DNA甲基化的表觀遺傳機(jī)制及其在動(dòng)物遺傳育種中應(yīng)用

于 翔，王晨柳，文逸凡，張子敬，呂世杰，王二耀，黃永震*

(1.河南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 鄭州 450003；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 45002；

1 DNA甲基化概述

表觀遺傳是指在堿基排序順序沒(méi)有改變的前提下所發(fā)生的外部表型特征和內(nèi)部生理生化特征的改變，同時(shí)這種改變是可遺傳給后代的。DNA甲基化是表觀遺傳的一種重要形式，而在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，其他形式的表觀遺傳還包括組蛋白修飾、非編碼RNA和染色質(zhì)重塑。在真核生物中，常常需要借助DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)來(lái)完成甲基化的甲基轉(zhuǎn)移過(guò)程，被轉(zhuǎn)移的甲基基團(tuán)來(lái)源于S-腺苷提供甲硫氨酸，整個(gè)反應(yīng)最終使DNA分子上CpG二核苷酸位點(diǎn)的胞嘧啶被修飾為5-甲基胞嘧啶(5-mC)，完成DNA分子的甲基化。

在哺乳動(dòng)物中，參與甲基化修飾過(guò)程的轉(zhuǎn)移酶主要是DNMT1和DNMT3(DNMT3a、DNMT3b)。前者發(fā)揮其功能，負(fù)責(zé)維持現(xiàn)有DNA的原有甲基化狀態(tài)；后者則在DNA重新甲基化發(fā)揮其功能，在細(xì)胞分化發(fā)育早期參與DNA共價(jià)修飾過(guò)程。而近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，由DNA甲基化所引起的表觀遺傳對(duì)于動(dòng)物的抗病性能[1]、生長(zhǎng)發(fā)育[2-3]、繁殖性能[4]等方面均有重要的影響，因而相關(guān)位點(diǎn)的甲基化可作為分子標(biāo)記，應(yīng)用于未來(lái)的動(dòng)物育種之中，本文將對(duì)此進(jìn)行綜述。

2 甲基化與動(dòng)物抗病性

動(dòng)物抗病性是動(dòng)物免疫功能的外在體現(xiàn)，分為兩個(gè)方面，包括動(dòng)物體對(duì)病原侵入的忍耐能力和縮短病原的生活周期、抵御其帶來(lái)?yè)p傷的能力?？共⌒栽诓煌瑒?dòng)物個(gè)體之間具有較大的差異，但能穩(wěn)定遺傳給后代[5]。動(dòng)物免疫機(jī)制可分為兩大類，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。而在細(xì)胞免疫過(guò)程中，成熟T淋巴細(xì)胞發(fā)揮著清除病原的重要作用。根據(jù)表面標(biāo)志的不同和細(xì)胞功能的差異，T淋巴細(xì)胞又可細(xì)分為CD4+輔助T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。CD4+輔助T細(xì)胞是一類非常重要的免疫細(xì)胞，它不僅在輔助CD8+T細(xì)胞發(fā)揮其功能的過(guò)程中扮演了重要角色，自身產(chǎn)生和分泌細(xì)胞因子也能夠使機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程得到進(jìn)一步的強(qiáng)化，細(xì)胞本身對(duì)于侵入機(jī)體的病原還具有不可忽視的殺滅和清除的功能[6]。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在因感染金黃色葡萄球菌而出現(xiàn)乳房炎的牛群中，體內(nèi)CD4+T細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)了較大的增長(zhǎng)，結(jié)果遠(yuǎn)高于未感染牛群，增長(zhǎng)的CD4+細(xì)胞進(jìn)而導(dǎo)致CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值也出現(xiàn)了顯著下降[7]。而因在感染鏈球菌而患有乳房炎時(shí)這兩種免疫細(xì)胞則呈現(xiàn)出同步增長(zhǎng)的趨勢(shì)。在一例針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究中也發(fā)現(xiàn)，在以病毒入侵為始，病毒感染宿主豬的不同時(shí)期中，豬體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)出了一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程[8]。而在對(duì)于復(fù)發(fā)性葡萄膜炎發(fā)病過(guò)程的研究中，馬對(duì)于該病的自發(fā)免疫能力也與CD4細(xì)胞膜蛋白組豐度顯著相關(guān)[9]。

而CD4基因與T淋巴細(xì)胞的分化和成熟密不可分，不同的表觀修飾會(huì)對(duì)T細(xì)胞的分化過(guò)程產(chǎn)生非常重要的影響，而CD4基因上的特性DNA位點(diǎn)的甲基化則與CD基因表達(dá)存在明顯的相關(guān)性[10]。研究發(fā)現(xiàn)，CD4基因的第一外顯子持續(xù)不斷的發(fā)生去甲基化時(shí)，對(duì)于CD4基因的整體表達(dá)能夠起到促進(jìn)作用，同時(shí)也促進(jìn)了雙陰性(Double—negative，DN)細(xì)胞發(fā)育為雙陽(yáng)性(Double—postive，DP)細(xì)胞。在這個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，該基因的甲基化程度經(jīng)歷了一個(gè)先升高再降低的過(guò)程[11]，隨后完成轉(zhuǎn)化的雙陽(yáng)性細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育為CD4單陽(yáng)性(CD4 single—positive，CD4SP)T 細(xì)胞[12]，繼續(xù)發(fā)揮其免疫功能。

研究還顯示，DNA甲基化與炎癥的發(fā)生也存在一定的關(guān)系[13]，甲基化能夠?qū)ρ装Y反應(yīng)產(chǎn)生一定的調(diào)控作用。機(jī)體內(nèi)部分炎性因子啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的甲基化水平能夠?qū)ρ仔砸蜃拥目偙磉_(dá)量產(chǎn)生不可忽視的影響作用；另外，某些炎性因子也能夠通過(guò)干擾甲基轉(zhuǎn)移酶，使其過(guò)量表達(dá)，從而導(dǎo)致DNA分子出現(xiàn)異常甲基化[14-15]。盡管在某些疾病中，DNA甲基化如何參與調(diào)控炎性因子的機(jī)制得到了初步揭示，發(fā)現(xiàn)了甲基化在調(diào)控炎癥的過(guò)程中的部分信號(hào)通路和調(diào)控途徑的作用過(guò)程，但仍有大量的調(diào)控機(jī)制有待于之后更深入的研究和解析。

近年來(lái)頻發(fā)的大規(guī)模流行疾病對(duì)畜牧業(yè)造成的損失巨大，加之在對(duì)牛、羊、豬等家畜的抗病性能評(píng)估上發(fā)現(xiàn)，家畜本土品種的抗病性能顯著優(yōu)于目前分布較廣、數(shù)量較多的培育品種[16-18]，因而開(kāi)展了對(duì)家畜抗病性能遺傳基礎(chǔ)的研究熱潮。通過(guò)研究CD4基因的多態(tài)性和表觀遺傳進(jìn)展，目前已經(jīng)在牛、豬上闡明了CD4基因甲基化對(duì)于乳房炎等幾種特定疾病的抗病機(jī)制，但對(duì)于甲基化提高一般抗病力的研究以及應(yīng)用于分子育種方面的研究尚不明確，也不深刻。且甲基化與抗病性能的研究多集中于牛、豬等家畜，對(duì)于羊等其他家畜的相關(guān)研究較少，期待后續(xù)更全面、更深入的研究。免疫相關(guān)基因的甲基化能夠作為動(dòng)物抗病育種的分子理論基礎(chǔ)，再結(jié)合現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)，將能夠大幅度提高抗病育種效率，培育出更好優(yōu)良的抗病家畜品種。

3 甲基化與動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育

3.1 甲基化對(duì)肌肉發(fā)育的影響

動(dòng)物的肌肉的發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，位于中胚層的祖細(xì)胞，需要經(jīng)過(guò)增殖、分化、融合及成熟等一系列的變化，最終才能形成肌纖維，完成肌肉發(fā)育。而在這個(gè)不斷變化的過(guò)程中，動(dòng)物體內(nèi)相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)也呈現(xiàn)出了動(dòng)態(tài)的變化趨勢(shì)，其過(guò)程十分復(fù)雜。細(xì)胞分化使細(xì)胞整體的甲基化狀態(tài)上升[19]，但在某些特殊位點(diǎn)上卻出現(xiàn)了下降。而研究發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌細(xì)胞的形成過(guò)程中，是與其他組織或細(xì)胞的DNA甲基化模式存在有明顯差異的。Calvanese等發(fā)現(xiàn)在骨骼肌細(xì)胞能存在有至少178個(gè)特異的高甲基化位點(diǎn)[20]。Tsumagari等也通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)在這些差異化位點(diǎn)中，有94%在肌肉中都表現(xiàn)為低甲基化，在成肌細(xì)胞或肌管細(xì)胞能夠發(fā)現(xiàn)的相同的位點(diǎn)占到了47%[21]。而肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育，與這些特異化的甲基化位點(diǎn)具有密切的關(guān)系。在這個(gè)過(guò)程中，兩類因子，即生肌調(diào)控因子(Myf5、Myf6、MyoD、MyoG)和調(diào)控因子上游的Pax3和Pax7等對(duì)肌肉具有非常重要而深遠(yuǎn)的調(diào)控作用。通過(guò)比較胚胎干細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞、成肌細(xì)胞及肌管細(xì)胞生肌調(diào)控因子相關(guān)基因的甲基化程度，Carrio等[22]發(fā)現(xiàn)，Myf5的增強(qiáng)子區(qū)域在胚胎干細(xì)胞中，該區(qū)域表現(xiàn)為高甲基化，而其他細(xì)胞均呈現(xiàn)出低甲基化，這種低甲基化水平使得Myf5基因表達(dá)量有所增加。這說(shuō)明肌肉發(fā)育過(guò)程的甲基化模式具有一定的時(shí)空特異性，在不同生肌階段，甲基化狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生一定的變化，這種甲基化狀態(tài)的變化能夠通過(guò)調(diào)控不同階段的基因表達(dá)，從而保證肌肉發(fā)育的正常進(jìn)行。

3.2 甲基化對(duì)脂肪生長(zhǎng)的影響

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)是動(dòng)物體內(nèi)控制脂肪生成和脂肪組織發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，同時(shí)也會(huì)參與糖脂代謝、炎癥、免疫反應(yīng)等多種生理生化過(guò)程之中[23-25]。通過(guò)使PPARγ基因過(guò)表達(dá)能夠改變細(xì)胞分化方向，使非脂肪源性的細(xì)胞分化成為脂肪細(xì)胞[26]；而敲除 PPARγ基因后則脂肪細(xì)胞不能完成分化[27-28]。小鼠實(shí)驗(yàn)中，在前脂肪細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞的過(guò)程中，PPARγ2啟動(dòng)子呈現(xiàn)出了由高甲基化逐漸向低甲基化發(fā)展的趨勢(shì)，而在這一過(guò)程中PPARγ2 mRNA的表達(dá)量則出現(xiàn)了逐漸上升[29]。在對(duì)患有肥胖型糖尿病的小鼠內(nèi)臟脂肪細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果也佐證了這點(diǎn)，其PPARγ2啟動(dòng)子的甲基化高于野生正常小鼠，進(jìn)而導(dǎo)致PPARγ2 的mRNA表達(dá)量下降，因此對(duì)脂肪細(xì)胞的生成具有促進(jìn)作用。Sun等[30]在高、低脂雙向選擇系肉雞 PPARγ基因啟動(dòng)子6個(gè)位點(diǎn)甲基化及PPARγ表達(dá)量的實(shí)驗(yàn)也證明DNA 甲基化能夠調(diào)控PPARγ基因的表達(dá)和脂肪生成。因此能夠把PPARγ基因視為一個(gè)遺傳標(biāo)記和表觀遺傳標(biāo)記，并將其應(yīng)用于分子標(biāo)記育種的潛力巨大，通過(guò)對(duì)PPARγ基因的篩選，能夠在一定程度評(píng)定動(dòng)物個(gè)體或品種的生脂能力，進(jìn)而加快優(yōu)質(zhì)低脂畜禽品種培育進(jìn)展。

4 甲基化與動(dòng)物繁殖

初情期對(duì)于動(dòng)物生長(zhǎng)和畜產(chǎn)品生產(chǎn)是一個(gè)非常關(guān)鍵的時(shí)期，進(jìn)入初情期的動(dòng)物開(kāi)始逐步獲得繁殖能力，其標(biāo)志是母畜初次發(fā)情并排卵、公畜睪丸開(kāi)始具備分泌和產(chǎn)生有功能的精子。關(guān)于初情期是如何啟動(dòng)的，大多數(shù)的觀點(diǎn)贊成它是受到了多方面因素之間的交互作用的調(diào)控，主要的影響因素有遺傳、環(huán)境、神經(jīng)內(nèi)分泌等[31]，其出現(xiàn)時(shí)間早晚體現(xiàn)出了不同動(dòng)物個(gè)體之間繁殖性能的相對(duì)差異。有研究顯示，在初情期的啟動(dòng)過(guò)程中，大量的基因通過(guò)參與和調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌，最終影響了初情期的啟動(dòng)[32-34]。Elks等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與人類的月經(jīng)初潮年齡存在有一定關(guān)聯(lián)性的基因變異的數(shù)量已經(jīng)超過(guò)了30種。而對(duì)靈長(zhǎng)目動(dòng)物獼猴的研究中發(fā)現(xiàn)，少年期和成年期雄性獼猴相比，成年猴腦組織的GnRH mRNA 的表達(dá)量更大，二者相比較有一個(gè)顯著增高，與此同時(shí)多個(gè)相關(guān)CpG島的甲基化狀態(tài)則表現(xiàn)為顯著的降低[36]。在一例向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物注射了DNA甲基化抑制劑的對(duì)比的實(shí)驗(yàn)中，注射了AZA的雌鼠和未注射雌鼠的初情期和性成熟時(shí)期出現(xiàn)了明顯的差異，注射了抑制劑后，初情期和性成熟時(shí)期表現(xiàn)出了明顯的推后[37]。在家畜中的研究發(fā)現(xiàn)，分別在1、2、3月齡對(duì)三元雜交豬(皮特蘭X長(zhǎng)白豬X大白豬)8個(gè)已被證實(shí)的睪丸印記基因甲基化狀況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些基因仍然具有一定的活性，機(jī)體通過(guò)甲基化的形式，對(duì)印記基因發(fā)揮了一定的調(diào)控作用[38]。但甲基化究竟如何對(duì)動(dòng)物繁殖產(chǎn)生影響，這其中的具體機(jī)制尚有待于研究闡明，目前在其他家畜上的研究和相關(guān)的報(bào)道仍然較少，仍需要后期進(jìn)一步的研究。

5 小結(jié)

DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳機(jī)制，其產(chǎn)生與變化會(huì)對(duì)動(dòng)物的表型特征和生理生化特征產(chǎn)生巨大而深遠(yuǎn)的影響。而目前針對(duì)甲基化的研究尚且停留在一個(gè)比較初級(jí)的階段，對(duì)于甲基化如何對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生影響的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究，應(yīng)用于動(dòng)物育種的研究報(bào)道也較少。但研究清楚甲基化的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制和外在表現(xiàn)過(guò)程，將有助于為開(kāi)展分子標(biāo)記輔助選育奠定扎實(shí)的理論基礎(chǔ)，進(jìn)而指導(dǎo)培育高產(chǎn)、抗病、品質(zhì)優(yōu)良的新品種，能夠更充分的發(fā)揮家畜的生產(chǎn)潛力，以得到更高的經(jīng)濟(jì)效益。