化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在動物疫病檢測中的應(yīng)用

（漯河市動物疫病預(yù)防控制中心，河南漯河 462000）

化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminesecence immunoassay，CLIA）是基于免疫反應(yīng)原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)而建立的一種免疫檢測技術(shù)。它是繼放射免疫技術(shù)（RIA）、免疫熒光技術(shù)（IF）、酶免疫技術(shù)（EIA）之后發(fā)展起來的。與RIA、EIA等相比，CLIA 除具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)勢外，還具有無放射性污染、檢測線性范圍寬、檢測效率高、操作簡便的特點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、食品安全以及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域[1]，是發(fā)展和推廣應(yīng)用最快的標(biāo)記免疫分析技術(shù)之一。近年來，CLIA 技術(shù)開始引入動物疫病檢測領(lǐng)域，其在靈敏度、穩(wěn)定性和檢測效率上明顯優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附測定方法（ELISA），且可實(shí)現(xiàn)高通量和自動化檢測，已在H9 亞型禽流感、鴨甲型肝炎、豬細(xì)小病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征、O 型口蹄疫、小反芻獸疫、布魯氏菌病等疫病檢測中得到了應(yīng)用。本文闡述了CLIA 技術(shù)的原理、發(fā)展及在動物疫病檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用，以期為動物疫病化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法研究提供參考。

1 CLIA 技術(shù)原理

CLIA 是將化學(xué)發(fā)光作為免疫反應(yīng)的指示系統(tǒng)，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與待測物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)后，再加入其他相關(guān)物質(zhì)使發(fā)光物發(fā)光，從而根據(jù)光信號強(qiáng)度來確定待測物質(zhì)濃度的方法。CLIA 技術(shù)包括化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)和免疫反應(yīng)，其中免疫反應(yīng)是基礎(chǔ)。免疫反應(yīng)是指在一定條件下，抗原與相對應(yīng)的抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物的特異性反應(yīng)?；瘜W(xué)發(fā)光本質(zhì)是一種光輻射，是伴隨化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的?；瘜W(xué)發(fā)光劑分子通過吸收化學(xué)反應(yīng)過程產(chǎn)生的能量，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)處在較高能級激發(fā)態(tài)的分子重新躍遷到較低能級的基態(tài)時，會釋放等能級的光子，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。化學(xué)發(fā)光的光信號強(qiáng)度可以由儀器檢測。在一定的化學(xué)反應(yīng)中，發(fā)光強(qiáng)度與反應(yīng)體系中物質(zhì)濃度正相關(guān)，因此可以在一定的化學(xué)反應(yīng)環(huán)境條件下，通過化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度來測定待測物濃度。

在目前的CLIA 方法中，有兩種主要標(biāo)記方法：一是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體，在一定條件下反應(yīng)，使發(fā)光劑產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光從而進(jìn)行物質(zhì)測定分析。常用的發(fā)光劑有魯米諾類和吖啶酯類，其經(jīng)氧化劑或催化劑作用后即可快速穩(wěn)定發(fā)光，產(chǎn)生的光量子強(qiáng)度與所測抗體或抗原濃度呈比例。二是用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶類標(biāo)記抗原或抗體，即化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法。它是在酶聯(lián)免疫分析的基礎(chǔ)上，用化學(xué)發(fā)光劑作為底物，在酶的作用下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度來測定待檢物質(zhì)濃度。還有一種是電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLI）方法。不同于前兩者，它是在電極表面由電化學(xué)引發(fā)特異性發(fā)光反應(yīng)，以電子得失過程中的電位差作為能量激發(fā)源的免疫分析方法，一般采用三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]2+為標(biāo)記物，由電化學(xué)反應(yīng)啟動。

2 CLIA 技術(shù)發(fā)展

1977 年，Halmann等[2]首先提出CLIA 技術(shù)。早期的CLIA 技術(shù)雖然有較強(qiáng)的特異性，但因光信號持續(xù)時間太短、靈敏度不高，未廣泛應(yīng)用于臨床檢測。20 世紀(jì)80—90 年代，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)：在辣根過氧化物酶催化的魯米諾發(fā)光反應(yīng)中，加入6-羥基苯并噻唑及其衍生物類或?qū)ξ蝗〈谋椒宇惢衔锏任镔|(zhì)后，可以顯著增強(qiáng)HPR-Luminol-H2O2體系的發(fā)光信號強(qiáng)度，延長化學(xué)發(fā)光持續(xù)時間[3-4]；而且，用吖啶酯衍生物直接標(biāo)記抗體或抗原可以產(chǎn)生較高的光信號，金剛烷衍生物在堿性磷酸酶作用下也可發(fā)出高強(qiáng)度的輝光，光信號可持續(xù)l～2 h[5-6]。隨后，國外生產(chǎn)廠家研制開發(fā)出相應(yīng)試劑盒和全自動CLIA 系統(tǒng)，自此CLIA 技術(shù)開始被廣泛應(yīng)用于臨床檢測。1990 年，Leland等[7]建立了電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)，大大提高了化學(xué)發(fā)光免疫檢測的靈敏度，穩(wěn)定性、檢測效率和線性范圍。

近年來，隨著一些新材料、新技術(shù)的發(fā)展成熟，特別是金納米粒子、SiO2納米粒子、碳納米管、量子點(diǎn)以及它們的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)在高靈敏CLIA 檢測方法構(gòu)建中的廣泛應(yīng)用，化學(xué)發(fā)光免疫分析取得了突破性進(jìn)展。首先在靈敏度上，通過研究新的化學(xué)發(fā)光劑、催化劑、增強(qiáng)劑及固相材料，優(yōu)化化學(xué)反應(yīng)條件，用小蛋白封閉生物功能界面，篩選制備高特異性抗原和單克隆抗體，修飾ECLI 中的電極表面，轉(zhuǎn)移化學(xué)發(fā)光共振能量等手段，使CLIA 方法發(fā)光信號強(qiáng)度和穩(wěn)定性大大增強(qiáng)，靈敏度和特異性大大提高。其次，化學(xué)發(fā)光免疫分析與流動注射、毛細(xì)管電泳、微陣列芯片及免疫傳感器等先進(jìn)技術(shù)的聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了高分離能力、高通量、自動化、快速、高效和多組分檢測，促進(jìn)了化學(xué)發(fā)光技術(shù)的快速發(fā)展，也拓寬了其應(yīng)用范圍。

3 CLIA 技術(shù)在動物疫病檢測中的應(yīng)用

隨著各國對CLIA 技術(shù)研究的不斷深入，其已應(yīng)用到了許多動物疫病的臨床檢測中。歐盟已經(jīng)將CLIA 方法作為牛海綿狀腦?。˙SE）的快速檢測手段之一，并準(zhǔn)備推廣為小反芻動物疫病，如綿羊癢?。═SE）等的快速檢測手段[8]。

3.1 病毒檢測

2015 年，亓文寶等[9]成功建立了H9 亞型禽流感病毒抗體ECLI 方法。此方法具有高度特異性，與其他亞型病毒無干擾，且能夠?qū)崿F(xiàn)快速、高通量檢測，具備臨床推廣條件。鄭小龍等[10]建立了檢測血清中鴨黃病毒抗體的CLIA 方法。該方法特異性強(qiáng)、敏感性高，與鴨瘟、鴨病毒性肝炎和禽流感病毒抗體無交叉反應(yīng)，最低可檢測出1:6 400 稀釋血清中的鴨黃病毒抗體，靈敏度為中和試驗(yàn)的56 倍，適用于流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測。銀鳳桂等[11]2017 年研究建立了一種快速、靈敏、特異、重復(fù)性好的化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測方法（CLEIA），適合鴨甲型肝炎的批量檢測診斷，檢出限低至1:0.289～1:1.5，也可用于鴨甲型肝炎免疫后的抗體監(jiān)測以及雛鴨體內(nèi)母源抗體的定量分析。

Zhang等[12]通過用羥氨放大金納米顆粒反應(yīng)來增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光信號，建立了超靈敏、簡便、快速、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的豬圓環(huán)病毒2 型化學(xué)發(fā)光檢測方法。Zhou等[13]將HRP 和檢測抗體同時固定在金納米粒子表面，形成金納米粒子探針，建立了一種快速、簡便、靈敏的檢測豬細(xì)小病毒抗體的CLIA 方法。該方法檢測限遠(yuǎn)低于ELISA 方法。Yang等[14]基于磁性納米顆粒建立了高效檢測偽狂犬病毒的CLIA 檢測方法，其最低檢測限為100 amol/（5 pmol/L）。張社民等[15]將化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)和ELISA 相結(jié)合，建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測新方法，并成功制備出了試劑盒供臨床應(yīng)用。

2017 年，邵康等[16]以金-石墨烯納米復(fù)合材料為電活性基質(zhì)，硅包聯(lián)吡啶釕納米粒子為電化學(xué)發(fā)光信號標(biāo)簽，利用生物素-鏈霉親和素-生物素構(gòu)建了三重和多重信號放大的檢測豬偽狂犬病毒抗體的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，檢測范圍為50 ng/mL～1 pg/mL，最低檢測限可達(dá)到0.40 pg/mL，與ELISA 和熒光測定分析方法相比，靈敏度更高，檢測線性范圍更寬，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性更好。同時利用碳納米管作為量子點(diǎn)載體，通過多孔鉑金納米管的催化作用和β-環(huán)糊精與金剛烷“橋”作用，采用“抗體-抗原-抗體”雙抗體夾心模式，構(gòu)建了信號放大的近紅外電化學(xué)發(fā)光傳感器，實(shí)現(xiàn)了對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的高靈敏檢測。在19 ng/mL～19 pg/mL 范圍內(nèi)，電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度與豬繁殖與呼吸綜合征病毒濃度呈線性相關(guān)（R2=0.9 951），最低檢出限為10.8 pg/mL，與ELISA 和PCR 方法相比具有更高的靈敏度和更寬的線性檢測范圍。

2016 年，崔辰等[17]利用豬O 型口蹄疫病毒VP1 重組蛋白為包被抗原，成功建立了一種快速檢測豬O 型口蹄疫病毒抗體的CLEIA 檢測方法，較傳統(tǒng)的ELISA 法，其敏感性和精密度都大大提高，與豬A 型、Asia 1 型口蹄疫病毒以及豬偽狂犬病、豬瘟、豬細(xì)小病毒病、豬圓環(huán)病等病原均無交叉反應(yīng)，板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別為1.10%～6.70%和0.66%～4.80%，具有較好的特異性和重復(fù)性，可用于豬O 型口蹄疫病毒抗體檢測。2018 年，王世杰等[18]建立了一種高效O 型口蹄疫高通量LPBCLIA 定性檢測方法，用單一稀釋倍數(shù)對樣本血清進(jìn)行稀釋，代替LB-ELISA 中對樣本的倍比稀釋，通過計(jì)算抑制率來判定測定結(jié)果，使檢測通量提高了5 倍左右，同時用化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)替代酶免檢測技術(shù)，提高了方法的靈敏度和穩(wěn)定性。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法檢測結(jié)果穩(wěn)定，具有很好的可重復(fù)性。通過臨床樣品檢測發(fā)現(xiàn)，與國家參考實(shí)驗(yàn)室蘭州獸醫(yī)研究所O 型口蹄疫抗體LPB-ELISA 檢測試劑盒相比，該方法敏感性為94.6%，特異性為95.6%，符合率為95.1%，證明其具有良好的敏感性和特異性，可大大提高檢測效率和材料利用率，為豬O 型口蹄疫檢測提供了更為高效、經(jīng)濟(jì)的新方法。2018 年，Liu等[19]建立了檢測口蹄疫病毒3A 和3B 中兩種重組表位蛋白抗體的CLIA 方法，能夠準(zhǔn)確區(qū)分口蹄疫病毒感染抗體和疫苗免疫抗體，有效解決了非結(jié)構(gòu)蛋白（NSPs）對滅活疫苗污染而導(dǎo)致較高的假陽性率問題。

2019 年，任雪健等[20]建立了小反芻獸疫病毒抗體化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測方法，用魯米諾作為發(fā)光底物代替?zhèn)鹘y(tǒng)的TMB 底物，提高了檢測的敏感性、穩(wěn)定性。通過臨床樣本測定發(fā)現(xiàn)，該方法與法國ID-VET 試劑盒的陽性和陰性符合率均大于95%，且與羊O 型口蹄疫病毒、綿羊痘病毒和山羊痘病毒等羊常見病毒無交叉反應(yīng)，可用于小反芻獸疫病毒感染或疫苗免疫抗體水平檢測。

3.2 細(xì)菌檢測

目前，CLIA 技術(shù)在細(xì)菌檢測上的應(yīng)用主要集中于人獸共患病檢測方面。Hu等[21]報(bào)道了一種基于AuCl4-增強(qiáng)型魯米諾CLIA 檢測方法。該方法能夠特異性測定血清中的豬傳染性胸膜肺炎Apx Ⅳ抗體，與IHA、ELISA等常規(guī)檢測方法相比，在靈敏度和實(shí)用性方面具有顯著優(yōu)勢，適用于大規(guī)模血清樣品的篩選。Mutz等[22]將CLIA 技術(shù)與流動注射技術(shù)、免疫芯片技術(shù)結(jié)合起來，建立了檢測戊型肝炎病（HEV）和腸源性耶爾森氏菌抗體的CLIA 方法，實(shí)現(xiàn)了快速、高通量、自動化的檢測分析。這種方法可在9 min 內(nèi)完成檢測，能夠靈敏、特異地同時檢測血清中HEV和抗耶爾森菌IgG抗體。Morel等[23]建立了檢測炭疽桿菌的ECLI 法，檢出限為3×102CFU/mL，靈敏度較高。Liebes等[24]設(shè)計(jì)了化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于檢測抗布魯氏菌抗體。該方法采用光纖作為換能器，將布魯氏菌顆粒固定到光纖上，檢測限可低至0.207 μg/mL；較ELISA 耗時少，操作簡單，適合布魯氏菌病現(xiàn)場診斷。Vidziunaite等[25]經(jīng)長期研究，建立了一種檢測布魯氏菌病和兔土拉桿菌病的高靈敏度增強(qiáng)型CLIA 方法，其檢測線性范圍較傳統(tǒng)方法有了較大提高。2016 年，F(xiàn)ei[26]等建立了一種基于納米顆粒的檢測白痢沙門氏菌的夾心電化學(xué)免疫分析方法。該方法用金納米粒子修飾還原氧化石墨烯作為電化學(xué)標(biāo)記，用抗雞白痢沙門氏菌抗體與二氧化硅包被的磁性納米粒（SiO2/Fe3O4）來識別目標(biāo)沙門氏菌，在102～106CFU/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限低至89 CFU/mL，具有成本低、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，為臨床分析提供了一種有效的檢測方法。

在國內(nèi)，房芳等[27]研究建立了一種可同時檢測3 種沙門氏菌（豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌）的間接CLEIA 檢測方法。此方法簡便、快速，具有良好的特異性，與其他3 種常見腸道致病菌無交叉反應(yīng)，檢測限為1×104CFU/mL，檢測準(zhǔn)確率可高達(dá)97.33%。2017 年，范龍興等[28]將CLIA 技術(shù)與磁分離技術(shù)、夾心法 ELISA 相結(jié)合，建立了檢測單核細(xì)胞增生性李斯特菌的化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析方法。該方法在104～108CFU/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2=0.954），最低檢出限為104CFU/mL，特異性良好，對檢測環(huán)境要求不高，操作簡單，檢測時限僅為3～4 h，適用于單增李斯特菌的快速檢測。2019 年，辛思培等[29]建立了針對腸出血性大腸桿菌O157:H7 的雙抗夾心CLEIA 檢測方法。該方法最低檢測限為2.5×104CFU/mL，比ELISA 方法提高了4 倍左右，具有良好的特異性，與其他大腸桿菌、副溶血弧菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌等致病菌均無交叉反應(yīng)。在精密度方面，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為2.10%～3.71%和2.16%～7.14%，證明其有良好的精密度，為O157:H7 污染檢測提供了一種準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)的檢測手段。

3.3 寄生蟲檢測

青憲等[30]采用磁性納米顆粒作為免疫反應(yīng)載體，建立了一種用于檢測兔血清中日本血吸蟲抗體的CLEIA 方法。該方法檢測下限為1:13 442，靈敏度高，線性范圍寬，特異性好。Singh[31]分別采用ELISA 和液相化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，檢測已知感染弓形蟲的豬和貓血液病料，發(fā)現(xiàn)后者的檢測靈敏度遠(yuǎn)高于前者，而前者不能靈敏地測出貓血液樣本中的弓形蟲抗體含量。目前化學(xué)發(fā)光免疫分析法已廣泛應(yīng)用于弓形蟲病的檢測診斷。

4 展望

目前，CLIA 方法在醫(yī)學(xué)診斷、藥物分析以及微生物檢測等方面應(yīng)用非常廣泛，尤其是在人類醫(yī)學(xué)的臨床檢測上，有取代放免分析技術(shù)和酶免分析技術(shù)成為醫(yī)學(xué)檢測主要手段的趨勢，但在動物疫病檢測方面的應(yīng)用仍處于發(fā)展階段。因此，要將CLIA 方法廣泛應(yīng)用于動物疫病檢測和防控，必須加大對動物疫病CLIA 方法的研究，不斷提高檢測的靈敏度，拓寬檢測范圍，增強(qiáng)方法特異性、穩(wěn)定性。為了更好地將該方法應(yīng)用于市場，需要發(fā)展新型發(fā)光檢測儀器，發(fā)展多通道、多組分檢測和快速、自動化檢測方法。

近年來，CLIA 技術(shù)與新傳感器技術(shù)、微流控芯片技術(shù)等的聯(lián)用，磁性微粒子（MPs）、金納米粒子等新型材料在CLIA 中的應(yīng)用以及新型反應(yīng)增強(qiáng)劑和發(fā)光劑的出現(xiàn)，使得CLIA 的選擇性、靈敏度、檢測效率和檢測通量都得到進(jìn)一步提高，其正向著高特異性、高靈敏度、高通量、快速和自動化檢測的方向發(fā)展。同時基于化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移的均勻免疫分析[32]以及開發(fā)高通量、全自動及便攜式檢測儀器等也將成為CLIA 技術(shù)發(fā)展的方向。隨著人們對人獸共患病以及食品安全等問題的重視，CLIA技術(shù)將會在動物疫病檢測、診斷、微生物檢測、藥物殘留分析及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。