水牛唾液蛋白組學(xué)研究進(jìn)展

賈銀海， 黃光云， 朱 文， 姜建萍， 文信旺， 肖正中， 黃明光， 吳柱月， 楊秀榮， 蔣和生

(1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，南寧 530001；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南寧 530004；3.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，南寧 530001)

唾液具有溶菌、消化和滋潤(rùn)口腔等多種生物學(xué)功能，運(yùn)用蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)可對(duì)唾液中含有豐富的微生物和代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。Wong等[1]建立了富含有大量人類(lèi)唾液生物學(xué)信息的專(zhuān)業(yè)唾液組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(saliva omics knowledge base，SKB)，非常有利于唾液相關(guān)組學(xué)的進(jìn)一步研究[2]。隨著高通量和高精度的蛋白質(zhì)測(cè)序在蛋白組學(xué)技術(shù)廣泛的應(yīng)用，使得應(yīng)用唾液蛋白組學(xué)表達(dá)篩選口腔內(nèi)環(huán)境及臨床生物標(biāo)記物成為可能。研究人員應(yīng)用多種分離方法來(lái)提高唾液蛋白的含量，并改善分離測(cè)定的靈敏度。

人類(lèi)或動(dòng)物的唾液中含有大量的化合物可提供大量的信息，為監(jiān)控疾病的發(fā)病機(jī)理以及口腔健康等起著非常重要的作用。Hardt等[3]使用2D SDS-PAGE結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分離腮腺分泌唾液的蛋白質(zhì)，被識(shí)別的多肽范圍在1～6 kDa以及相對(duì)較高分子量的蛋白質(zhì)。Schipper等從全唾液中鑒定到1 100個(gè)蛋白，并且Denny等[4]在全唾液中鑒定到大約1 166個(gè)蛋白。Wilmarth等[5]報(bào)道成功地應(yīng)用二維液相色譜[6-7]和毛細(xì)管電泳技術(shù)[8]結(jié)合鑒定了人類(lèi)唾液的蛋白質(zhì)組。

1 唾液蛋白組學(xué)的研究應(yīng)用

1.1 唾液收集方法的研究應(yīng)用

唾液收集不受外界的影響，無(wú)需任何刺激。非侵入性的唾液收集有助于減少病人壓力和焦慮水平[9]，特別是在老年和兒科這是非常重要的。簡(jiǎn)單的收集、處理、存儲(chǔ)，可以減少成本。人類(lèi)的唾液可以用常規(guī)的吐痰管收集，收集的程序非常簡(jiǎn)單，不需要專(zhuān)業(yè)人員[10]。但由于分析水平上的差異，要求采集的唾液要進(jìn)行不同的處理[11-12]。因此，探尋一種能夠足量、客觀采集唾液樣品的方法具有重要的臨床意義。目前動(dòng)物唾液主要應(yīng)用巴斯特吸管吸取法、自然流取法和咀嚼棉柱法進(jìn)行收集。動(dòng)物必須在飼喂前進(jìn)行采集，清洗口腔，采集后的唾液去除食物碎屑等物質(zhì)，添加適量的蛋白酶抑制劑后低溫保存?zhèn)溆肹13-14]。但現(xiàn)在采集的時(shí)間、貯藏的溫度、儲(chǔ)存的時(shí)間在不同的研究結(jié)果中表現(xiàn)不一致，還有待進(jìn)一步研究。

1.2 唾液蛋白組學(xué)研究技術(shù)的應(yīng)用

近年來(lái)，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以探測(cè)和識(shí)別人類(lèi)體液和組織中的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)控制著細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育過(guò)程，但是在疾病狀態(tài)下可能會(huì)被改變。系統(tǒng)的分析并量化蛋白質(zhì)的豐度，對(duì)于理解蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的關(guān)系與蛋白質(zhì)和動(dòng)力學(xué)之間相互作用至關(guān)重要。簡(jiǎn)而言之，蛋白質(zhì)組學(xué)是一種利用涉及的技術(shù)對(duì)分離液、細(xì)胞等分離得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜識(shí)別，并借助生物信息學(xué)對(duì)其進(jìn)行分析的學(xué)科。目前主要有兩種基本的蛋白質(zhì)組學(xué)策略：自底向上和自頂向下[15]。它們之間的主要區(qū)別在于樣品制備的過(guò)程。在自底向上的樣品制備技術(shù)，工作流程首先是蛋白質(zhì)的提取和酶裂解，高效能的液相色譜—光譜法(HPLC-MS)分析可以識(shí)別的蛋白質(zhì)。大多數(shù)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后改變蛋白質(zhì)的側(cè)鏈，從而增加了蛋白質(zhì)組的功能多樣性。自底向上的策略往往是無(wú)法標(biāo)識(shí)轉(zhuǎn)錄后修飾，特別是唾液蛋白質(zhì)組[16]。尤其是經(jīng)過(guò)蛋白水解酶作用的唾液蛋白質(zhì)。毛細(xì)管電泳或最近開(kāi)發(fā)的OFFGEL分離液也可以用于樣品分離[16]?，F(xiàn)在一般都采用串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)和液相色譜連用的方法來(lái)提高質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性。但是隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)的發(fā)展，需對(duì)一個(gè)基因組所表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定并精確的定量。

1.3 唾液蛋白組學(xué)在疾病方面的應(yīng)用

最近的研究表明，唾液可以反應(yīng)口腔和身體的健康狀態(tài)?？谇坏慕】狄部勺鳛橐恍┘膊≈虏〉臎Q定因素[17]，這對(duì)于從病理生理學(xué)方面理解口腔的復(fù)雜環(huán)境和口腔疾病的動(dòng)態(tài)變化是非常重要的。

Yao等[18]使用全唾液的蛋白質(zhì)樣本使用2D-SDS-PAGE MALDI-TOF、ESI和MALDI-QoTOF/MS分析方法來(lái)鑒定全唾液中的蛋白質(zhì)。應(yīng)用凝膠蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究人唾液翻譯后修飾，如唾液糖型[19-20]。通過(guò)凝膠電泳方法研究全唾液來(lái)尋找有關(guān)疾病的生物標(biāo)志物如牙周炎、齲齒等[21]。

唾液中包括IgA、IgM、IgG等抗體，這些抗體主要是來(lái)源于唾液腺和血清，唾液中的這些抗體可以抵抗病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)等的感染,在感染HIV病毒人員的全唾液中通過(guò)ELISA和Western blotassay分析得出與血清中的抗體水平基本一致[22]。研究發(fā)現(xiàn)，在成人牙周炎患者中顯示有比較高的酶活性，且可能與唾液中的堿性磷酸酶的活性有關(guān)[21]。唾液也可以用于確定免疫和感染檢測(cè)與麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹等疾病[23]。唾液中的IgA可作為檢測(cè)感染輪狀病毒(RV)血清中的抗體反應(yīng)的一個(gè)較好的指標(biāo)，同時(shí)還可以檢測(cè)感染輪狀病毒(RV)疫苗接種和免疫反應(yīng)情況。Vitorino等[24]用高效液相色譜連用質(zhì)譜法對(duì)唾液中的微量蛋白功能的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)唾液蛋白的鑒定率高于聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白測(cè)序免疫印跡法，并精確鑒定了22種蛋白，這些蛋白對(duì)口腔內(nèi)抗菌和膜的形成起到了主要作用。到目前為止，Rosa等[25]通過(guò)口腔鑒定的蛋白有近3 400個(gè)，其中3 115個(gè)從唾液中被發(fā)現(xiàn)。

1.4 唾液蛋白組學(xué)生物標(biāo)記中的應(yīng)用

唾液采集具有無(wú)創(chuàng)傷性，收集方便等優(yōu)勢(shì)，但同其他的體液的研究如乳液、精液、胰酶的應(yīng)用相比較，在口腔生物標(biāo)記的研究還處于初期[26]。但是口腔唾液中獨(dú)特的蛋白質(zhì)成分、無(wú)機(jī)鹽等成分是研究口腔疾病方面理想的生物標(biāo)記。唾液中含有各種類(lèi)型的蛋白質(zhì)可以防止微生物感染口腔，溶菌酶則是眾所周知的一類(lèi)能直接穿透細(xì)菌細(xì)胞壁抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的酶類(lèi)。研究發(fā)現(xiàn)，患有口腔炎癥的患者在炎癥周?chē)芫傅暮棵黠@增加[27]，除了溶菌酶外其他抗菌肽類(lèi)物質(zhì)對(duì)口腔炎癥也有很好的調(diào)節(jié)作用。齲齒的病原體可以刺激免疫細(xì)胞因子產(chǎn)生，可能會(huì)保護(hù)和防止細(xì)菌的感染，細(xì)胞因子的濃度可以控制炎癥性過(guò)程[28]。細(xì)胞因子IL-6，IL-8，IL-1β和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子在口腔炎癥組比對(duì)照組顯著增加[29-31]。研究人員發(fā)現(xiàn)，蛋白酶抑制劑具有抗菌作用，推測(cè)可能與其參與齲齒形成的過(guò)程有關(guān)，截至目前，蛋白酶抗菌活性的機(jī)制仍未闡明[32]。

1.5 唾液蛋白組學(xué)在其他方面的研究

唾液蛋白組學(xué)的研究在人類(lèi)口腔疾病生物標(biāo)記物的篩選鑒定方面進(jìn)行了大量的研究工作,并取得了初步成果。但與血液蛋白組學(xué)等的研究相比，唾液蛋白組學(xué)的研究還處在初級(jí)階段，而且唾液中的蛋白含量低，受采集時(shí)間、保存時(shí)間等多種因素的影響，導(dǎo)致鑒定的唾液蛋白質(zhì)的敏感性較差而豐度較低。但隨著OMIC時(shí)代的帶來(lái)，自動(dòng)化、高通量、高靈敏度和可重復(fù)性的定量技術(shù)的研究成功將有效提高唾液蛋白質(zhì)組的分析精度，蛋白組的全表達(dá)譜研究和疾病生物標(biāo)記確立、生物靶向治療藥物的研究應(yīng)用將成為今后唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點(diǎn)。

2 水牛唾液蛋白組學(xué)研究

隨著后基因組時(shí)代的開(kāi)啟，液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的連用，結(jié)合生物信息學(xué)分析，使得唾液蛋白組學(xué)向高通量、高靈敏度的方向發(fā)展，并取得的一定的成果。最近，運(yùn)用組學(xué)方法來(lái)識(shí)別動(dòng)物不同體液中存在的大量生物分子得到了關(guān)注。唾液、尿液等材料被用作動(dòng)物的發(fā)情鑒定。在這些資源中，唾液有著復(fù)雜的功能，如潤(rùn)滑口腔，改善動(dòng)物的咀嚼和吞咽，保護(hù)口腔組織和牙齒，還可以啟動(dòng)口腔內(nèi)一些酶的消化功能。另外唾液可以作為各種細(xì)菌感染、癌癥、藥物濫用、激素水平、DNA及RNA測(cè)試、唾液化學(xué)分析(saliva-chemistry analysis)等，利用唾液樣品通過(guò)檢測(cè)特殊蛋白的表達(dá)并可作為蛋白的生物標(biāo)記。唾液蛋白組學(xué)已經(jīng)開(kāi)始用于人類(lèi)健康狀況和疾病等方面的研究[33-37]。在人類(lèi)研究上，可以通過(guò)檢測(cè)唾液中特殊蛋白來(lái)確定排卵的時(shí)間。Muthukumar和Onteru報(bào)道了運(yùn)用蛋白質(zhì)組分析水牛發(fā)情周期不同階段的唾液和陰道粘液得出，這些體液可以識(shí)別和鑒定其發(fā)情[38-39]。

利用唾液對(duì)不同動(dòng)物的發(fā)情周期各個(gè)階段蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行了研究，如水牛[40]、山羊[41]、綿羊[42]和牛[42]等。Muthukumar等[43]從水牛全唾液中采用SDS-PAGE，光譜分析的到179種蛋白，其中發(fā)情前期有22種特異性蛋白，發(fā)情期有37種特異性蛋白，發(fā)情后期有17種特異性蛋白，在這些蛋白中β-enolase和TLR4被驗(yàn)證。運(yùn)用免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白在發(fā)情階段特異性表達(dá)。β-enolase有報(bào)道在骨骼和心臟內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，這是第1次在水牛發(fā)情階段被報(bào)道。Muthukumar子宮頸陰道分泌的液體研究表明，有416種蛋白在水牛發(fā)情期和發(fā)情后期階段的陰道子宮液中被檢測(cè)出，其中68種蛋白為發(fā)情特異性蛋白，HSP-70蛋白的含量發(fā)情期比發(fā)情前期、發(fā)情后期的含量高[38]。

3 小 結(jié)

綜上所述，唾液作為實(shí)驗(yàn)材料已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域進(jìn)行研究，不同的個(gè)體、同一個(gè)體不同的時(shí)期唾液的成分不同，如何掌握最佳的采集時(shí)間、貯藏方法對(duì)后續(xù)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。當(dāng)前利用唾液蛋白組學(xué)研究還處在初級(jí)階段，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系等方面還需要進(jìn)一步研究。但利用唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究將成為未來(lái)組學(xué)研究的一種新的發(fā)展方向。