發(fā)酵技術(shù)炮制膽汁相關(guān)方藥傳統(tǒng)工藝概述

裴育瑩 程發(fā)峰 譚令 黃御璋 王慶國

發(fā)酵是指用微生物分解有機物質(zhì)的過程。中國傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)已綿延4000余年，酒、醋、醬、豆豉等都是這一技術(shù)的精華?！洞呵锞暋吩弧胞滉幰?，黍陽也，先漬麴而投黍，是陽得陰而沸，故以麴釀黍為酒”，為制曲釀酒之法。發(fā)酵法一直是中藥炮制方法之一，從中藥發(fā)酵的發(fā)展史來看，其與傳統(tǒng)食品發(fā)酵同出一轍，有些中藥甚至食藥兼用。藥用膽汁多來源于動物豬、牛、羊、雞等，現(xiàn)有很多中藥結(jié)合膽汁進行發(fā)酵，經(jīng)膽汁發(fā)酵可轉(zhuǎn)變藥性、降低毒性、提高中藥有效成分的含量以增強療效、產(chǎn)生新的有效成分以擴大中藥應用范圍。正如《本草正》云：“治小兒急驚，實痰實火壅閉上焦，氣喘煩躁，焦渴脹滿。膽南星，七制九制者方佳，較之南星味苦性涼，故善解風痰熱滯?！崩顣r珍《本草綱目》在論述黃連中提到：“治本臟之火，則生用之；治肝膽之火，則以豬膽汁浸炒。”

1 膽汁生理功能

膽汁具有乳化食物脂類，促進其消化吸收的作用，且作為排泄液可將某些非營養(yǎng)物質(zhì)特別是生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物排出體外，還具中和胃酸的作用。膽汁酸(bile acid,BA)是膽汁的主要成分，由肝細胞內(nèi)的膽固醇合成，在許多生化過程中起關(guān)鍵作用[1]。BAs還作為信號分子，誘導某些基因反過來調(diào)節(jié)膽汁酸的合成、運輸、攝取和代謝[2]。膽汁中的初級膽汁酸與次級膽汁酸以鈉鹽或鉀鹽的形式存在，在促進脂質(zhì)消化和吸收中起關(guān)鍵作用。膽鹽通過促進脂肪酶/副脂肪酶復合物在脂/水界面的吸附來促進酶催化的脂解作用，并將不溶性脂解產(chǎn)物從界面解吸出來，將其轉(zhuǎn)化為混合膠束，運送到腸粘膜并被吸收[3-4]。

2 膽汁藥用功效

雞膽的藥用始見于《名醫(yī)別錄》，雞的膽汁味苦微寒、無毒，有祛痰平喘止咳、清熱解毒、明目、鎮(zhèn)靜之功效，傳統(tǒng)用于小兒百日咳、氣管炎、肺炎、外感所致之咳嗽，療效確切[5-6]，王玥[7]發(fā)現(xiàn)雞膽汁外源體(Exosomes)具有促進肝臟CD4+T淋巴細胞增殖的作用，并且一定劑量的Exosomes具有抗J亞型禽白血病病毒(ALV-J)的作用；豬膽汁具有清熱、解毒、滋陰潤肺之功效，對多種呼吸系統(tǒng)疾病等均有較好的療效，張中泉等[8]發(fā)現(xiàn)豬膽汁乙醇提取物對痢疾桿菌、肺炎球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長均有顯著抑制作用；在對羊膽汁中的有效成分牛磺膽酸、牛磺鵝去氧膽酸鈉的研究中顯示，其均能明顯抑制前列腺素、一氧化氮和白介素6等炎性介質(zhì), 從而對急慢性炎癥產(chǎn)生明顯的抑制作用[9]；兔膽汁具有降低膽固醇、降低血壓的作用，同時還具有一定的解熱、抗炎及利膽作用；蟾蜍膽汁具有良好的解熱、鎮(zhèn)咳及利膽的功效。

3 體外培育牛黃相關(guān)研究

牛膽汁首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。牛膽汁對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜或麻醉作用，可用于治療消化不良及便秘[10]。牛黃即牛的膽結(jié)石，又名“土精”“丑寶”，最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有化痰開竅，涼肝熄風之效?！吨袊幍洹?015版規(guī)定，天然牛黃按干燥品計算，含膽酸不得少于4.0%，含膽紅素不得少于25.0%[11]，但天然牛黃成石率僅為1～2%[12]，藥物匱乏，價格昂貴。

3.1 發(fā)酵技術(shù)炮制體外培育牛黃

上世紀70年代，一些醫(yī)藥人員進行人工牛黃的研究，應用牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、膽紅素、?；撬崴氐扰渲贫傻姆勰涑煞?、結(jié)構(gòu)、含量等均與天然牛黃相差甚遠；后中國多地醫(yī)藥工作者利用活牛膽囊，在其內(nèi)培植牛黃，但手術(shù)復雜，產(chǎn)量低，質(zhì)量不穩(wěn)定。2000年后相關(guān)科研單位進行體外培育牛黃，在牛膽汁中加入一定量大腸桿菌、腸球菌、變形桿菌的單一菌液或其組合菌液，對牛膽汁進行細菌發(fā)酵處理，隨后利用發(fā)酵牛膽汁和澄清飽和鈣鹽制取有效成分的沉淀物，根據(jù)藥用要求加入適量的膽紅素、膽酸、去氧膽酸和無機鹽，制作出復合膽紅素鈣；最后利用復合膽紅素鈣和發(fā)酵牛膽汁在體外培育牛膽結(jié)石[13]。用該方法使生產(chǎn)周期更短，效率更高，精確地控制了反應條件，保證了培育牛黃質(zhì)量穩(wěn)定均一。

3.2 三種牛黃成分鑒別

膽汁酸和膽紅素是天然牛黃的主要活性成分，同時也是牛黃中含量最高的成分。張宇靜等[14]建立超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定三種牛黃中膽汁酸類成分含量，發(fā)現(xiàn)豬去氧膽酸是人工牛黃的特有成分，膽酸和去氧膽酸在體外培育牛黃中含量豐富，天然牛黃中膽酸、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c、去氧膽酸4種膽汁酸含量豐富。雷凱等[15]通過建立HPLC-MS/MS法測定證實了雖然天然牛黃(cow bezoar,CB)比體外培育牛黃(CBS)總膽汁酸含量少，但CB中的結(jié)合膽汁酸多于CBS。有相關(guān)研究報道[16]腸道內(nèi)的微生物群落改變膽汁酸池，從而在一定程度上導致或減少疾病的發(fā)生，由此推測牛黃類藥物中結(jié)合型膽汁酸含量可能與牛黃類藥物的某些療效有相關(guān)性。

3.3 體外培育牛黃現(xiàn)代藥理研究

3.3.1 解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用 有研究表明[17]體外培育牛黃可顯著抑制酵母所致大鼠發(fā)熱及傷寒副傷寒三聯(lián)疫苗致家兔發(fā)熱，其解熱作用強度與牛黃相似。張韶輝等人[18-19]以蟾蜍坐骨神經(jīng)干和三叉神經(jīng)節(jié)細胞為標本，實驗中發(fā)現(xiàn)不同濃度的體外培育牛黃可劑量依賴性地抑制三叉神經(jīng)節(jié)細胞細胞膜上總鈉及鈣通道電流，此可能為體外培育牛黃發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機制。體外培育牛黃可顯著抑制急性炎癥的滲出和白細胞趨化，降低相關(guān)炎性因子的釋放以及炎癥的瀑布效應等[20]。

3.3.2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用 張新奇等[21]研究顯示體外培育牛黃能通過改善患者腦部缺血狀態(tài)，同時降低機體耗氧量，促進腦部血液循環(huán)，增加血管彈性從而促進腦中風患者意識的恢復。有研究表明[22]體外培育牛黃可明顯延長缺氧小鼠存活時間，減輕腦組織的病理損傷。且體外培育牛黃可以減輕海人酸致癇大鼠的神經(jīng)病理學改變，保護海馬結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元[23]。

3.3.3 心血管、呼吸、消化系統(tǒng)作用 基于小鼠動物實驗研究表明[24]，體外培育牛黃可對心肌缺血-再灌注損傷起到明顯的保護作用，其機制可能與抗自由基損傷有關(guān)。劉靈等[25]研究表明體外培育牛黃可以降低炎癥因子-17水平，以減輕炎癥反應，并可減少肺組織中Caspase-3表達，有抑制大鼠肺泡上皮細胞凋亡的作用。周鳳蕊等[26]對74名黃疸型肝炎患者進行臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培育牛黃可改善患者肝功能，提升臨床療效。有研究表明[27]體外培育牛黃可降低慢性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的疾病活動指數(shù)，同時減輕了結(jié)腸的組織病理損傷。

3.3.4 抗腫瘤和抗衰老作用 汪世元等[28]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)體外培育牛黃能誘導人肝母細胞瘤HepG2細胞凋亡，認為體外培育牛黃具有抗腫瘤作用。體外培育牛黃還可降低老年小鼠心、腦組織的脂褐素、MDA含量，提高SOD活性，提高老年小鼠生存率，具有抗衰老作用[29]。

4 膽南星古今炮制演變與分析

天南星在中國擁有兩千多年的用藥歷史，其味苦、氣味辛，性溫，有毒，臨床用于頑痰咳嗽、風痰眩暈、中風、口眼渦斜、驚風等疾病的治療，有祛風定驚、燥濕化痰、消腫散結(jié)的功效。天南星有很多炮制品，膽南星為其炮制品之一。天南星有大毒，用膽汁炮制后可降低其毒性，膽南星常用于痰熱咳嗽、中風痰迷、癲狂驚癇等癥。

4.1 膽南星的炮制演變

膽南星最早見于宋代《圣濟總錄》，用膽汁制南星最早記錄于宋代《小兒藥證直決》即采用牛膽汁制備天南星——“臘月釀牛膽中陰干百日”?！短交菝窈蛣┚址健匪鶆?chuàng)牛膽汁制餅法“湯洗，焙，為末，用牛膽汁和作餅，焙干”，被認為可能是現(xiàn)今部分地區(qū)炮制膽南星方法的起源。元明年代沿用了前人的炮制方法，而且對制作工藝如炮制時間、膽汁品質(zhì)等進行了更為詳細的記載，如《丹溪心法》中提到“須用黃枯牛膽，臘月粉南星親手修合，風干，隔一年用。牛膽須入三、四次者佳”?！侗静菥V目》中有造膽星法：“以南星生研末，臘月取黃枯牛膽汁，和劑納入膽中，系懸風處干之，年久者彌佳?！鼻宕院蟪赜们胺?，更是有九制膽星法、酒蒸膽星法和桃仁牛膽共制法[30-32]?，F(xiàn)代炮制膽南星多采用發(fā)酵法和混合蒸制法，其中發(fā)酵工藝目前無統(tǒng)一規(guī)范，有報道稱發(fā)酵的膽汁種類和時間是炮制膽南星的直接因素，影響膽南星的功效[33]，所用膽汁有牛膽汁、羊膽汁、豬膽汁，發(fā)酵時間從24小時至數(shù)月不等。目前廣泛使用的發(fā)酵法是按照《全國中藥炮制規(guī)范》，取生天南星粉末，加入凈膽汁(天南星∶膽汁=1∶4)，多數(shù)為豬膽汁(或豬膽膏)，攪拌拌勻，放溫暖處，發(fā)酵7～15天后，再連續(xù)蒸或隔水燉9晝夜，每2小時攪拌1次，除去腥臭氣，至呈黑色浸膏狀，口嘗無麻味為度，取出，晾干，再蒸軟，趁熱制成小塊[34]。也有將生南星研成細粉后，置釉缸內(nèi)，膽汁分3次放入，第1次加入后蒸制，第2次入后日曬夜露發(fā)酵，再次進行蒸制，第3次加入膽汁，再發(fā)酵至色澤變黑，無腥臭氣[35]。

4.2 發(fā)酵法制膽南星成分分析

王微等[36]通過小鼠生理生化指標發(fā)現(xiàn)，生南星的熱性可使小鼠的飲水量、耗氧量、Na+-K+-ATPase活力、肝臟組織總蛋白含量增加，而膽南星的寒性可使小鼠的飲水量、耗氧量、Na+-K+-ATPase活力、肝臟組織總蛋白含量降低，進一步驗證了“牛膽汁轉(zhuǎn)天南星之溫熱之性而為寒涼”的理論。陳云等[37]采用 HPLC-ELSD檢測發(fā)酵制膽南星炮制品中的膽汁酸類成分的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵制膽南星中可檢出游離型膽汁酸類成分豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸，未見有結(jié)合型膽汁酸類成分，故在膽南星發(fā)酵過程可將膽汁中的結(jié)合型膽汁酸類成分轉(zhuǎn)化為游離型膽汁酸。陳江寧[38]通過對膽南星發(fā)酵前后多類成分對比，發(fā)現(xiàn)膽南星發(fā)酵前后膽酸類成分有明顯的變化規(guī)律，即發(fā)酵后結(jié)合型膽酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x型膽酸，且游離型膽酸的含量與發(fā)酵時間、膽汁加入量密切相關(guān)。李瑤[39]運用PCA統(tǒng)計發(fā)酵制膽南星與原料的相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)天南星膽汁發(fā)酵前后有170個顯著性差異成分，其中增加成分有118個，28個成分來自豬膽汁，其余均為炮制過程中所生成的新成分。

5 化風丹藥母炮制及研究進展

化風丹是貴州省傳統(tǒng)名藥，1951年被列入國務院保護的四大名藥之一，2008 年入選國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄[40]。具有熄風鎮(zhèn)痙，豁痰開竅功效，可治療癲癇、中風偏癱疾病，還可用于治療風痰閉阻、面神經(jīng)麻痹、口眼歪斜等疾病的藥物。

5.1 化風丹藥母的炮制

化風丹的制備為藥母的制備和成藥的制備兩部分，其中藥母制備取處方中生川烏、生半夏、生天南星、白附子、郁金、神曲粉粹成細粉，加入牛膽汁混合均勻，置于密閉容器中，在溫度20～40℃，濕度50%～80%的條件下發(fā)酵30～35天，取出，干燥，即得；牛膽汁應具備條件：PH=6.0～8.0，密度0.8～1.3，固形物：0.02～0.25，膽酸含量：8.0～45.0 mg/mL[41]。對于藥母的干燥工藝，曹國瓊等[42]以藥母總生物堿含量為指標采用紫外分光光度法，結(jié)合其外觀性狀和含水量，比較自然陰干、烘干、減壓干燥和微波干燥4種處理方法對化風丹藥母外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量的影響，最終綜合各項指標化風丹藥母干燥方法宜采用60℃減壓真空干燥4.5小時。

5.2 化風丹藥母研究

曹國瓊等[43]通過建立高效液相色譜法同時測定化風丹藥母中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿含量，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵炮制后3種雙酯型生物堿含量明顯降低?，F(xiàn)代藥理研究表明，雙酯型生物堿是川烏中的毒性成分，臨床生用具有很大的危險性，而其經(jīng)炮制后分解為單酯型生物堿，毒性降低了1/200[44]。向文英等[45]對化風丹血清藥物化學進行研究，在負離子模式下含藥血清中共發(fā)現(xiàn)8個藥源性成分(其中3個為原型成分，5個可能為代謝產(chǎn)物)，有6個來自藥母；在正離子模式下含藥血清中共發(fā)現(xiàn)9個藥源性成分(其中2個為原型成分，7個可能為代謝產(chǎn)物)，有6個來自藥母，初步確定了化風丹入血成分主要來自藥母。

6 總結(jié)與展望

隨著現(xiàn)代醫(yī)藥領(lǐng)域和科技的發(fā)展，中醫(yī)藥在疾病的預防和治療方面越來越受到國際醫(yī)療市場的認可，傳統(tǒng)中醫(yī)藥的開發(fā)創(chuàng)新將會成為新趨勢，將發(fā)酵技術(shù)應用于中藥制劑研究和新藥開發(fā)，將會成為中藥現(xiàn)代化的重要手段。衛(wèi)生部藥品檢驗所動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：發(fā)酵中藥只需1/28的量便可與傳統(tǒng)中草藥煎、煮、熬水提物一份的量等效。膽汁作為一種溶劑，在中藥發(fā)酵中有著獨特的優(yōu)勢和特有的功效，王靜等[46]比較黃連、膽黃連及其水煎液中生物堿類成分的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連水煎液、膽黃連水煎液中總生物堿的轉(zhuǎn)移率分別為71.17%和78.50%，表明了黃連經(jīng)豬膽汁炮制后能夠增加生物堿類成分在水煎液中的溶出，進一步闡明了膽黃連寒性增強的炮制機制。將膽汁發(fā)酵技術(shù)應用于中藥炮制為中醫(yī)藥的研究與開發(fā)開辟了新的空間，但膽汁發(fā)酵技術(shù)仍存在大量問題有待研究解決，一是要對中藥傳統(tǒng)發(fā)酵工藝深入研究，選擇合適的中藥進行膽汁發(fā)酵，探究中藥發(fā)酵過程的生化反應機理及活性成分，實現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物的有效控制；二是選擇發(fā)酵過程中所需要的菌種，鑒定發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種，揭示不同菌群之間的功能關(guān)系；三是需摸索發(fā)酵條件以便提高生產(chǎn)效率。隨著中藥發(fā)酵技術(shù)的深入，選擇更為合適高效的原料顯得尤為重要，膽汁發(fā)酵能產(chǎn)生更多的藥用功效及更廣的藥用范圍，為中醫(yī)藥資源的保護與利用提供新方法。