肉?？谔阋呙庖呖贵w、3ABC抗體、RT-PCR核酸檢測(cè)結(jié)果分析

朵玉明， 何彥春

(1.甘肅省肅南縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，甘肅 肅南 734000；2.張掖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 張掖 734000)

2017年11月，張掖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心對(duì)甘州區(qū)3個(gè)肉牛養(yǎng)殖戶臨床檢查健康的28頭肉牛開展了免疫抗體檢測(cè)和口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC檢測(cè)，對(duì)口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體陽性牛間隔14 d分2次采集O-P液，開展了口蹄疫病毒核酸RT-PCR檢測(cè)?，F(xiàn)就檢測(cè)過程和結(jié)果分析如下，以供廣大同行參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

張掖市某地?cái)M外調(diào)的肉牛共28頭，分屬3戶養(yǎng)殖戶，均為6～8月齡牛，臨床檢查健康。注射?？谔阋逴型、亞洲I型二價(jià)口蹄疫滅活疫苗后21 d采集血清樣品開展O型口蹄疫免疫抗體和3ABC抗體檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果出來后對(duì)3ABC抗體陽性的27頭牛分2次采集O-P液，并開展口蹄疫病毒核酸實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，2次采樣間隔時(shí)間14 d。

1.2 檢測(cè)試劑

口蹄疫O型正向間接血凝抗原、口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測(cè)ELISA試劑盒、口蹄疫病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)分別為：20170802201、20171027129和20170703101。

1.3 檢測(cè)方法

口蹄疫O型正向間接血凝實(shí)驗(yàn)被檢血清稀釋度從(1∶2)～(1∶2048)，其余步驟按照試劑盒說明，由張掖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室完成檢測(cè)。口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體ELISA檢測(cè)完全按照試劑盒說明書進(jìn)行，由張掖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室和甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室同步進(jìn)行檢測(cè)?？谔阋卟《竞怂釋?shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)完全按照試劑盒說明進(jìn)行，由甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室完成檢測(cè)。

2 檢測(cè)結(jié)果

2.1 O型口蹄疫免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

共檢測(cè)28份樣品，其中2份樣品抗體效價(jià)達(dá)26，5份達(dá)27，7份達(dá)28，6份達(dá)29，6份達(dá)210，2份達(dá)212。農(nóng)業(yè)部《2017年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》口蹄疫監(jiān)測(cè)方案規(guī)定，正向間接血凝試驗(yàn)：抗體效價(jià)≥25判為合格，據(jù)此判定，28份被檢樣品抗體全部合格，合格率100%。

2.2 口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測(cè)結(jié)果

共檢測(cè)28份樣品，其中陽性27份、陰性1份，陽性率96.4%。

2.3 口蹄疫O-P液PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)3ABC檢測(cè)結(jié)果為陽性的27頭牛分2次采集O-P液，2次間隔時(shí)間14 d，27頭牛2次實(shí)時(shí)熒光RT-PCR口蹄疫病毒核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性。詳細(xì)檢查結(jié)果見表1。

表1 檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

(1)正向間接血凝試驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，試劑價(jià)格低等特點(diǎn)，用來檢測(cè)0型口蹄疫免疫抗體時(shí)和液相阻斷ELISA試驗(yàn)結(jié)果相差不大。按照口蹄疫正向間接血凝試驗(yàn)試劑盒操作說明，被檢血清最高稀釋至1∶29。根據(jù)多年來的檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，口蹄疫滅活苗首次免疫牛后3周用正向間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)抗體，合格血清抗體滴度一般集中在(1∶25)～(1∶27)之間，個(gè)別可達(dá)1∶29，抗體合格率一般在65%～75%之間。二次加強(qiáng)免疫后，抗體效價(jià)和免疫合格率顯著上升。本次試驗(yàn)中的牛為6～8月的犢牛，均為首次免疫。為進(jìn)一步掌握免疫抗體滴度，特意將血清稀釋至1∶212,結(jié)果抗體滴度大于1∶29有8份，占28.6%，抗體滴度達(dá)1∶212有2份。從抗體檢測(cè)結(jié)果分析，部分被檢樣品抗體滴度超高，應(yīng)該不是疫苗后產(chǎn)生的免疫抗體，可能是口蹄疫病毒隱形感染所致。

(2)口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測(cè)結(jié)果是判斷動(dòng)物是否有口蹄疫病毒感染的可靠方法[1]。本次試驗(yàn)中，被檢的28份樣品中有27份樣品呈陽性，且省、市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心檢測(cè)結(jié)果一致。從檢測(cè)結(jié)果判斷，27頭陽性牛曾隱性感染過口蹄疫病毒。

(3)采集O-P液進(jìn)行口蹄疫病原學(xué)檢測(cè)是口蹄疫檢測(cè)技術(shù)規(guī)范中規(guī)定的方法。徐春志等[2]報(bào)道，26份口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性的奶牛中,9份奶牛O-P液樣本顯示口蹄疫病毒核酸陽性,經(jīng)血清型鑒別均為O型口蹄疫病毒。本次試驗(yàn)中分2次對(duì)3ABC抗體檢測(cè)結(jié)果陽性的牛采集O-P液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，2次結(jié)果均為陰性。從理論上來說，被檢測(cè)牛3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果陽性則表明感染過口蹄疫病毒，按照口蹄疫病毒特性，病毒在反芻動(dòng)物咽喉部可存活很長(zhǎng)時(shí)間。本次檢測(cè)中2次檢測(cè)結(jié)果均為陰性，是口蹄疫病毒已經(jīng)消失還是其他原因，有待進(jìn)一步研究。