腫瘤靶向治療提供了新思路，具有廣闊應(yīng)用前景。