桃GRAS家族全基因組鑒定與響應(yīng)UV-B的表達模式分析

李晨，趙雪惠，王慶杰，王旭旭，肖偉，陳修德，付喜玲，李玲，李冬梅

桃家族全基因組鑒定與響應(yīng)UV-B的表達模式分析

李晨，趙雪惠，王慶杰，王旭旭，肖偉，陳修德，付喜玲，李玲，李冬梅

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室/山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東泰安 271018）

【目的】基因家族成員在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過生物信息學(xué)分析在桃基因組中的分布、結(jié)構(gòu)及進化，研究家族成員在不同組織中的表達特異性及其對UV-B的響應(yīng)，解析基因家族的生物學(xué)功能?！痉椒ā繉υO(shè)施油桃‘中油5號’（var.cv. Zhongyou5）補充適量UV-B（Ultraviolet-B）劑量，利用Plant TFDB數(shù)據(jù)庫鑒定桃基因家族成員。采用Clustal W、MEGA6.0、ProtParam tool、MCScanX、Circos、SMART、NCBI-CDD、ExPASy、GSDS和MEME等軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，繪制染色體定位圖，預(yù)測蛋白的相對分子質(zhì)量與等電點等理化性質(zhì)等，分析基因家族成員在不同組織中的表達模式，利用qRT-PCR技術(shù)檢測桃在UV-B處理下的表達情況。【結(jié)果】從桃全基因組中鑒定出48個GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族基因，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹將這48個成員分為9個亞家族，在桃的8條染色體上呈不均勻分布。對基因家族進行理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白平均長度為590.52 aa，等電點在4.36—7.56。家族基因結(jié)構(gòu)分析表明，有40個基因不含內(nèi)含子，8個基因含有1個內(nèi)含子。保守元件分析顯示，家族包含20個保守元件，其中Motif 2和4在的家族中高度保守，同一個亞家族成員含有相同的保守元件，其可能具備相似的功能。然而，有些亞家族成員的表達模式不同，這可能與其保守基序之外的序列有關(guān)。在不同組織中具有不同的表達模式。葉片中經(jīng)UV-B處理后上調(diào)表達最顯著，而有多達15個基因表達量呈現(xiàn)下調(diào)。果實中經(jīng)UV-B處理后上調(diào)表達，但有9個基因表達下調(diào)。韌皮部中，UV-B處理后有14個基因上調(diào)表達，而經(jīng)處理后在韌皮部中表達下調(diào)最明顯。【結(jié)論】從桃基因組中共鑒定出48個GRAS基因家族成員，分布于8條染色體上；多數(shù)能響應(yīng)UV-B處理，但在不同組織中的表達不盡相同。

桃；基因家族；生物信息學(xué)分析；UV-B

0 引言

【研究意義】桃是中國北方的主栽果樹之一，隨著果樹集約化栽培的推行，設(shè)施桃栽培得到了迅速發(fā)展。然而與露天栽培相比，設(shè)施栽培果樹表現(xiàn)出果實甜度變低、風(fēng)味偏淡、綜合品質(zhì)下降等問題，棚膜吸收、反射太陽光導(dǎo)致設(shè)施內(nèi)UV-B弱化是重要的影響因素之一[1]。基因家族成員在植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、GA信號調(diào)節(jié)和腋芽分生組織形成等[2]。對桃基因家族進行生物信息學(xué)分析、組織特異性表達及響應(yīng)UV-B處理的表達模式分析，有利于深入了解家族基因的潛在功能，并對桃響應(yīng)UV-B光信號的基因挖掘具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】自20世紀80年代后期，人類活動造成了臭氧層空洞，而臭氧量的減少導(dǎo)致到達地表的UV-B輻射增強。UV-B是紫外線中的中波輻射（280—320 nm），約占太陽輻射總量的1.5%。其能量高，且能被核酸、蛋白質(zhì)及脂類等物質(zhì)吸收。研究表明UV-B具有損傷DNA、改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；破壞光合作用；造成植株矮化、株型縮小，生長受抑制等負作用，對生態(tài)系統(tǒng)和動、植物生長產(chǎn)生深遠影響[1,3-4]。事實上，UV-B對植物的影響效應(yīng)具有雙重性，高UV-B輻射對植物生長產(chǎn)生不良影響，低劑量的UV-B在基因表達、代謝活動以及生長發(fā)育等方面反而會起到正面的調(diào)節(jié)作用[5-6]。UV-B輻射是應(yīng)激源還是調(diào)節(jié)器與其輻射強度和時間有關(guān)[7]。設(shè)施條件下的UV-B強度較露天弱，葉片中紫外吸收物質(zhì)較露天少，補充UV-B后含量總體得到提升[8]。比較紫外線敏感品種‘旭日’和不敏感品種‘朝陽’葉片中的類黃酮含量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)較高強度UV-B輻射后，前者類黃酮含量先升高后降低，變化明顯，后者則相對穩(wěn)定，表明朝陽更能有效適應(yīng)UV-B強度的增加[7]。光受體UV RESISTANCE LOCUS8（UVR8）被發(fā)現(xiàn)后，UV-B由環(huán)境脅迫因子變成了特殊的信號調(diào)控因子[1]，其在光感受中具有獨特的調(diào)節(jié)機制[9-10]。在UV-B處理后，UVR8能與下游多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而啟動光形態(tài)發(fā)生[11]。長時間以較低UV-B劑量照射作物，并未發(fā)現(xiàn)ROS積累及其編碼基因的表達，反而會啟動UVR8信號通路，引起良性應(yīng)激，但UV-B劑量超出作物承受范圍時會引起破壞性應(yīng)激[12]。更有研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)植物在UV-B輻射下表現(xiàn)出植株形態(tài)、生理生化和激素等各個方面的變化[1]。轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮尤為重要的作用?；蚣易逋ǔ１徽J為是植物特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族[13]，能夠響應(yīng)激素、光等多種信號來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。GRAS蛋白質(zhì)由可變的N末端和高度保守的C末端組成，其被稱為GRAS結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域主要由兩個亮氨酸七肽重復(fù)序列（LHRI和LHRII）組成的VHIID、PFYRE和SAW共3個基序組成[14-15]。在擬南芥中，將GRAS家族蛋白分為8個亞家族：DELLA、LS、SCR、SHR、PAT1、HAM、SCL9（LISCL）和SCL4/7[14]。而在水稻中[15]也認為可能會分為8個亞科，但包括一個新的亞家族SCL3，而不是SCL4/7。葡萄中GRAS家族蛋白序列也分成了8個亞家族，且其氨基酸序列主要為-螺旋和隨機卷曲，其三維結(jié)構(gòu)相似[16]。擬南芥、水稻和其他植物種類的GRAS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，其具有12個獨立的分支[17]，這些研究表明該基因家族在植物中表現(xiàn)出多樣化。其中，DELLA亞家族成員參與了擬南芥中的赤霉酸信號傳導(dǎo)[18]，葡萄中/可能響應(yīng)GA負調(diào)控參與無核果實的發(fā)育[19]，亞家族成員在番茄的腋芽分生組織中起作用[20]，亞家族成員、維持了擬南芥頂端分生組織的屬性與更新[17,21]，分支中的和作為光敏色素信號通路的中間介質(zhì)發(fā)揮作用[22]，亞家族成員對促進擬南芥的根細胞伸長起作用[23]。Ma等[24]證明在胡楊中過量表達（亞家族）增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性和耐鹽性。【本研究切入點】目前在模式植物擬南芥中，對基因家族的結(jié)構(gòu)、進化、相互作用機理以及抵御逆境等方面的研究較為深入。然而，在木本植物特別是果樹中該家族基因的系統(tǒng)報道較少，桃基因家族成員響應(yīng)UV-B光信號的功能有待進一步研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以設(shè)施栽培的‘中油5號’油桃的葉片、果實和韌皮部為研究材料，對家族中的48個成員進行生物信息學(xué)分析，旨在了解其基本理化性質(zhì)、家族分類、保守結(jié)構(gòu)域以及基因結(jié)構(gòu)等；通過檢測基因家族成員在UV-B處理后的葉片、果實和韌皮部中的表達水平，了解家族的基因性質(zhì)，篩選該家族中可能響應(yīng)UV-B光信號的重要基因。

1 材料與方法

試驗于2018年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院進行。

1.1 試驗材料

試材為7年生設(shè)施油桃‘中油5號’（var.cv. Zhongyou5）。自開花至果實成熟期間，用1.44 kJ·m-2·d-1UV-B照射處理植株（此劑量由前期試驗篩選得出）。UV-B由專用LED UV-B燈（40 W，297 nm，南京Kazhi）提供，懸掛在樹體上方1.5 m處，通過電子自動控制裝置控制紫外燈的開/關(guān)時間，每天上午9:30—10:30補充1 h，陰雨天和下雪天停止照射。使用配備有297 nm探針的UV-B型單通道UV輻照器（北京師范大學(xué)光電儀器廠）測定燈下80—120 cm范圍內(nèi)的UV-B輻射劑量為1.44 kJ·m-2·d-1，對該范圍內(nèi)的功能葉（以樹體外圍一年生枝的生長點為起始點，倒數(shù)第6—8片葉）、果實和一年生枝韌皮部進行取樣，以相同設(shè)施條件下未進行UV-B照射的‘中油5號’為對照，3次重復(fù)。液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 數(shù)據(jù)來源與分析方法

1.2.1 桃的獲取、理化性質(zhì)預(yù)測與基因染色體定位分析 從Plant TFDB（http://planttfdb.cbi.pku.edu. cn/）下載桃家族數(shù)據(jù)，利用SMART（http://smart. embl-heidelberg.de/）和NCBI-CDD工具進行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測，檢測候選蛋白的結(jié)構(gòu)域，去除不含GRAS結(jié)構(gòu)域的序列，篩選候選基因。利用ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）對所有GRAS家族氨基酸序列進行分子量和等電點預(yù)測。根據(jù)染色體的位置依次命名，利用MCScanX（http://chibba.pgml.uga. edu/mcscan2/）[25]和Circos軟件（http://circos.ca/）[26]繪制桃基因家族成員在染色體上的定位分布。2個或多個同源基因在染色體上的物理位置不超過100 kb即視為串聯(lián)重復(fù)基因[27]。

1.2.2 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建、結(jié)構(gòu)域分析及基因結(jié)構(gòu)分析 參照Nakano等[28]的分類方法，將擬南芥與桃家族成員的蛋白序列用Clustal W進行多重序列比對后導(dǎo)入進化樹分析軟件MEGA 6.0，采用相鄰連接法（neighbor-joining NJ；執(zhí)行參數(shù)：Bootstrap method 1000，Poisson model，Pairwise deletion）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，對桃GRAS蛋白進行亞族分類。利用MEME（http://me-me-suite.org/index.html）對桃保守域結(jié)構(gòu)進行分析。利用GSDS online（http://gsds.cbi. pku.edu.cn/）預(yù)測基因結(jié)構(gòu)。

1.3 總RNA的提取和qRT-PCR

使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，Cat No.DP441）提取液氮凍樣的RNA，利用HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒（Vazyme公司，中國）合成cDNA第一鏈。

采用實時熒光定量PCR的方法，用cDNA模板檢測各基因表達水平，利用Primer 3.0設(shè)計熒光定量引物，引物序列見表1，內(nèi)參為桃-Actin，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix（Vazyme）進行實時熒光定量PCR。qRT-PCR反應(yīng)體系為：10.0 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，上、下游引物分別為0.4 μL（10 μmol·L-1），1.0 μL模板，8.2 μL ddH2O。每個樣品進行3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，繪制溶解曲線，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。用2-??CT法對試驗數(shù)據(jù)進行定量分析。

表1 48個PpGRAS的qRT-PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，包括單因素方差分析和差異顯著性分析，應(yīng)用GraphPad Prism 6.01軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 桃GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族成員與染色體分布分析

從桃基因組序列中鑒定得到48個轉(zhuǎn)錄因子家族成員，根據(jù)基因在染色體上的位置，對所有轉(zhuǎn)錄因子進行系統(tǒng)編號。開放式閱讀框長度在1 218—2 550 bp，蛋白長度在406—850 aa，平均長度590.52 aa，分子質(zhì)量在45 828.1—78 010.1 Da，等電點在4.36—7.56，保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，鑒定出的48個PpGRAS蛋白均具有GRAS特征結(jié)構(gòu)域。桃轉(zhuǎn)錄因子的詳細信息見表2。

依據(jù)的染色體位置信息，利用Circos軟件繪制其染色體定位圖。由圖1可知，中有2個基因（和）無匹配的染色體定位信息。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，在桃的8條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，其中第6號染色體上分布最多，為14個；其次是第3號染色體，為7個；第5和7號染色體分布最少，均為3個。由于基因重復(fù)能顯著促進基因家族的擴展和蛋白質(zhì)功能的多樣化，本研究分析了該基因家族的串聯(lián)重復(fù)。結(jié)果顯示7對共線GRAS基因（/；；；；；；）和10個串聯(lián)GRAS基因（；），占總數(shù)的20.83%。共線基因是能通過復(fù)制在另一基因組以相同連續(xù)順序存在的旁系同源基因，除和外，所有共線都在同一亞家族中。

圖1 桃GRAS家族基因染色體定位及其共線性預(yù)測

表2 桃GRAS及其相關(guān)信息

2.2 桃GRAS蛋白序列與擬南芥系統(tǒng)進化樹的對比分析

通過與擬南芥蛋白聚類分析，將桃中48個GRAS蛋白分為9個亞家族（圖2），這些亞家族是根據(jù)早期研究分類[15]或他們中的一名成員在新發(fā)現(xiàn)的亞家族中命名，分別為PAT1、SHR、HAM、LISCL、SCR、LS、DELLA、SCL3、U。每個亞家族的GRAS成員可能具有相似或相關(guān)的功能。一般而言，大多數(shù)亞家族都擁有來自2個物種的GRAS成員（圖2）。然而，在桃中新鑒定出來的U亞家族不包括任何擬南芥成員，表明擬南芥中譜系特異性基因缺失。LISCL是最大的子家族，包含12個成員；而在擬南芥中LISCL也是最大的子家族，包含7個成員；其次是SCL3亞家族，有9個成員。PpGRAS家族成員共形成8個旁系同源基因?qū)Γ渲?對的自展值為100，而且Prupe.6G073900.1.p/Prupe.6G074000.1.p的自展值為99，U家族僅有的兩個成員Prupe.3G309800.1.p/Prupe. 8G054000.1.p的自展值達87。此外，PpGRAS與AtGRAS形成了14個直系同源基因?qū)?，其?2對的自展值為100（圖2）。

圖2 桃與擬南芥GRAS蛋白序列系統(tǒng)進化樹比對

2.3 桃GRAS家族保守元件和基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)多樣性作為進化的可能基礎(chǔ)，可以為多基因家族的進化提供有價值的信息[15,28]?；诿總€預(yù)測基因的編碼序列（CDS）和基因組DNA序列分析基因結(jié)構(gòu)（圖3）。桃中家族基因的內(nèi)含子數(shù)量最多為1，其中40個基因沒有內(nèi)含子，其余8個基因（Prupe.2G138400.1.p、Prupe.8G220900.1.p、Prupe. 6G300900.1.p、Prupe.6G073900.1.p、Prupe. 3G040400.1.p、Prupe.8G016200.1.p、Prupe.4G233000.1.p、Prupe. 3G309800.1.p）僅有1個內(nèi)含子。通常，來自桃中相同亞家族（SCL3、DELLA和LS）的具有相同的結(jié)構(gòu)。

圖3 桃GRAS結(jié)構(gòu)

為揭示桃中GRAS蛋白質(zhì)的多樣性，進一步確定桃家族成員間的關(guān)系，采用MEME預(yù)測桃家族基因中的元件。從候選的桃GRAS蛋白質(zhì)中共鑒定出20個保守元件（圖4），并列出了這些保守元件的結(jié)構(gòu)域序列標識（即氨基酸組成）（圖5）。本研究發(fā)現(xiàn)，所有的桃GRAS蛋白都含有Motif 4，表明其在的家族中高度保守；此外，高度保守的Motif 2同樣存在于桃所有GRAS蛋白中。其中motif 2、11在SCL3亞家族成員的N端高度保守，而DELLA亞家族的3個成員的保守基序表現(xiàn)出較好的一致性，共有10個保守元件（motif 2、3、4、7、9、15、17、18、19和20），LS亞家族共有8個保守元件（motif 2、3、4、7、11、15、17和19），HAM亞家族中有5個共有保守元件（motif 2、4、5、9和19），SCR亞家族中共有7個保守元件（motif 2、3、4、5、7、9和17），LISCL家族中具有特異性保守元件Motif 13和在其N端高度保守的Motif 16，SHR亞家族中僅有3個共有保守元件（motif 4、5和17），PAT1亞家族中共有9個保守元件（motif 2、3、4、5、6、7、9、17和19），U亞家族共有7個保守元件（motif 2、3、4、5、9、17和19）。由此發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育樹中密切相關(guān)的含有相同的保守元件，而且有的亞家族中具備專有的保守元件，表明同一個亞家族的基因具備相似的功能。從桃的基因結(jié)構(gòu)和保守元件位置分析，確定大多數(shù)成員在各個亞家族中是保守的。

圖4 桃GRAS基因家族保守元件

圖5 桃GRAS結(jié)構(gòu)域的序列標識

2.4 桃GRAS家族基因的組織特異性表達分析及其對UV-B的響應(yīng)

家族基因在葉片、果實和韌皮部中的組織特異性分析如圖6-A所示。48個在葉片、果實和韌皮部3種組織中均有表達，表達模式存在一定的差異。33.33%的基因（16個）在葉片中的表達量高于其余兩種組織。、和在桃韌皮部中高度表達；、、和在果實中的表達最高。UV-B處理后48個基因在3個組織中也均有表達，其表達模式與CK不盡相同。其中，和在葉片中的表達量高于其他組織；和在桃韌皮部中高表達；而有25個基因在果實中的表達量低于其他組織。并且，有8個基因（和）在3個組織中的表達水平基本一致。

響應(yīng)UV-B信號的在不同組織內(nèi)的表達量與CK的比值見圖6-B。在葉片中，和在UV-B處理后上調(diào)表達，而31.25%的基因（15個）表達量下調(diào)。在果實中，經(jīng)UV-B處理后上調(diào)表達，而有9個基因（和）下調(diào)表達。在韌皮部中，UV-B處理后有29.17%的基因（14個）上調(diào)表達，而和經(jīng)處理后表達下調(diào)。另外，有7個基因（和）經(jīng)UV-B處理后在各個組織內(nèi)均未表現(xiàn)出明顯變化。

3 討論

3.1 PpGRAS轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定和分析

是涉及植物生長和發(fā)育等各方面重要的轉(zhuǎn)錄因子?；蚣易逶谥参镏袕V泛分布，且家族成員的數(shù)量與基因組的大小無關(guān)[21]。植物體在生物進化過程中主要通過基因組的廣泛復(fù)制和多樣化，產(chǎn)生基因家族中的多成員[29-30]。在擬南芥中，家族發(fā)生了2次串聯(lián)重復(fù)事件[2]。而且，基因家族的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象在番茄、水稻、白楊和辣椒等物種中均被檢測到[2,21,31]。本研究鑒定出48個基因家族成員，低于水稻（57個）[15]、辣椒（58個）[21]和番茄（53個）[32]等作物，可能是由于桃基因組中沒有大規(guī)模的片段復(fù)制，且相對保守等原因造成的。通過染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，在桃基因組中廣泛分布，且存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，串聯(lián)重復(fù)基因占20.833%（10/48），這表明串聯(lián)重復(fù)在基因家族擴增和進化中起著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，水稻中的一些GRAS蛋白質(zhì)并未找到合適的亞家族[2]，本研究發(fā)現(xiàn)，在桃家族中同樣有兩個基因（）在系統(tǒng)進化樹分析中不屬于已知的8個亞家族，而且其可靠性達87，將其劃分為U亞家族，因而將桃中共劃分為9個亞家族[15]。該U亞家族成員基因的表達有所差異，其中在果實中表達較低，而在果實和韌皮部中表達都較低；UV-B處理后的表達基本不受影響，但的表達在韌皮部中上調(diào)。而DELLA、LISCL和PAT1亞家族的基因結(jié)構(gòu)具有明顯的一致性，表明這些亞家族的基因具備更為相似的功能。而且還發(fā)現(xiàn)LISCL和PAT1亞家族的基因表達模式同樣具有明顯的特異性，主要在葉中表達。但是有些亞家族內(nèi)基因的表達模式有所不同，可能參與了不同的生長發(fā)育過程。推測同一亞家族之間不同的表達差異可能與保守基序外的序列有關(guān)。此外，基因表達模式的研究可為家族基因的功能驗證提供依據(jù)?；蚣易宓南到y(tǒng)發(fā)育分析為進一步研究桃的功能基因組提供了理論基礎(chǔ)。

3.2 PpGRAS響應(yīng)UV-B處理的表達分析

GRAS蛋白在多種植物中被發(fā)現(xiàn)，功能呈多樣性，并在不同品種、不同組織和不同生長階段所發(fā)揮的作用不盡相同[2,32]。目前，模式植物擬南芥的基因家族中的多個亞家族成員的功能已被驗證[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，設(shè)施桃葉片、果實和韌皮部3個組織中均有多個響應(yīng)UV-B處理，響應(yīng)情況不盡相同。

3.2.1桃葉片中響應(yīng)UV-B光信號的表達分析 DELLA蛋白作為負調(diào)控因子參與了GA信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。當(dāng)DELLA蛋白接收GA信號時，會迅速降解，植株表現(xiàn)正常的GA響應(yīng)程序[23]，而突變體植株卻表現(xiàn)出GA不敏感表型[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，作為DELLA亞家族成員中同源基因，在UV-B處理后，在葉片中上調(diào)表達最為顯著。有研究表明，在桃上進行UV-B處理后造成了葉片中內(nèi)源赤霉素含量降低[34]。由此推測，UV-B處理后可能導(dǎo)致葉片中內(nèi)源赤霉素含量降低，又經(jīng)由GA信號調(diào)控了，從而使其上調(diào)表達。

矮牽牛中主要在側(cè)生器官原基和莖原維管組織中表達，對維持莖尖分生組織活性發(fā)揮了重要作用。矮牽牛突變體植株的葉片數(shù)明顯減少，莖尖分生組織喪失分化特性，阻止了器官的形成[35]。而本研究發(fā)現(xiàn)，桃HAM亞家族成員經(jīng)UV-B處理后在葉片中表達下調(diào)最為明顯，推測其可能響應(yīng)UV-B處理后對葉片的葉原基分化起著重要作用，具體功能尚需進一步驗證。

3.2.2桃果實中響應(yīng)UV-B光信號的表達分析 遠紅光、紅光和白光配合處理都降低了的轉(zhuǎn)錄水平，而且與SCL21相互作用的PAT1蛋白主要參與了phy A介導(dǎo)的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，作為PAT1亞家族中的同源基因，經(jīng)UV-B處理后在果實中顯著下調(diào)表達，表明基因家族成員在響應(yīng)UV-B光信號中也可能發(fā)揮了重要作用。

作為桃SCR亞家族的成員，在桃果實中經(jīng)UV-B處理后上調(diào)表達最為顯著。SHR和SCR蛋白的作用會導(dǎo)致細胞分裂過程的缺陷[36]，相似結(jié)果也在水稻[37]和玉米[38]中發(fā)現(xiàn)；而且不僅參與了根的發(fā)育調(diào)控，同時也參與了葉片保衛(wèi)細胞的形成[39]。陳麗華等[40]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GA處理后的‘無核白雞心’葡萄的果形明顯拉長，而且在GA處理后呈現(xiàn)整體性的上調(diào)表達，可能在響應(yīng)GA處理后調(diào)控了葡萄果實細胞的分裂和分化。因而，推測可能具有響應(yīng)UV-B光信號調(diào)控桃果實縱、橫徑的功能。

3.2.3桃韌皮部中響應(yīng)UV-B光信號的表達分析 在擬南芥根部，SCL3能作為GAI和RGA的衰減子調(diào)控伸長區(qū)和分化區(qū)細胞的伸長，SCL3-DELLA互作調(diào)節(jié)的GA信號途徑，能與SHR/SCR途徑聯(lián)合調(diào)控分裂區(qū)基本組織的分裂時間和程度[23]。相似的結(jié)論同樣出現(xiàn)在毛竹中[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，SCL3亞家族成員在韌皮部中經(jīng)UV-B處理后下調(diào)表達最為明顯，推測可能負響應(yīng)UV-B光信號，減弱對桃韌皮部細胞分裂程度的抑制。

果實發(fā)育過程中，如果基因在幼果期的表達水平高于成熟期，則其可能在果實前期發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。黃偉[32]研究發(fā)現(xiàn)，番茄中的表達在果實轉(zhuǎn)色期有顯著上升，其可能對啟動果實成熟具有重要作用。而本研究發(fā)現(xiàn)，作為的同源基因，經(jīng)UV-B處理后在韌皮部中上調(diào)表達最為明顯，說明其可能在“源-庫”間有機物的運輸中起著重要作用。

4 結(jié)論

通過生物信息學(xué)分析預(yù)測出48個桃基因家族成員，分為9個亞家族，基因結(jié)構(gòu)、染色體分布和保守元件分布等多種生信分析表明這些基因在進化過程中比較保守。采用qRT-PCR技術(shù)對桃基因家族成員進行組織特異性分析，發(fā)現(xiàn)48個基因在葉片、果實和韌皮部中均有表達，但表達變化不盡相同。本研究還探索了基因家族成員對UV-B的響應(yīng)模式，發(fā)現(xiàn)多數(shù)能響應(yīng)UV-B處理，表明基因家族可能在光響應(yīng)方面發(fā)揮著多種潛在功能。

[1] 李冬梅, 李少旋, 徐功勛, 李晨, 付喜玲, 陳修德, 張海森, 高東升. 設(shè)施作物響應(yīng)UV-B輻射的研究進展. 植物生理學(xué)報, 2018, 54(1): 36-44.

Li D M, Li S X, Xu G X, Li C, FU X L, Chen X D, Zhang H S, Gao D S. Research advances of plant response to UV-B radiation in greenhouse., 2018, 54(1): 36-44. (in Chinese)

[2] Liu X Y, Widmer A. Genome-wide comparative analysis of the GRAS gene family in populus,and rice., 2014, 32: 1129-1145.

[3] Gill S S, Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants., 2010, 48(12): 909-930.

[4] Lidon F C, Teixeira M, Ramalho J C. Decay of the chloroplast pool of ascorbate switches on the oxidative burst in UV-B-irradiated rice., 2012, 198(2): 130-144.

[5] Li F R, Peng S L, Chen B M, Hou Y P. A meta-analysis of the responses of woody and herbaceous plants to elevated ultraviolet-B radiation., 2010, 36(1): 1-9.

[6] Ballare C L, Caldwell M M, Flint S D, Robinson S A, Bornman J F. Effects of solar ultraviolet radiation on terrestrial ecosystems. patterns, mechanisms, and interactions with climate change., 2011, 10(2): 226-241.

[7] Frohnmeyer H, Staiger D. Ultraviolet-B radiation-mediated responses in plants, balancing damage and protection., 2003, 133(4): 1420-1428.

[8] 郭玉才. 不同棚膜及人工補充紫外線B對設(shè)施桃樹形態(tài)建造和葉片生理的影響[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

Guo Y C. Effects of film and UV-B on morphology and leaf physiology of peach tree in greenhouse [D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2009. (in Chinese)

[9] Christie J M, Arvai A S, Baxter K J, Heilmann M, Pratt A J, O’hara A, Kelly S M, Smith B O, HITOMI K, JENKINS G I, GETZOFF E D. Plant UVR8 photoreceptor senses UVB by tryptophan-mediated disruption of cross-dimer salt bridges., 2012, 335(6075): 1492-1496.

[10] Wu D, Hu Q, Yan Z, Chen W, Yan C Y, HUANG X, ZHANG J, YANG P Y, DENG H T, WANG J W, DENG X W, SHI Y G. Structural basis of ultraviolet-B perception by UVR8., 2012, 484(7393): 214-219.

[11] Osterlund M T, Hardtke C S, Wei N, Deng X W. Targeted destabilization of HY5 during light-regulated development of., 2000, 405(6785): 462-466.

[12] Hideg E, Jansen M A K, Strid A. UV-B exposure, ROS, and stress: Inseparable companions or loosely linked associates?, 2013, 18(2): 107-115.

[13] Sun X l, Jones W T, Rikkerink E H a. GRAS proteins: The versatile roles of intrinsically disordered proteins in plant signalling., 2012, 442(1): 1-12.

[14] Bolle C. The role of GRAS proteins in plant signal transduction and development., 2004, 218(5): 683-692.

[15] Tian C g, Wan P, Sun S h, Li J y, Chen M s. Genome-wide analysis of the GRAS gene family in rice and., 2004, 54(4): 519-532.

[16] 孫欣, 王晨, 房經(jīng)貴, 慕茜, 王西成. 葡萄GRAS基因家族生物信息學(xué)分析. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2011, 23(7):1-8.

Sun X, Wang C, Fang J G, Mu Q, Wang X C. Bioinformatics analysis of GRAS gene family in grapevine., 2011, 23(7): 1-8. (in Chinese)

[17] Engstrom E M. Phylogenetic analysis of GRAS proteins from moss, lycophyte and vascular plant lineages reveals that GRAS genes arose and underwent substantial diversification in the ancestral lineage common to bryophytes and vascular plants., 2011, 6(6): 850-854.

[18] Peng J R, Carol P, Richards D E, King K E, Cowling R J, Murphy G P, Harberd N P. TheGAI gene de?nes a signaling pathway that negatively regulates gibberellin responses., 2017, 11(23): 3194-3205.

[19] 張文穎, 朱旭東, 崔騰飛, 賈海峰, 房經(jīng)貴, 王晨. 葡萄VvRGL基因應(yīng)答GA調(diào)控?zé)o核果實發(fā)育的研究. 西北植物學(xué)報, 2019, 39(3): 381-390.

Zhang W Y, Zhu X D, Cui T F, Jia H F, Fang J G, Wang C. VvRGL genes regulate seedless fruit development by responding to GA in grapevine., 2019, 39(3):381-390. (in Chinese)

[20] Schumacher K, Schmitt T, Rossberg M, Schmitz G, Theres K. The Lateral suppressor (Ls) gene of tomato encodes a new member of the VHIID protein family., 1999, 96(1): 290-295.

[21] 張煥欣, 董春娟, 尚慶茂. 辣椒GRAS家族全基因組鑒定與表達分析. 園藝學(xué)報, 2017, 44(12): 2305-2317.

Zhang H X, Dong C J, Shang Q M. Genome-wide identification and expression analysis of GRAS gene family in pepper., 2017, 44(12): 2305-2317. (in Chinese)

[22] 周蓮潔, 張富春, 王艷. GRAS家族基因在植物生長、代謝及逆境脅迫中的功能研究進展. 植物生理學(xué)報, 2013, 49(9): 855-860.

Zhou L J, Zhang F C, Wang Y. Research progress on the functional mechanism of GRAS family genes in plant growth, metabolism and stress., 2013, 49(9): 855-860. (in Chinese)

[23] Heo J O, Chang K S, Kim I A, Lee M H, Lee S A, Song S K, Lee M M, Lim J. Funneling of gibberellin signaling by the GRAS transcription regulator SCARECROW-LIKE 3 in theroot., 2011, 108(5): 2166-2171.

[24] Ma H S, Liang D, Shuai P, Xia X L, Yin W L. The salt- and drought-inducible poplar GRAS protein SCL7 confers salt and drought tolerance in., 2010, 61(14): 4011-4019.

[25] Wang Y P, Tang H B, Debarry J D, Tan X, Li J P, Wang X Y, Lee T H, Jin H Z, Marler B, Guo H, Kissinger J C, Paterson A H. MCScanX: A toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity., 2012, 40(7): e49.

[26] Krzywinski M, Schein J, BIROL I. Circos: An information aesthetic for comparative genomics., 2009, 19(9): 1639-1645.

[27] Huang S X, Gao Y F, Liu J K, Peng X L, Niu X L, Fei Z J, Cao S Q, Liu Y S. Genome-wide analysis of WRKY transcription factors in., 2012, 287(6): 495-513.

[28] Nakano T, Suzuki K, Fujimura T, Shinshi H. Genome-wide analysis of the ERF gene family inand rice., 2006, 140(2):411-432.

[29] 孫明岳, 周君, 譚秋平, 付喜玲, 陳修德, 李玲, 高東升. 蘋果bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學(xué)分析及其在休眠芽中的表達. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(7): 1325-1345.

Sun M Y, Zhou J, Tan Q P, Fu X L, Chen X D, Li L, Gao D S. Analysis of basic leucine zipper genes and their expression during bud dormancy in apple (×)., 2016, 49(7): 1325-1345. (in Chinese)

[30] Song J, Gao Z H, Huo X M, Sun H L, Xu Y S, Shi T, Ni Z J. Genome-wide identification of the auxin response factor (ARF) gene family and expression analysis of its role associated with pistil development in Japanese apricot (Sieb. et Zucc)., 2015, 37: 145.

[31] Huang W, Xian Z Q, Kang X, Tang N, Li Z G. Genome-wide identification, phylogeny and expression analysis of GRAS gene family in tomato., 2015, 15(1): 209.

[32] 黃偉. 番茄GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定及SlGRAS24基因的功能研究[D]. 重慶: 重慶大學(xué), 2016.

Huang W. Comprehensive genome-wide analysis of the GRAS transcription factor family in tomato and functional identification of SlGRAS24[D]. Chongqing: Chongqing University, 2016. (in Chinese)

[33] Acharda P, Vriezen W H, van der Straeten D, Harberd N P. Ethylene regulates Arabidopsis development via the modulation of ELLA protein growth repressor function., 2003, 15(12): 2816-2825.

[34] 吳杏春. 水稻對UV-B輻射增強的生理生化響應(yīng)及其適應(yīng)機制研究[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2001.

WU X C. Studies on physiochemical response and its adaptive mechanism of rice (L.) exposed to enhanced Ultraviolet- B radiation [D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2001. (in Chinese)

[35] Huang W, Peng S Y, Xian Z Q, Lin D B, Hu G J, Yang L, Ren M Z, Li Z G. Overexpression of a tomato miR171 target gene, SlGRAS24 impacts multiple agronomical traits via regulating gibberellin and auxin homeostasis., 2016, 15(4): 472-488.

[36] Koizumi K, Wu S, MacRae-Crerar A, Gallagher K L. An essential protein that interacts with endosomes and promotes movement of the SHORT-ROOT transcription factor.2011, 21(18): 1559-1564.

[37] Kamiya N, Itoh J I, Morikami A, Nagato Y, Matsuoka M. The SCARECROW gene’s role in asymmetric cell divisions in rice plants., 2003, 36(1): 45-54.

[38] Lim J, Helariutta Y, Specht C D, Jung J, Sims L, Bruce W B, Diehn S, Benfey P N. Molecular analysis of the SCARECROW gene in maize reveals a common basis for radial patterning in diverse meristems., 2000, 12(8): 1307-1318.

[39] 董麗莉, 趙韓生, 李利超, 孫化雨, 王麗麗, 高志民. 毛竹PeSCL3基因表達特征及其啟動子活性研究. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報, 2016, 24(3): 252-258.

Dong L L, Zhao H S, Li L C, Sun H Y, Wang L L, Gao Z M. Expression characteristics and promoter activity analysis ofgene from phyllostachys edulis., 2016, 24(3): 252-258. (in Chinese)

[40] 陳麗華, 葛暉, 柴麗娟, 陳尚武, 馬會勤. 葡萄SCARECROW基因家族的分析與表達. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2012, 17(1): 80-87.

Chen L H, Ge H, Chai L J, Chen S W, Ma H Q. Putative SCARECROW gene family ofL. and their differential expression under GA treatment., 2012, 17(1): 80-87. (in Chinese)

Genome Identification ofFamily and Expression Pattern Analysis of Responding to UV-B in Peach

LI Chen, ZHAO XueHui, WANG QingJie, WANG XuXu, XIAO Wei, CHEN XiuDe, Fu XiLing, LI Ling, LI DongMei

(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology/Shandong Collaborative Innovation Center for Fruit & Vegetable Production with High Quality and Efficiency, Taian 271018, Shandong)

【Objective】transcription factor family genes play a key role in the regulation of plant growth and development. The objectives of this study were to analyze the distribution, structure and evolution ofin the peach genome by bioinformatics, to study the expression specificity of family members in different tissues and their responses to UV-B optical signal, and to investigate the biological function oftranscription factor family genes in peach. 【Method】The facility nectarine ‘var.cv. Zhongyou5 was supplemented with an appropriate dose of UV-B (Ultraviolet-B).The peachgene in the peach genome was identified by using the Plant TFDB database.Phylogenetic tree, chromosome localization, relative mass and isoelectric point and other physical and chemical properties ofmember were analyzed with Clustal W, MEGA6.0, ProtParam tool, MCScanX, Circos, SMART, NCBI-CDD, ExPASy, GSDS2.0, and MEME, respectively. The expression pattern ofgene family in different tissues was analyzed, and the expression of some members ofgene family in peach treated with UV-B was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR).【Result】48 members oftranscription factor family were identified from the whole genome of the peach, and they could be divided into 9 categories by constructing a phylogenetic tree. Thegene showed uneven distribution on 8 chromosomes of peach. The theoretical isoelectric point of the family protein was ranged from 4.36 to 7.56, and the average number of amino acids encoded was 590.52. Gene’s structure analysis showed that 40 genes contained no introns, and 8 genes contained 1 intron. Conservative elemental analysis revealed that thefamily contains 20 conserved elements, of which Motif 2 and Motif 4 were highly conserved in thefamily. Members of the same subfamily contained the same conserved elements, suggesting that members of the same subfamily might have similar functions. However, some subfamily members had different expression patterns, which might be related to sequences other than the conserved motif. Thegenes had different expression patterns in different tissues; and most ofgenes could respond to UV-B treatment, but the expression changes were different in different tissues. In leaves,was up-regulated after UV-B treatment, while up to 15 genes were down-regulated. In the fruit,was up-regulated by UV-B treatment, but 9 genes were down-regulated. In the phloem, 14 genes were up-regulated after UV-B treatment, whilewas most down-regulated in the phloem after treatment. 【Conclusion】A total of 48gene family members were identified from the peach genome and distributed on 8 chromosomes; mostgenes responded to UV-B treatment, but the expression changes were different in different tissues. This study laid the foundation for further analysis of thefamily of genes in response to UV-B light signals and other potential functions.

peach;gene family; bioinformatic analysis; UV-B

2019-06-11；

2019-08-03

國家自然科學(xué)基金（31601706）、山東省自然科學(xué)基金（ZR2016CM09）

李晨，Tel：15650453756；E-mail：15650453756@163.com。通信222作者李冬梅，Tel：0538-8246263；E-mail：dmli2002@sdau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）