蜜蜂腸道菌群結構功能研究進展

吳雨祺，鄭宇斐，鄭火青，胡福良

(浙江大學動物科學學院，杭州 310058)

腸道菌群是動物消化道中復雜的微生物群落的統(tǒng)稱。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)動物腸道內(nèi)的微生物與宿主的關系不僅僅是單純的共棲，有些微生物對宿主有著多種有益的作用，包括參與食物的消化(Nikohetal.,2011)、分泌多種有益的物質(zhì)(Shinetal.,2011)、分解有毒成分(Ceja-

Navarroetal.,2015)等。除此之外，腸道菌群還參與調(diào)控宿主的生理(Buchonetal.,2009)、發(fā)育(Storellietal.,2011)、免疫(Kaltenpoth and Engel,2014)，是宿主正常發(fā)育和健康生活不可或缺的參與者。

昆蟲是陸地生態(tài)系統(tǒng)中生物數(shù)量、種類以及生態(tài)習性最為豐富的動物類群，也是生物多樣性最高的群體之一(Chapman,2013)。由于昆蟲與人類健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著密切的聯(lián)系，針對昆蟲腸道微生物的研究一直廣受關注。2007年，有學者首次報道了蜜蜂腸道菌群的組成(Cox-Fosteretal.,2007)，此后大量的研究展現(xiàn)了蜜蜂腸道菌群對其宿主的重要作用(Kwong and Moran,2016;Bonilla-Rosso and Engel,2018;Raymann and Moran,2018)。作為一種重要的經(jīng)濟昆蟲和模式生物(鄭火青和胡福良，2009；Zhengetal.,2018)，蜜蜂具有很高的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值，對其腸道菌群功能的研究能使我們對蜜蜂生物學有更進一步了解，同時蜂群飼養(yǎng)管理與生產(chǎn)等方面具有重要意義。因此，本文對近幾年西方蜜蜂腸道菌群及其功能研究進行綜述，以期為相關領域的進一步研究提供借鑒。

1 蜜蜂腸道菌群的組成

與大多數(shù)昆蟲不同，蜜蜂屬下各個成員的腸道菌群的組成表現(xiàn)出高度的保守性和特殊性(Kwongetal.,2017b)。基于16s rRNA測序技術的研究顯示，西方蜜蜂成年工蜂的腸道菌群主要由9種細菌組成(Kwong and Moran,2016;Kwongetal.,2017b)，其中5種為蜜蜂的核心菌種，大量穩(wěn)定的存在于蜜蜂的腸道中，包括：β-變形菌綱的Snodgrassellaalvi、γ-變形菌綱的Gilliamellaapicola、厚壁菌門乳桿菌屬的LactobacillusFirm-4與LactobacillusFirm-5以及放線菌門的Bifidobacteriumspp.；此外還有γ-變形菌綱的Frischellaperrara、葡糖桿菌屬的Commensalibactersp.、醋桿菌科的Parasaccharibacterapium和巴爾通氏體屬的Bartonellaapis這4種普遍存在的菌種。這9種細菌組成了蜜蜂腸道菌群的主要菌群。這些細菌主要定植于工蜂的后腸(Martinsonetal.,2012;Powelletal.,2014)，其中S.alvi和G.apicola主要存在于回腸中，而LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5和Bifidobacteriumspp.則主要分布于直腸(Martinsonetal.,2012;Kwongetal.,2017b)，在蜜囊和中腸中則只有非常少量的細菌存在(Martinsonetal.,2012)。

針對西方蜜蜂工蜂生長發(fā)育過程中腸道菌群變化的研究顯示，與成年工蜂不同，工蜂幼蟲并沒有一個穩(wěn)定的腸道菌群組成(Martinsonetal.,2012)。而由于蛹期蜜蜂器官的重構，新羽化出房的工蜂體內(nèi)也幾乎沒有細菌的存在(Martinsonetal.,2012)，之后隨著工蜂在巢內(nèi)的活動，于6日齡左右形成完整而穩(wěn)定的腸道菌群(Powelletal.,2014)。針對工蜂腸道菌群來源的研究則發(fā)現(xiàn)，在實驗室中飼養(yǎng)的無菌工蜂，只有在與工蜂后腸提取物直接接觸的情況下，才會形成正常的腸道菌群，單純接觸巢脾或者哺育蜂則不足以使無菌工蜂形成穩(wěn)定的腸道菌群(Bonilla-Rosso and Engel,2018)。

西方蜜蜂蜂群中的另外兩個重要的成員-蜂王和雄蜂的腸道菌群在組成上與成年工蜂也有著顯著的差異，同時這二者的腸道菌群組成也并不穩(wěn)定(Kapheimetal.,2015)。造成這些差異的原因目前尚不明確，可能與它們在生理、行為和食物上的差異有關；有學者認為蜂王腸道菌群很有可能受到其特殊的食物——蜂王漿的影響(Corby-Harrisetal.,2014)。

2 蜜蜂腸道菌群的功能

2.1 代謝功能

蜜蜂以花蜜與花粉為食，其中花蜜是主要的糖類物質(zhì)來源，而花粉則是包括蛋白質(zhì)和脂肪酸在內(nèi)的多種營養(yǎng)素的重要來源。在蜜蜂對花蜜和花粉的代謝過程中，蜜蜂的腸道菌群起著重要的作用。

宏基因組學是腸道菌群功能研究中的一個重要手段。Engel等(2012)利用宏基因組，對西方蜜蜂腸道菌群的功能進行了深入的挖掘，他們發(fā)現(xiàn)有大量的基因被注釋到糖類的運輸與代謝功能，包括參與糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)運的磷酸轉(zhuǎn)移酶組件等；此外，他們還發(fā)現(xiàn)這些細菌除了能代謝花蜜和蜂蜜中常見的二糖、果糖和葡萄糖外，還具備代謝甘露糖、樹膠醛糖等蜜蜂本身無法代謝或者對蜜蜂有毒性的糖類物質(zhì)的功能(Engeletal.,2012)。大量針對蜜蜂腸道中單一菌種的基因組測序和體外培養(yǎng)試驗同樣證明了這一點(Engeletal.,2013;Ellegaardetal.,2015;Leeetal.,2015)。

G.apicola是蜜蜂腸道菌群的一個核心菌群。Zheng等(2016)測序并比較了42株來自于西方蜜蜂、東方蜜蜂和熊蜂的G.apicola菌株的基因組。他們發(fā)現(xiàn)這些菌株在碳水化合物代謝相關基因上有著很大的區(qū)別，其中部分菌株可以賦予蜜蜂利用正常情況下對其有毒的甘露糖、樹膠醛糖、木糖和鼠李糖作為碳源的能力，這表明G.apicola能提升其宿主對有毒食物的耐受甚至直接利用的能力，并且對蜜蜂的健康有著重要的作用。

花粉是蜜蜂重要的營養(yǎng)來源，長期以來一直有學者懷疑花粉在儲藏過程中會不斷的被微生物降解，但是Anderson等(2014)的研究顯示，蜂群中儲存的花粉中的微生物并沒有參與到花粉的降解，表明花粉的消化主要發(fā)生在蜜蜂的腸道中。而在西方蜜蜂腸道菌群基因組測序中，檢測出了包括果膠裂解酶在內(nèi)的多種參與植物細胞壁多糖降解的功能酶編碼基因，顯示蜜蜂腸道細菌在花粉壁與植物果膠的降解代謝中起著重要的作用，而進一步的體外實驗則證明Gilliamella是蜜蜂腸道菌群中唯一能降解果膠的細菌(Engeletal.,2012)。

通過比較無菌工蜂和正常工蜂腸道代謝組的差異，Kesnerova等(2017)首次明確了西方蜜蜂工蜂腸道菌群在消化花粉上的作用。他們發(fā)現(xiàn)，在正常工蜂和無菌工蜂的腸道內(nèi)容物之間，有372種物質(zhì)的含量有著顯著的差異；其中多種黃酮類物質(zhì)和花粉壁的組成成分的含量在無菌工蜂腸道中明顯上調(diào)；而在正常工蜂的腸道中，發(fā)酵產(chǎn)物和類花生酸的含量明顯上調(diào)。進一步利用單菌株人工定植和蜜蜂腸道細菌的體外培養(yǎng)，他們證實了這些代謝的變化與蜜蜂的腸道菌群有關，顯示工蜂腸道菌群在代謝難以直接消化和吸收的植物黃酮與花粉成分的代謝中起著重要的作用；同時他們發(fā)現(xiàn)蜜蜂的腸道細菌在種群間存在交互共生的現(xiàn)象，即蜜蜂某種腸道細菌的代謝產(chǎn)物可以被蜜蜂腸道菌群的其他成員進一步利用。

2.2 對宿主生理的影響

在動物的腸道中，腸道菌群可以通過發(fā)酵作用，將宿主的食物轉(zhuǎn)變成乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸(Cummingsetal.,1987)。這些物質(zhì)除了作為腸道上皮細胞重要的能量來源以外，還參與調(diào)節(jié)宿主的腸道生理環(huán)境，維護宿主健康(Donohoeetal.,2011)；短鏈脂肪酸同時還能通過激活或調(diào)節(jié)宿主的多種代謝通路進而影響宿主的生理與行為(Cryan and Dinan,2012)。對果蠅的研究顯示，果蠅的一種腸道細菌Acetobacterpomorum可以通過生成短鏈脂肪酸，調(diào)節(jié)果蠅的胰島素通路，進而影響果蠅的發(fā)育(Shinetal.,2011)。

利用無菌工蜂模型，Zheng等(2017)證實了西方蜜蜂工蜂的腸道菌群對工蜂的發(fā)育也有著顯著的影響。與正常工蜂相比，無菌工蜂的生長速率、卵黃原蛋白基因表達和伸吻反應都有著明顯的降低；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，正常工蜂胰島素/類胰島素信號通路相關基因的表達都有著明顯的上升，這可能是由正常工蜂與無菌工蜂腸道中代謝物的組成差異所造成的；代謝組分析顯示，與無菌工蜂相比，正常工蜂的腸道內(nèi)有著更多的能被蜜蜂吸收利用的短鏈脂肪酸和必需氨基酸；同時他們還證明了蜜蜂的腸道菌群會影響其宿主腸道內(nèi)的氧氣含量、pH值與氧化還原電位等。

2.3 免疫功能

除了參與宿主的消化代謝和調(diào)控宿主的生理發(fā)育與信號通路，腸道菌群在維護宿主的健康上也起著重要的作用。

在蜜蜂腸道幽門部分的腸道上皮細胞的表面，經(jīng)常能觀測到一種類似結痂的結構，這由于蜜蜂免疫反應中的黑化作用造成的。通過人為定植蜜蜂常見的腸道細菌，Engel等(2015)證實這一現(xiàn)象是由蜜蜂腸道菌群中的Frischellaperrara引發(fā)的。進一步比較無菌工蜂、定植F.perrara或Snodgrassellaalvi工蜂腸道的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)腸道菌群能顯著影響免疫相關基因的表達，特別是黑色素合成相關基因在F.perrara定植工蜂腸道內(nèi)顯著上調(diào)，證實了工蜂幽門部位的類結痂結構是由于F.perrara引發(fā)的宿主黑化免疫，同時這表明包括F.perrara在內(nèi)的蜜蜂腸道細菌在蜜蜂腸道中的存在會引發(fā)宿主的免疫反應(Emeryetal.,2017)。Kwong等(2017a)則報道了蜜蜂腸道菌群對其宿主抗菌肽表達的影響，發(fā)現(xiàn)蜜蜂腸道菌群能顯著提高apidaecin和hymenoptaecin的表達，而在人為向腹部注射大腸桿菌菌液后，S.alvi或Gilliamellaapicola定植的工蜂表現(xiàn)出了優(yōu)于無菌工蜂的存活率。

除了直接調(diào)控宿主免疫反應，蜜蜂的腸道菌群還參與宿主對多種致病菌的抵御。Paenibacilluslarvae和Melissococcusplutonius分別是美洲腐幼病和歐洲腐幼病的主要病原體，有學者發(fā)現(xiàn)，將蜜蜂的乳酸菌(Lactobacillus和Bifidobacterium)摻入蜜蜂幼蟲的食物，能有效降低美洲腐幼病和歐洲腐幼病對蜜蜂幼蟲的侵害(Forsgrenetal.,2010;Vásquezetal.,2012)。而采用腸道菌群紊亂的西方蜜蜂實驗也顯示，蜜蜂腸道菌群的穩(wěn)態(tài)也與蜜蜂抵御條件致病菌Serratiamarcescens的侵害有著密切的關系(Raymannetal.,2017;Mottaetal.,2018)。

東方蜜蜂微孢子蟲Nosemacerana是蜜蜂的一種腸道寄生蟲，主要在蜜蜂中腸上皮細胞寄生增殖，能破壞蜜蜂腸道組織完整性，抑制蜜蜂的免疫反應，最終導致蜜蜂個體壽命縮短，甚至微孢子蟲還會降低蜂王的生殖能力，進而影響蜂群群勢以及生產(chǎn)性能，是當下造成西方蜜蜂蜂群損失和制約全球養(yǎng)蜂業(yè)發(fā)展的重要因素之一(許瑛瑛等，2018)。而昆蟲腸道菌群的研究顯示，昆蟲中存在著腸道微生物與寄生蟲之間的相互對抗作用(Cariveauetal.,2014)，因此，N.cerana與蜜蜂腸道菌群的相互作用也受到了研究者的關注。Li等(2017)報道了西方蜜蜂腸道菌群會影響宿主對N.cerana的抵抗，他們使用抗生素破壞了工蜂的腸道菌群，然后使用東方蜜蜂孢子蟲侵染工蜂。研究結果顯示，抗生素處理的工蜂在接種微孢子蟲后的死亡率要顯著的高于接種了微孢子蟲的正常工蜂，抗生素處理組工蜂腸道中的微孢子蟲數(shù)量也要遠高于正常工蜂；他們還發(fā)現(xiàn)，微孢子蟲與抗生素的共同作用會顯著降低蜜蜂抗菌肽defensin和hymenoptaecin的表達；同時還證明，與蜜蜂微孢子蟲Nosemaapis不同(Diazetal.,2018)，N.cerana不會影響西方蜜蜂的腸道菌群組成。而Maes等(2016)的研究同樣證明了西方蜜蜂腸道菌群的紊亂，有利于微孢子蟲(Nosemaspp.)在蜜蜂腸道中的生長。

2.4 失調(diào)對蜜蜂的危害

腸道菌群失調(diào)指的是在飲食、藥物或病菌等因素的作用下，生物體正常的腸道菌群的生態(tài)平衡受到破壞，進而影響宿主的生理健康的現(xiàn)象。例如Schwarz等(2016)的研究就顯示，在蜜蜂腸道菌群成型前，人為定植Lotmariapassim會顯著改變蜜蜂腸道菌群的組成，進而影響蜜蜂卵黃原蛋白Vg和多個P450基因的表達，影響宿主的解毒代謝和激素合成。而在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中，為了防治蜜蜂的寄生蟲或病菌，大量的殺菌劑被應用到了蜂群中；此外在農(nóng)業(yè)上大量使用的除草劑、殺蟲劑等化學試劑，也會隨蜜蜂的采集行為進入到蜂群之中(Johnsonetal.,2010)。這些化合物很有可能會對蜜蜂的腸道菌群組成產(chǎn)生影響，從而影響到蜜蜂的健康。

百菌清是一種常用的殺菌劑，有學者發(fā)現(xiàn)，對蜂群施用10 μg/L的百菌清，會對蜜蜂腸道中菌群和真菌的組成造成明顯的影響；同時百菌清還顯著地影響了蜜蜂腸道菌群的基因表達(Kakumanuetal.,2016)。四環(huán)素是一種常被用于治療蜜蜂細菌病的抗生素，Raymann等(2017)發(fā)現(xiàn)，使用四環(huán)素處理蜜蜂工蜂，會顯著的擾亂蜜蜂腸道菌群的組成，包括蜜蜂腸道細菌的數(shù)量和菌株多樣性；進而導致蜜蜂死亡率上升，并且顯著增加蜜蜂病原菌對蜜蜂的危害；此外研究還顯示，在停止抗生素處理后，已經(jīng)失調(diào)的腸道菌群并不會恢復。草甘膦是一種被廣泛使用的除草劑，Dai等(2018)發(fā)現(xiàn)，草甘膦會顯著的影響西方蜜蜂幼蟲的腸道菌群組成，導致工蜂幼蟲死亡。Motta等(2018)則證明草甘膦會通過作用于蜜蜂腸道細菌S.alvi的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，顯著影響工蜂腸道中S.alvi的生長，最終導致工蜂腸道菌群的紊亂并使蜜蜂更易受到致病菌的侵害。

3 總結與展望

雖然蜜蜂腸道菌群功能的研究歷史并不長，目前已經(jīng)取得了大量的成果，對于蜜蜂腸道菌群與其宿主的相互作用，也已經(jīng)有了初步的了解，但是當下的研究主要集中在與宿主免疫、抵抗病原等與健康相關的領域，對于腸道菌群在消化代謝和對宿主生理調(diào)節(jié)等方面的研究仍有很多空白，深入探索腸道菌群與蜜蜂基本生理活動的關聯(lián)，有助于讓我們進一步了解蜜蜂的基本生理活動的調(diào)控。

蜜蜂的腸道菌群對蜜蜂的健康有著極大的影響，但是目前在養(yǎng)蜂生產(chǎn)上，蜜蜂腸道菌群的健康是一個長期被忽視的健康指標。通過對蜜蜂腸道菌群功能的研究，能讓我們更好的了解腸道菌群與蜜蜂健康的關系，也為科學養(yǎng)蜂提供參考。

此外，目前關于蜜蜂腸道菌群功能的研究主要集中于西方蜜蜂，對于東方蜜蜂腸道菌群的功能尚沒有深入的探索。東方蜜蜂的腸道菌群雖然在組成上和西方蜜蜂相近，但是在菌種水平上仍然有著明顯的差異，這顯示其功能與西方蜜蜂可能并不完全相似。同時東方蜜蜂作為中國的本土蜂種，在長期進化過程中對生存環(huán)境必然有著一定的適應，這很可能也會影響到其腸道菌群的功能。另外在東方蜜蜂腸道菌群中存在著獨特的菌種，其功能尚不明了，也值得進一步深入的探索與研究。