仿生結(jié)構(gòu)人工韌帶的制造方法綜述

史豐田 張 梅 王世紅 徐炳坤 胡榮榮 董喜華

北京萬潔天元醫(yī)療器械股份有限公司，北京 102600

前交叉韌帶（ACL）損傷修復(fù)方法主要有自體韌帶重建、同種異體韌帶重建以及人工韌帶重建。自體韌帶存在供源不足、取材部位并發(fā)癥、與骨隧道的愈合存在不確定性等問題[1-2]。同種異體韌帶雖避免了供區(qū)并發(fā)癥，但其需要冷鏈運輸，質(zhì)量難以保證，且存在疾病傳播、免疫排斥、移植物長入延遲以及來源少等問題[3]。而人工韌帶來源廣、強度大、恢復(fù)快，無供區(qū)并發(fā)癥及疾病傳播風(fēng)險，能很好地避免自體及異體移植物的不足之處。目前，已有多種高分子材料用于人工韌帶的制作，并顯示出良好的理化性能和生物學(xué)性能[4-6]，但與臨床應(yīng)用的要求相比仍存在較大差距，如易磨損、耐疲勞性差、易誘發(fā)骨隧道擴大等。因此，人們迫切希望得到具有天然韌帶特征或類似特征的人工韌帶產(chǎn)品[1]。

利用仿生學(xué)原理，模仿天然韌帶的結(jié)構(gòu)，尤其是模仿關(guān)節(jié)腔內(nèi)膠原纖維的走行和韌帶止點處的界面結(jié)構(gòu)，將有利于韌帶組織的再生，減少纖維間磨損，提高韌帶的耐疲勞性能，促進(jìn)人工韌帶與宿主骨的整合，從而提高人工韌帶產(chǎn)品的臨床使用效果。

關(guān)于仿生結(jié)構(gòu)人工韌帶的材料選擇[7]、細(xì)胞負(fù)載[8]、生物因子[9]、物理刺激[10]等方面的內(nèi)容前人已經(jīng)有了較為廣泛且細(xì)致的綜述，故本文主要關(guān)注ACL 仿生結(jié)構(gòu)韌帶的制備方法和實施步驟，希望可以啟發(fā)新的制備思路，促進(jìn)上述領(lǐng)域豐富的研究成果向產(chǎn)品轉(zhuǎn)化。

1 前交叉韌帶的解剖特點

前交叉韌帶是位于膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔內(nèi)連接股骨與脛骨的一條韌帶，起于股骨外髁側(cè)面后部，斜行關(guān)節(jié)腔內(nèi)，止于脛骨平臺髁間嵴前部，與后交叉韌帶及周圍韌帶共同穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)。

前交叉韌帶由多個纖維束組成，直徑250μm至數(shù)毫米不等，被一層結(jié)締組織包繞。每個纖維束又由3 ～20 個亞纖維束組成，為腱鞘包繞，亞纖維束的直徑為100 ～250μm，由一層疏松結(jié)締組織包繞。亞纖維束由直徑為1 ～20μm 膠原纖維組成。膠原纖維由直徑為25 ～250nm 膠原原纖維組成。前交叉韌帶內(nèi)膠原原纖維沿縱軸呈波浪狀、平行排列走行，使韌帶纖維可適度拉長而不易斷裂，具有控制張力和減震的作用。韌帶表面纖維間有交叉走行的連接纖維，有利于增加韌帶的延展性和強度，并提高對旋轉(zhuǎn)應(yīng)力的抵抗作用[11]。

ACL 韌帶與骨的結(jié)合處為直接止點，其結(jié)構(gòu)分為四部分，即韌帶-非礦化纖維軟骨-礦化纖維軟骨-軟骨下骨。這四部分的結(jié)構(gòu)、組成和力學(xué)性能呈梯度變化，從韌帶區(qū)域到骨區(qū)域，膠原纖維的排列由整齊取向變?yōu)闊o規(guī)分布，膠原含量降低、礦化物含量逐漸增加、拉伸強度降低、壓縮強度和剛性增強[12-13]。

2 仿生結(jié)構(gòu)人工韌帶的制備

人工韌帶具有原料來源不受限制、初始強度高、使用方便、可快速恢復(fù)活動能力等優(yōu)點，隨著人工韌帶使用經(jīng)驗的日益積累[4，14]，眾多研究者從仿生的角度出發(fā)，對人工韌帶進(jìn)行了廣泛的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，力圖開發(fā)出修復(fù)效果更好的人工韌帶。為此，已發(fā)展出以下幾種方法。

2.1 傳統(tǒng)編織法

人工韌帶是以纖維和織物為基礎(chǔ)的產(chǎn)品，其成型方法與紡織密切相關(guān)。無論是梭織，還是針織，本質(zhì)是將纖維在經(jīng)緯兩個方向按一定規(guī)律排列，最終獲得結(jié)構(gòu)縱橫交錯的織物，以滿足不同的使用目的。目前國際上應(yīng)用于 ACL 重建的人工韌帶產(chǎn)品，如NeoligamentsTM、LigasticTM、LARSTM（Ligament Advanced Reinforcement System）等[15]，均用傳統(tǒng)編織方法制備。

其中，LARS 作為國內(nèi)應(yīng)用最多的人工韌帶產(chǎn)品，是采用經(jīng)編方法制造的典型代表?？偨Y(jié)早期人工韌帶的使用經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)[16-17]，在關(guān)節(jié)屈伸過程中，縱向纖維（緯線）與橫向纖維（經(jīng)線）間的受力并不均勻，兩者相互摩擦最終導(dǎo)致材料疲勞磨損。因此，LARS 在設(shè)計上采用三段式，中間的關(guān)節(jié)腔內(nèi)部分直接去掉橫向纖維，只?？v向纖維（即自由纖維），并預(yù)扭90°，以最大程度模仿自然韌帶的結(jié)構(gòu)，兩端的骨隧道部分則同時擁有縱向纖維和橫向纖維，以增加固定時的牢固度。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，術(shù)后早期（2 年內(nèi)）和中期（2 ～10 年）臨床療效滿意，患者不但能早期重返運動，而且關(guān)節(jié)穩(wěn)定性恢復(fù)和功能評分方面也具有優(yōu)勢，甚至優(yōu)于自體腘繩肌移植物[4]?？梢姡律Y(jié)構(gòu)設(shè)計對人工韌帶的重要性。

LARS 的最大特色是關(guān)節(jié)腔段的自由纖維部分，但由于經(jīng)編工藝的限制，尚無法像自然韌帶那樣，將縱向走行的自由纖維做成波浪狀，并維持優(yōu)異的拉伸性能，更無法在縱向走行的自由纖維之間添加適當(dāng)?shù)男毙芜B接纖維。

2.2 靜電紡絲法

靜電紡絲法是一種特殊的纖維制造工藝，其利用聚合物熔體或溶液在高靜電壓差的作用下，噴射延展成絲。該工藝所需裝置簡單、成本低廉、可紡物種類繁多、工藝可控，可有效制備納米纖維，已廣泛應(yīng)用于過濾材料[18]、納米顆粒負(fù)載[19]、生物醫(yī)學(xué)[20]等領(lǐng)域。

吳惠英[21]將絲素蛋白（SF）溶于氯化鈣（CaCl2）-甲酸（FA）體系，干燥成膜后再溶解于甲酸中，以保留SF 的原纖結(jié)構(gòu)，此后進(jìn)行靜電紡絲，采用自制滾筒收集裝置制備取向的納米再生SF 纖維，所得纖維直徑為（221±20）nm，1 倍牽伸后纖維的斷裂應(yīng)力和斷裂伸長率分別達(dá)到了（18.6±3.8）MPa和（15.1±2.5）%。由于單一纖維為原料構(gòu)建的人工韌帶無法滿足性能要求，因此以SF 長絲、天然SF纖維和靜電紡絲SF 納米纖維為原料，在立式錠子編織機上構(gòu)建復(fù)合韌帶，復(fù)合韌帶的斷裂強力可達(dá)（2581.7±23.7）N，滿足人體ACL 的要求。

He 等[22]針對以往多相支架設(shè)計不能兼顧材料的梯度和結(jié)構(gòu)的連續(xù)性的缺點，采用靜電紡絲的方法制備了一種具有過渡結(jié)構(gòu)的韌帶支架。該方法使用可旋轉(zhuǎn)鋁柱作為接收電極，以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）溶液在高速旋轉(zhuǎn)的鋁柱上往復(fù)紡織得到了沿圓柱圓周分布取向的一層納米纖維織物，然后在鋁柱上纏繞一層PLGA 微米纖維作為增強相，隨后采用相同的方法在其上復(fù)合一層納米纖維織物，獲得了具有一定強度的高度取向的支架主體。然后鋁柱靜止，噴絲頭沿圓柱軸向往復(fù)運動，利用靜電紡絲的邊緣分布效應(yīng)制得了具有梯度分布效果的PLGA/HA/BMP-2 復(fù)合織物帶，將織物帶沿圓柱軸向剪開，經(jīng)卷繞、縫合后獲得具有梯度結(jié)構(gòu)的韌帶支架。動物實驗結(jié)果表明，所得支架對移植物-骨界面的組織再生有顯著的促進(jìn)效果。采用靜電紡絲制備多相韌帶支架，充分發(fā)揮了靜電紡絲織物在結(jié)構(gòu)、組成上高度可調(diào)的優(yōu)勢。

2.3 三維編織法

三維編織（3D 編織）即不通過剪裁縫合可直接編織出立體結(jié)構(gòu)的一種編織方法。通過設(shè)定參數(shù)，3D 編織機可以直接編織出具有特定紋樣和形狀的織物，已廣泛用于制造生活用品和生物支架[23]。

有研究[24]報道了一例帶有兩個仿骨結(jié)構(gòu)區(qū)域的人工韌帶，用于改善韌帶與骨道之間的愈合效果。該韌帶采用PLGA 纖維以3D 編織的方法得到，先將不同數(shù)量的纖維合成一股，再利用3D 編織機對不同股數(shù)的纖維進(jìn)行編織，并通過改變編織角度控制織物的孔隙和形貌，得到了具有不同結(jié)構(gòu)的整體仿生韌帶移植物。生物學(xué)評價試驗表明其可調(diào)控的孔隙結(jié)構(gòu)適于不同細(xì)胞的長入及不同組織的修復(fù)再生。采用3D 編織制備韌帶移植物可以有效地控制織物的孔隙尺寸、孔隙率、機械性能以及外觀形貌，以適應(yīng)不同類型細(xì)胞長入的需要和不同組織部位對織物力學(xué)性能的要求。

2.4 低溫?zé)Y(jié)法

低溫?zé)Y(jié)指高分子材料在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以上，熔融/分解溫度以下，通過長時間加熱使高分子材料粘合到一起的方法。低溫加熱粘合能有效減少高熱對材料本身結(jié)構(gòu)的破壞，盡可能的保留原材料性能，保持構(gòu)建單元基本形狀，控制堆疊孔隙的大小，非常適用于構(gòu)建多孔材料[25]。而多孔結(jié)構(gòu)的存在，對改善移植物-骨愈合效果至關(guān)重要。

Jeffrey 等[26]分析了韌帶重建過程中韌帶止點結(jié)構(gòu)再生的重要性，仿照其結(jié)構(gòu)制作了三相結(jié)構(gòu)支架，并在其上進(jìn)行多種細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察各類細(xì)胞的行為。該工作分別以PLGA 的織物作為韌帶相，PLGA 的微球進(jìn)行燒結(jié)后作為界面相，PLGA/45S5生物玻璃混合物燒結(jié)后作為骨相，用以模仿天然韌帶止點的分層結(jié)構(gòu)。得到的支架材料分別負(fù)載成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，經(jīng)在裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)，可以得到類似天然韌帶止點的細(xì)胞分布特征，驗證了該方法用于恢復(fù)韌帶止點結(jié)構(gòu)的有效性。但是該方法的效率不高，且制備的具有仿生結(jié)構(gòu)的界面支架無法單獨使用，需與其他人工韌帶結(jié)合才能使用。

2.5 模型澆注法

模型澆注通過將原料溶液或熔體等流動相澆注到事先制備好的模型中，固化后成型為預(yù)期形狀的一種方法。是傳統(tǒng)生產(chǎn)中常見的成型方法，在各類材料加工都有廣泛的應(yīng)用，具有方法簡便、適用性強等特點。隨著3D 打印技術(shù)的興起，模型制造更加容易，大大降低了模型澆注的成本和難度。

張文友等[27]使用模型澆注的方法制備了具有仿生結(jié)構(gòu)且具有較高強度的人工韌帶支架：首先設(shè)計制作了韌帶支架仿骨區(qū)域的外模，通過羥基磷灰石（HA）/聚合物混合溶液注模、高溫干燥定型后高溫?zé)Y(jié)得到了多孔仿骨結(jié)構(gòu)，在其中穿入蠶絲纖維作為支架的韌帶部分，使韌帶牢固的固定在HA 塊上，再次使用模具澆注的方法在韌帶支架和骨支架的界面處澆注不同濃度梯度的HA/PLGA 混合物以形成類軟骨過渡層，然后進(jìn)行凍干，得到了成分、孔隙梯度變化的人工韌帶支架。該方法簡單巧妙地實現(xiàn)了對韌帶區(qū)和骨止點區(qū)各層結(jié)構(gòu)的模仿，整個支架具有較高的強度，可使韌帶重建具有較好的初期效果。

3 總結(jié)與展望

仿生是人們對人工韌帶進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化的重要思路，現(xiàn)有研究成果也能佐證這一路線的正確性，但從目前所使用的制備方法來看，無論是傳統(tǒng)的紡織方法，還是與3D 打印結(jié)合的模型澆注方法，所得到的人工韌帶在結(jié)構(gòu)上，仍與自然韌帶有明顯不同。表現(xiàn)在關(guān)節(jié)腔內(nèi)為縱向纖維延展性低，且無橫向連接纖維以致結(jié)構(gòu)松散；表現(xiàn)在骨隧道內(nèi)，則是難以模仿韌帶-骨止點結(jié)合處的連續(xù)梯度結(jié)構(gòu)。因此，開發(fā)更有效的制備方法，結(jié)合創(chuàng)新性的產(chǎn)品設(shè)計，縮小人工韌帶與自然韌帶這種結(jié)構(gòu)上的差距，實現(xiàn)兩者整體上盡可能的相似，并實現(xiàn)結(jié)構(gòu)與性能的統(tǒng)一，是未來人們追求的首要目標(biāo)，當(dāng)然也是非常具有挑戰(zhàn)性的課題。