酸馬奶源產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌MXG-68的益生特性

滿麗莉，向殿軍，李華，倪娜

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼，028042）

0 引 言

益生菌是能促進(jìn)宿主健康的活體微生物，具有無(wú)殘留、無(wú)毒副作用、無(wú)抗藥性、耐酸堿、耐膽鹽等優(yōu)點(diǎn)，是未來(lái)替代抗生素的潛在產(chǎn)品[1-2]。乳酸菌菌株是作為益生菌的最常見(jiàn)微生物，目前商業(yè)化產(chǎn)品中使用的益生菌大部分屬于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，大多數(shù)是人體來(lái)源或乳及乳制品來(lái)源的、具有免疫調(diào)節(jié)功能、能在胃腸道中存活的微生物[3-4]。目前篩選具有良好益生特性、壓力耐受性及自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生菌是研究的熱點(diǎn)之一。

植物乳桿菌是發(fā)酵食品中常見(jiàn)的乳酸菌，因其來(lái)源安全（GRAS）被廣泛用于益生菌的篩選，其對(duì)黃瓜、橄欖、酸菜、發(fā)酵乳制品等發(fā)酵食品的高酸度和高鹽環(huán)境具有強(qiáng)耐受性，因而在食品工業(yè)中應(yīng)用甚廣[5-6]。另一方面，植物乳桿菌對(duì)極端的胃腸道環(huán)境（胃酸、膽鹽）有足夠的抵抗力。此外，一些菌株還具有其他的益生菌特性，包括較高的β-半乳糖苷酶活性和疏水性，這與菌株對(duì)宿主的黏附能力有關(guān)；抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生如：細(xì)菌素、過(guò)氧化氫、酸性物質(zhì)等，這與菌株抑制致病性微生物、維持腸道菌群平衡、提高腸道免疫力有關(guān)[7-9]。

FAO/WHO的標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定益生菌篩選必須滿足三個(gè)基本特點(diǎn)：耐受胃腸黏膜的選擇環(huán)境、黏附宿主的腸壁細(xì)胞、分泌物或者分解產(chǎn)物為抗菌物質(zhì)[10]。本試驗(yàn)通過(guò)評(píng)價(jià)酸馬奶源產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌MXG-68的益生性能，以期為益生菌的開(kāi)發(fā)提供新的菌種資源，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)微生態(tài)制劑及其工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品及模式菌株

植物乳桿菌MXG-68分離于內(nèi)蒙古地區(qū)的酸馬奶中，由實(shí)驗(yàn)室自行保存。指示菌菌株購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 試劑、培養(yǎng)基及主要儀器設(shè)備

1.1.2.1 試劑、培養(yǎng)基

乳酸菌及指示菌所需培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；過(guò)氧化氫酶、異硫氰酸熒光素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗菌藥物紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司及北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；Caco-2細(xì)胞、胎牛血清購(gòu)自以色列BI公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海英駿生物技術(shù)公司；其它藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.1.2.2 主要儀器設(shè)備

J-54A/MJ-78A型STIK滅菌鍋：北京天賜科儀商貿(mào)有限公司；Microfuge16型離心機(jī)：美國(guó)貝克曼公司；110-801型三量ip67防水原點(diǎn)數(shù)顯卡尺不銹鋼零點(diǎn)電子游標(biāo)尺：東莞市景有模具五金有限公司；DHP-600恒溫培養(yǎng)箱：常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；Model 680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國(guó)Bio-Rad公司；DNP-9272型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

植物乳桿菌MXG-68的培養(yǎng)方法：挑取菌株接種于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基（p H 5.8）的250 mL錐形瓶中，37℃培養(yǎng)至約109cfu/mL。

指示菌的培養(yǎng)方法：挑取指示菌接種于裝有100 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37℃培養(yǎng)至約107cfu/mL。產(chǎn)氣莢膜梭菌及生孢梭菌用RCM培養(yǎng)基；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌用TSA-YE培養(yǎng)基；糞腸球菌、銅綠假單胞菌及腸炎沙門氏菌用LB培養(yǎng)基；其他指示菌均用NB培養(yǎng)基。

1.2.2 植物乳桿菌MXG-68的抑菌特性試驗(yàn)

1.2.2.1 抑菌譜的測(cè)定

按1.2.1的方法獲得植物乳桿菌MXG-68的菌液按1%接種于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基（p H 5.8）的250 mL錐形瓶中，30℃發(fā)酵24 h。

無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備及抑菌活性測(cè)定：發(fā)酵液經(jīng)12 000×g，于4℃離心10 min，收集上清液，用1 mol/L NaOH調(diào)p H值至7.0，排除有機(jī)酸的干擾。加入過(guò)氧化氫酶（終濃度為5.0 mg/m L），37℃水浴2 h排除過(guò)氧化氫的干擾，上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后備用，取50μL上清液測(cè)定抑菌活性。植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)20株指示菌的抑菌活性采用雙層平板打孔法檢測(cè)[11]，打孔直徑為6 mm，抑菌圈直徑采用電子游標(biāo)卡尺測(cè)定。

1.2.2.2 傳代穩(wěn)定性的測(cè)定

將植物乳桿菌MXG-68在MRS培養(yǎng)基斜面上連續(xù)傳代20次，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。將不同代次的菌株按照1.2.1和1.2.2.1的方法培養(yǎng)并制備無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，以鼠傷寒沙門氏桿菌ATCC14028為指示菌，通過(guò)雙層平板打孔法檢測(cè)觀察不同代次菌種抑菌活性的變化情況，確定植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素的傳代穩(wěn)定性。

1.2.3 植物乳桿菌MXG-68的動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定

按1.2.1的方法獲得植物乳桿菌MXG-68的菌液按1%接種于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基（pH 5.8）的250 mL錐形瓶中，30℃發(fā)酵32 h，每隔2 h取樣，通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品的活菌數(shù)，獲得菌株的生長(zhǎng)曲線。按照1.2.2.1的方法制備樣品的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，以鼠傷寒沙門氏桿菌ATCC14028為指示菌，通過(guò)雙層平板打孔法測(cè)定抑菌活性，獲得菌株所產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵曲線。

1.2.4 植物乳桿菌MXG-68對(duì)人工胃液的耐受性試驗(yàn)

人工胃液的制備：取10 g胃蛋白酶，2 gNaCl，7 mL濃鹽酸，加蒸餾水至約800 mL，搖勻定容至1 000 mL。用HCl分別將100 m L人工胃液的pH調(diào)至1.0～4.0，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。按1.2.1的方法培養(yǎng)的植物乳桿菌MXG-68菌液按5%接種于不同p H的人工胃液中，處理1～4 h。經(jīng)適當(dāng)稀釋后，運(yùn)用平板菌落計(jì)數(shù)法分析菌株對(duì)人工胃液的耐受性。存活率（%）=（處理后的活菌數(shù)/處理前的活菌數(shù)）×100%。

1.2.5 植物乳桿菌MXG-68對(duì)人工腸液和膽鹽的耐受性試驗(yàn)

人工腸液的制備：500 m L蒸餾水溶解6.8 g KH2PO4，調(diào)p H至6.8，加入10 g胰蛋白酶，定容至1 000 mL。100 mL人工腸液中分別加入0.1～0.4 g膽鹽（終濃度為0.1%～0.4%），0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。按1.2.1的方法培養(yǎng)的植物乳桿菌MXG-68菌液按5%接種于含有不同濃度膽鹽的人工腸液中，處理1～4 h。經(jīng)適當(dāng)稀釋后，運(yùn)用平板菌落計(jì)數(shù)法分析菌株對(duì)人工腸液和膽鹽的耐受性。存活率（%）=（處理后的活菌數(shù)/處理前的活菌數(shù)）×100%。

1.2.6 植物乳桿菌MXG-68對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性試驗(yàn)

菌液制備：按1.2.1的方法培養(yǎng)的植物乳桿菌MXG-68菌液于4℃，8 000×g離心15 min，棄上清后菌體用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖溶液重懸菌體至108cfu/m L，備用。

植物乳桿菌MXG-68的熒光標(biāo)記：制備的菌液懸浮于100mg/mL異硫氰酸熒光素中，于37℃避光處理1h，用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖溶液洗滌后重懸菌體至108cfu/mL，備用。

Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)：Caco-2細(xì)胞在裝有DEME細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%的熱滅活胎牛血清、100μg/mL鏈霉素及100IU/mL青霉素）的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

黏附試驗(yàn)：取熒光標(biāo)記的植物乳桿菌MXG-68與Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)液等體積混勻，以不加菌液的細(xì)胞培養(yǎng)液為對(duì)照。培養(yǎng)板于CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育1h，用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖溶液洗脫未黏附的菌體。加入0.1mL的胰酶，待細(xì)胞完全脫落后加入0.4mL完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞懸液的熒光強(qiáng)度，發(fā)射光和吸收光波長(zhǎng)分別為530nm和485nm。細(xì)菌的黏附率（%）=（乳酸菌黏附Caco-2細(xì)胞并洗脫后細(xì)胞懸液的相對(duì)熒光強(qiáng)度/乳酸菌黏附Caco-2細(xì)胞前的相對(duì)熒光強(qiáng)度）×100%。

1.2.7 抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)

采用濾紙片法檢測(cè)植物乳桿菌MXG-68的藥敏性，具體操作如下：按1.2.1的方法培養(yǎng)的植物乳桿菌MXG-68菌液均勻涂布于MRS培養(yǎng)基上，靜置晾干。用已滅菌的鑷子取40種抗菌藥物紙片貼于已均勻涂布菌液的MRS培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

所有的測(cè)定數(shù)據(jù)均重復(fù)三次，應(yīng)用SPSS17.0軟件中的One-wayanalysisofvariance（ANOVA）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌MXG-68的抑菌特性

2.1.1 抑菌譜

由表1和圖1可知，植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)的細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑制作用，是一種廣譜細(xì)菌素。且發(fā)現(xiàn)其對(duì)同種指示菌（如金黃色葡萄球菌ATCC12600和PTCC1112，鼠傷寒 沙 門 氏 桿 菌 ATCC13311、CGMCC1.1552和ATCC14028）的抑菌效果亦不同，可能是由于指示菌本身的差異所造成的。目前已報(bào)道的可同時(shí)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的植物乳桿菌并不多，如植物乳桿菌KLDS1.0391、植物乳桿菌LD4和植物乳桿菌KL-1等[12-14]。作為有利于人及動(dòng)物健康的益生菌，能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)才能更好地抑制腸道中致病性微生物的生長(zhǎng)，減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生，近而提高腸道免疫力及維持腸道菌群平衡。植物乳桿菌MXG-68能夠產(chǎn)生廣譜細(xì)菌素，滿足成為益生菌的基本條件之一。

2.1.2 傳代穩(wěn)定性

各代菌株所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌活性之間的差異不顯著（P＞0.05），表現(xiàn)出穩(wěn)定的遺傳特性，其細(xì)菌素生產(chǎn)性能基本保持穩(wěn)定,如圖2所示。說(shuō)明細(xì)菌素生產(chǎn)菌株-植物乳桿菌MXG-68具備作為工業(yè)生產(chǎn)細(xì)菌素出發(fā)菌株的前提條件。

表1 植物乳桿菌MXG-68的抑菌活性

圖1 植物乳桿菌MXG-68所產(chǎn)細(xì)菌素抑菌圈

2.2 植物乳桿菌MXG-68的動(dòng)力學(xué)曲線

圖2 植物乳桿菌MXG-68抑菌活性的傳代穩(wěn)定性

圖3 植物乳桿菌MXG-68的生長(zhǎng)曲線及發(fā)酵曲線

由圖3可知，植物乳桿菌MXG-68呈現(xiàn)典型的S型生長(zhǎng)曲線，經(jīng)歷一個(gè)短暫的延滯期（0～4h），4～14h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14h進(jìn)入穩(wěn)定期，24h達(dá)到最大生長(zhǎng)量。細(xì)菌素的合成遵循其生長(zhǎng)模型，細(xì)菌素合成開(kāi)始于4 h，在穩(wěn)定期中部（24 h）達(dá)到最大合成量，抗菌活性在4～24 h呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，24～32 h呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。與植物乳桿菌P158相比，植物乳桿菌MXG-68的延滯期較短，菌種活力強(qiáng)，達(dá)到最大生長(zhǎng)量（提前12 h）和細(xì)菌素合成量（提前16 h）的時(shí)間短，能有效地提高設(shè)備的利用率，適合于工業(yè)化應(yīng)用[15]。

2.3 對(duì)人工胃液的耐受性

對(duì)人工胃液的耐受性是確保菌株在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)和存活的前提，亦是作為益生菌制劑的先決條件。人體及動(dòng)物胃液的p H一般為1～2，食物在胃中的排空時(shí)間一般為4 h，根據(jù)此設(shè)計(jì)植物乳桿菌MXG-68對(duì)人工胃液的耐受性試驗(yàn)[16-18]。由圖4可知，同一pH條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，植物乳桿菌MXG-68的存活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而在同一處理時(shí)間內(nèi)，隨著p H的增加，存活率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。p H=1的存活率顯著低于p H=2～4時(shí)的存活率（P＜0.01）。所有處理組的存活率均達(dá)到47.91%以上，說(shuō)明植物乳桿菌MXG-68對(duì)胃液的耐受性較強(qiáng)。與張開(kāi)屏的研究結(jié)果相類似[19]。

2.4 對(duì)人工腸液和膽鹽的耐受性

益生菌對(duì)腸液及膽鹽具有較高的耐受性是發(fā)揮益生作用的必要條件，腸液為堿性，p H值一般約為7.6，且正常小腸的膽鹽含量為0.03%～0.3%，食物在小腸中的停留時(shí)間一般為1～4 h，根據(jù)此設(shè)計(jì)植物乳桿菌MXG-68對(duì)人工腸液和膽鹽的耐受性試驗(yàn)[20-21]。

圖4 不同pH的人工胃液對(duì)植物乳桿菌MXG-68存活率的影響

圖5 不同膽鹽濃度的人工腸液對(duì)植物乳桿菌MXG-68存活率的影響

由圖5可知，人工腸液和膽鹽會(huì)導(dǎo)致植物乳桿菌MXG-68的存活率發(fā)生不同的變化?？莶菅挎邨U菌MX-6在人工腸液對(duì)照組的存活率在1～4 h時(shí)，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，此結(jié)果與植物乳桿菌R 1對(duì)人工腸液的耐受性相吻合。而在0.1%～0.4%膽鹽濃度的人工腸液中，隨著膽鹽濃度的升高，枯草芽孢桿菌MX-6的存活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但膽鹽的耐受能力高于植物乳桿菌GF103、植物乳桿菌AR 326及植物乳桿菌DJ-04[22-23]。所有處理組的存活率均達(dá)到72.61%以上，說(shuō)明植物乳桿菌MXG-68對(duì)人工腸液和膽鹽的耐受性較強(qiáng)。

2.5 植物乳桿菌MXG-68的黏附特性

黏附能力是益生菌定植于宿主腸道并發(fā)揮益生作用的前提條件，只有具備高黏附能力才能在適宜條件下迅速繁殖，合成大量的抑菌代謝產(chǎn)物，近而有助于調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡及激發(fā)免疫力。Caco-2細(xì)胞的形態(tài)及功能與正常小腸上皮細(xì)胞很接近，是研究益生菌黏附能力及機(jī)制較好的模型[24-26]。將經(jīng)熒光標(biāo)記標(biāo)記的植物乳桿菌MXG-68與Caco-2細(xì)胞孵育結(jié)束后，經(jīng)過(guò)計(jì)算獲得植物乳桿菌MXG-68對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附率高達(dá)64%，其黏附率高于周晏陽(yáng)（42%）和白潔（60%），黏附率不同可能是由于菌株個(gè)體差異所造成[27-28]。

2.6 植物乳桿菌MXG-68的耐藥性

宿主由于預(yù)防或治病為目的會(huì)使用抗菌藥物，益生菌在應(yīng)用過(guò)程中難免會(huì)遇到各種抗菌藥物，導(dǎo)致其生長(zhǎng)繁殖受到抑制，難以發(fā)揮更好的益生作用。且耐藥基因存在于質(zhì)粒上，易出現(xiàn)水平漂移，造成耐藥性水平擴(kuò)散，耐藥性是判斷菌株是否可成為益生菌制劑的關(guān)鍵條件之一。植物乳桿菌MXG-68對(duì)40種抗菌藥物表現(xiàn)出敏感性，但敏感的程度不同，對(duì)左氧氟沙星表現(xiàn)為低敏，對(duì)11中抗菌藥物包括頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢哌酮、頭孢唑啉、呋喃妥因、先鋒霉素Ⅳ、先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、利福平、羧芐青霉素、恩諾沙星表現(xiàn)為中敏，對(duì)其他28種抗菌藥物均表現(xiàn)為高敏（見(jiàn)表2）。與李平蘭、楊建濤的研究結(jié)果有所不同[29-30]。

表2 植物乳桿菌MXG-68對(duì)40種抗菌藥物的敏感性

3 結(jié) 論

植物乳桿菌是人及動(dòng)物腸道中正常的有益菌群之一，是工業(yè)生產(chǎn)中選擇制備益生菌制劑及食品發(fā)酵劑的常用菌種，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抑制有害菌定植、增強(qiáng)腸黏膜免疫等功能。分析植物乳桿菌的抑菌范圍寬窄、耐受性強(qiáng)弱、黏附性強(qiáng)弱及藥敏性是益生菌篩選過(guò)程中的重要指標(biāo)，直接決定了其存活率及在腸道停留的時(shí)間[31]。本研究綜合分析了植物乳桿菌MXG-68的益生特性，結(jié)果表明該菌株所產(chǎn)的細(xì)菌素同時(shí)可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，屬于廣譜細(xì)菌素，動(dòng)力學(xué)曲線說(shuō)明菌株的活力強(qiáng)、達(dá)到最大生長(zhǎng)量和細(xì)菌素合成量所需的時(shí)間短，對(duì)人工胃液、人工腸液和膽鹽具有較強(qiáng)的耐受性，對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附率高達(dá)64%，對(duì)40種抗菌藥物均表現(xiàn)為敏感。綜上所述，植物乳桿菌MXG-68具有作為益生菌的潛力和基本條件，有利于植物乳桿菌及其細(xì)菌素作為微生態(tài)制劑及新型生物防腐劑的應(yīng)用，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。