乳中硫氰酸鈉檢測方法研究進(jìn)展

張寧，周鑫，張養(yǎng)東，董李學(xué)，杜瑞煥，戚繼存，鄭百芹

（1.河北省唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測中心，唐山 063000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京 100193；3.河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)創(chuàng)新中心，唐山 063000；4.河北省唐山市灤南縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，唐山 063500）

乳是新生兒和新生動(dòng)物的基礎(chǔ)食物，可提供各種蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)和維生素。乳也可為各個(gè)年齡段的人帶來豐富的營養(yǎng)，被用來制作成各種保健食品[1]。但生鮮乳極易變質(zhì)腐敗，保藏期非常短。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在牛乳收購、運(yùn)輸、貯藏的過程中，由于生乳酸敗變質(zhì)而不能用于加工生產(chǎn)的原料乳損失達(dá)5%，造成了原料乳的大量浪費(fèi)，增加了乳品加工生產(chǎn)與運(yùn)營成本[2]。

乳過氧化物酶體系（LPS）存在于鮮牛乳中，是一種由乳過氧化物酶（LP）、過氧化氫、硫氰酸鈉三種物質(zhì)組成的一種天然抗菌體系，在硫氰酸鈉和過氧化氫的存在下，經(jīng)LP催化，硫氰酸鈉被過氧化氫氧化，生成一種中間產(chǎn)物——亞硫氰酸鹽（OSNC-），亞硫氰酸鹽能特異性與游離于細(xì)菌表面的巰基結(jié)合，使與細(xì)菌代謝活動(dòng)相關(guān)酶失去活性，抑制細(xì)菌的繁殖，由此起到抑菌保鮮效果[3,4]。為利用乳過氧化物酶體系對生鮮乳進(jìn)行抑菌保鮮，人們開始在牛奶中加入硫氰酸鈉和過氧化氫[5]。

然而，隨著研究的不斷深入，硫氰酸鈉的毒性也日益顯現(xiàn)。研究表明，少量攝取硫氰酸鈉可阻礙機(jī)體對碘的吸收利用，引起甲狀腺疾病[6]。過量的硫氰酸鈉會(huì)對人體健康造成危害，引發(fā)急性毒性作用，引起以消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂以及皮膚損害為主的全身性疾病[7]。因此，2018年，衛(wèi)生部公布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》中明令禁止在生乳中添加硫氰酸鈉。然而，研究表明，生乳中天然存在少量的硫氰酸鈉，且飼喂十字花科類植物可使生鮮牛乳中的硫氰酸鈉含量上升[8,9]，說明亟需建立迅速、準(zhǔn)確、靈敏的方法來檢測乳中的硫氰酸鈉。目前，硫氰酸鈉的檢測方法主要包括分光光度法、氣相色譜法、離子色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法等。本文主要對以上各種方法在檢測乳中硫氰酸鈉的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對今后的研究方向進(jìn)行展望。

1 分光光度法

硫氰酸鈉可與鐵鹽作用生成血紅色的硫氰化鐵，因此可利用分光光度計(jì)建立硫酸氫鈉與吸光度之間的關(guān)系[10,11]。水明等利用可見分光光度法測定牛乳中硫氰酸鈉的含量，發(fā)現(xiàn)在濃度為2.5～20μg/mL，波長為457nm下，吸光度與硫氰酸鈉質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，線性回歸方程為:A=4.15×10-2C+9.5×10-3，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，測得回收率為96.0%～104.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.58%～1.16%[12]。為研究該方法的日間變異系數(shù)，伍金娥等采用紫外分光光度法測定摻假牛奶中的硫氰酸鈉的含量，結(jié)果顯示日間變異系數(shù)均在4.85%以下[13]。為拓展該方法的應(yīng)用范圍，王靜選擇牛奶和奶粉作為樣品進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)硫氰酸鈉濃度為1～30mg/L、460nm波長時(shí)，吸光度呈良好線性關(guān)系，奶粉和牛奶的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.47%和2.23%，加標(biāo)回收率為98.6%～99.7%。標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后，在30min內(nèi)進(jìn)行檢測，相對穩(wěn)定[14]。然而，該方法存在靈敏度偏低、顯色穩(wěn)定性相對不高[15]，通量不高、涉及有毒的三氯乙酸和勞動(dòng)強(qiáng)度偏大等問題，不適宜檢測硫氰酸鈉含量較低的牛奶樣品。

2 氣相色譜法

氣相色譜法是一種分析速度快和分離效率高的分離分析方法。近年來采用高靈敏選擇性檢測器，使得它又具有分析靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。胡桂林等人建立了一種用氣相色譜法測定牛奶和奶粉中硫氰酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法。該方法回收率為91.1%～106.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，最低檢出限為0.1mg/kg，且檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，靈敏度高，可進(jìn)行牛奶和奶粉中硫氰酸鹽的檢測[16]。2014年國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局頒發(fā)的進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 3927-2014 出口乳制品中硫氰酸鈉含量的測定》也將其用作測定乳制品中硫氰酸鈉含量的方法之一。然而，該方法需要使用有毒試劑氯胺-T進(jìn)行衍生，因此在國內(nèi)的檢測和科學(xué)研究中應(yīng)用相對不多，相關(guān)報(bào)道較少。

3 離子色譜法

離子色譜法是目前檢測乳中硫氰酸鈉應(yīng)用最廣泛的方法[17～20]。其原理是用乙酸溶液沉淀蛋白后過濾，上清液再用氫氧化鉀溶液沉淀蛋白。過濾后，直接將試樣注入離子色譜儀分離，外標(biāo)法定量[21]。李瀅倩運(yùn)用離子色譜法對牛乳中硫氰酸鹽含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)回收率為88.0%～106.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.40%，檢出限和定量限為0.08μg/mL和0.26μg/mL，線性范圍為0.5～10μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9995[22]。為提高檢測通量，馮偉科等人用離子色譜同時(shí)測定奶及奶制品中亞硝酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽和硫氰酸鹽的含量，發(fā)現(xiàn)該方法的線性范圍和相關(guān)系數(shù)為0.02～5.0μg/mL和0.9992，檢出限為0.005～0.02mg/kg；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87%～2.6%，加標(biāo)回收率為87.8%～100.4%[23]。為進(jìn)一步優(yōu)化離子色譜法的各項(xiàng)參數(shù)，李錦等建立了離子色譜法測定牛乳中硫氰酸鹽含量的不確定度評估方法，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制過程對擴(kuò)展不確定度的影響較大，是不確定度的主要影響因素[24]。為探尋低毒、安全的前處理試劑以及性價(jià)比高的固相萃取小柱，黃惠雯以生鮮牛奶為原料，在《MRT/B 8-2016生乳中硫氰酸根的測定離子色譜法》基礎(chǔ)上優(yōu)化前處理方法。結(jié)果表明，采用乙醇作為蛋白質(zhì)沉淀劑及HLB固相萃取小柱作為生鮮牛奶中測定硫氰酸鈉的前處理方法，具有操作簡單、性價(jià)比高、試劑安全低毒等優(yōu)點(diǎn)[25]。然而，離子色譜法存在線性范圍不寬的問題，線性范圍一般為0.1～2mg/L[26,27]，線性寬度僅跨越一個(gè)數(shù)量級，限制了其應(yīng)用的簡便性和靈活性。

4 高效液相色譜法

高效液相色譜法一直是各種物質(zhì)檢測的重要手段之一，近年來在乳中硫氰酸鈉的檢測中得到廣泛應(yīng)用[22,28～31]。李瀅倩運(yùn)用高效液相色譜法對牛乳中硫氰酸鹽含量進(jìn)行測定，回收率為84.0%～89.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%，儀器的最低檢測限為0.06mg/L，線性范圍為0.2～20μg/mL，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9998[22]。吳劍平等人對檢測方法進(jìn)行系統(tǒng)評估，發(fā)現(xiàn)濃度范圍在5～500mg/L內(nèi)線性較好，R2＞0.9995，適用于生鮮乳和巴氏殺菌成品乳，檢測限可達(dá)到0.2mg/kg，定量范圍0.5～50mg/kg，精確度＜10%，回收率＞90%[28]。為進(jìn)一步降低檢出限，研究者以十六烷基三甲基溴化銨和檸檬酸為流動(dòng)相，用二極管陣列檢測器檢測，檢測波長218nm，該方法線性范圍為0.2～100μg/mL，回收率為95%以上[32,33]。隨后的研究主要集中在樣品前處理的優(yōu)化和檢測速度的提升上。楊瑾建立了牛奶中硫氰酸鈉的QuEChERS-HPLC快速檢測方法。該方法操作簡便、快速靈敏，適用于牛奶中硫氰酸鈉的快速檢測和日常監(jiān)控。然而，高效液相色譜法存在通量不高、涉及有毒有害試劑、成本較高等問題。

5 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）又稱高效毛細(xì)管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)[34,35]。吳劍平等人運(yùn)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法直接檢測牛奶中硫氰酸鈉質(zhì)量濃度，結(jié)果表明以二極管陣列紫外檢測器218nm波長下分析樣品，質(zhì)量濃度范圍在5～500mg/L內(nèi)線性較好，R2＞0.9995。該方法可適用于生鮮乳和巴氏殺菌成品乳，檢測限可達(dá)到0.2mg/kg，定量范圍0.5～50mg/kg，精確度＜10%，回收率＞90%[36]。然而，毛細(xì)管電泳的重現(xiàn)性有待提高，且未經(jīng)系統(tǒng)培訓(xùn)的工作者難以掌握，因此在國內(nèi)的檢測和科學(xué)研究中應(yīng)用較少。

6 表面增強(qiáng)拉曼光譜法

表面增強(qiáng)拉曼散射光譜法是在粗糙的貴金屬表面引起拉曼信號增強(qiáng)現(xiàn)象的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種方法，具有檢測實(shí)時(shí)快速、靈敏度高、分子識別性專一等優(yōu)點(diǎn)，適合檢測微量的小分子，近年來也有研究人員將其用于檢測乳中的硫氰酸鈉[37～40]。周宇利用表面增強(qiáng)拉曼光譜對硫氰酸鈉牛奶溶液進(jìn)行了光譜特性的分析。分析結(jié)果表明牛奶對硫氰酸鈉的定性分析沒有影響，但是由于牛奶中大分子成分的影響導(dǎo)致光譜圖中信噪比有所降低[37]。林翔等人使用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)結(jié)合聚集的銀溶膠活性基底檢測牛奶中硫氰酸鈉的殘留，得到最低檢測限為10ppb，增強(qiáng)因子約為5.4×106。用三氯乙酸沉淀牛奶樣品中的蛋白成分，同時(shí)存留在待測液中的三氯乙酸促使銀溶膠凝聚進(jìn)而提高其增強(qiáng)效率，得到的最低檢測限在0.1～10ppm范圍內(nèi)[38]。為進(jìn)一步拓展該方法的應(yīng)用范圍，林翔針對三種不同的食品基質(zhì)，建立了一種簡單快速的牛奶中硫氰酸鈉的SERS檢測方法，僅需10min便可完成檢測，檢測限可達(dá)1.45ppm[40]。然而，由于該方法所需的儀器比較昂貴，且需要操作者具有較高的理論基礎(chǔ)和知識儲備，因此，該方法目前僅用于實(shí)驗(yàn)室研究，未得到廣泛推廣和應(yīng)用。

7 展望

隨著科學(xué)技術(shù)日新月異，科研工作將越來越精細(xì)，越來越深入。人們早期將硫氰酸鈉用作牛奶保鮮劑，到如今明令禁止使用，正是科學(xué)不斷進(jìn)步的結(jié)果。新的發(fā)現(xiàn)催生新的問題，如內(nèi)源性硫氰酸鈉的發(fā)現(xiàn)，要求在檢測和研究乳中硫氰酸鈉時(shí)，其檢測方法具有更低檢出限。目前，雖然可用的方法很多，如分光光度法、氣相色譜法、離子色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法和表面增強(qiáng)拉曼光譜法等，但這些方法普遍存在靈敏度不高、穩(wěn)定性重現(xiàn)性較差、通量不高、勞動(dòng)強(qiáng)度偏大、成本較高、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。目前，質(zhì)譜技術(shù)、人工智能和自動(dòng)機(jī)械化設(shè)備已經(jīng)較為成熟，相信隨著更多科學(xué)技術(shù)的突破發(fā)展和學(xué)科之間的相互融合，更加快速、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、自動(dòng)化、成本低、操作簡便的檢測技術(shù)將會(huì)不斷涌現(xiàn)。