肝癌早期診斷標(biāo)志物的研究進展

覃文周 曾 灝 翚 纓

廣西壯族自治區(qū)貴港市人民醫(yī)院檢驗科，廣西貴港 537100

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，根據(jù)流行病學(xué)的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，超過80%的患者在確診為肝癌時多為中期或晚期，并且?guī)缀跬瑫r存在肝硬化的癥狀，未能在早期采取治療措施，預(yù)后效果較差，因此肝癌的死亡率在臨床上位于腫瘤疾病的第二位。近年來，隨著醫(yī)療水平的發(fā)展和進步，肝癌非手術(shù)治療的方式也逐漸應(yīng)用到臨床中，但手術(shù)切除癌變組織仍是目前首選的治療手段[1]。此外，晚期肝癌即使在采取手術(shù)切除后，仍存在復(fù)發(fā)率高、癌變易轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，造成病情難以徹底好轉(zhuǎn)，而早期的診斷和治療愈發(fā)重要[2]。由于肝癌的血清標(biāo)志物數(shù)量眾多，做好肝癌標(biāo)志物的分析可以用于早期的診斷和治療中，同時對改善預(yù)后來說也具有重要作用。因此，本文就早期診斷有價值的肝癌標(biāo)志物研究進展作一綜述。

1 甲胎蛋白（AFP）

1.1 AFP-L3

AFP 是一種由氨基酸組成的胚胎性蛋白，在臨床上被作為肝癌診斷的常見標(biāo)志物之一，但是在肝硬化、慢性肝病等患者的隨訪觀察中，發(fā)現(xiàn)AFP 的部分缺陷，即單獨通過AFP 鑒別并診斷肝癌難度較高，且具有一定的局限性[3]。在AFP 中，其主要組成成分共有三種：AFP-L1、AFP-L2 和AFP-L3。AFP-L1 是AFP 的首要組成成分，在良性肝病中可以清楚檢測出；AFP-L2 一般是在孕婦體內(nèi)檢測出；AFP-L3 是肝癌的細(xì)胞特異因子，從其組成結(jié)構(gòu)來看，糖鏈的不均一性十分明顯，與植物凝集素的親和性相比，AFP-L3 可以通過電泳法將小扁豆凝集素與AFP 相結(jié)合，從而應(yīng)用于肝癌的早期診斷中，以條帶/總AFP 條帶的百分比表示其數(shù)值結(jié)果，若數(shù)值＞15%則提示受檢者診斷出肝癌。從總體上來看，若是在檢查中發(fā)現(xiàn)AFP 水平上升，即使上升幅度并不明顯的情況下，仍有可能是肝癌出現(xiàn)的前兆。因此，針對AFP-L3 數(shù)值結(jié)果＞15%的患者，應(yīng)加強隨訪觀察的力度，做好患者的病情監(jiān)控，叮囑患者按時復(fù)診，是提高早期診斷率的重要措施之一。Hsia 等[4]認(rèn)為AFP-L3 的數(shù)值水平與肝癌癌變的分化程度具有密切的聯(lián)系，但是與血清的AFP 整體水平并無相關(guān)，而以AFP-L3 數(shù)值結(jié)果的15%作為診斷肝癌的重要標(biāo)準(zhǔn)，AFP-L3 與AFP 相比，AFP-L3 陽性結(jié)果更能體現(xiàn)出肝癌患者的病情惡化程度，在臨床的隨診觀察、治療方面都具有重要的參考價值。

1.2 AFP-mRNA

近年來，在肝癌的治療中優(yōu)先采取手術(shù)治療的方式，但有的患者在手術(shù)治療前機體的血循環(huán)中存在少量的癌細(xì)胞，同時在疾病干預(yù)下，機體免疫功能早已受到破壞，隨著病程的推移，機體血液中的癌細(xì)胞數(shù)量也會隨之增加，這也是許多肝癌患者術(shù)后病情反復(fù)發(fā)作的重要原因[5]。因此，在臨床上需要應(yīng)用標(biāo)志物來判斷機體血液中是否存在癌細(xì)胞組織，并進一步監(jiān)測其動態(tài)變化情況，可以對癌細(xì)胞干預(yù)治療提供指導(dǎo)，也能為改善預(yù)后指明方向。在正常狀態(tài)下，血液中的mRNA 會在血漿中RNA 酶的作用下快速降解，因此在檢測中的AFP-mRNA 素均來自于脫落的肝癌細(xì)胞組織。

從AFP-mRNA 與血清AFP 的關(guān)系來看，兩者之間具有明顯的互補性，這是因為在檢測結(jié)果中若顯示血清AFP 為陰性，則提示肝癌出現(xiàn)的可能，這也是臨床診斷早期肝癌的常用標(biāo)志物方法，從而提高肝癌診斷的準(zhǔn)確性。與此同時，AFP-mRNA 可以清楚反映出肝癌病變細(xì)胞的表現(xiàn)形式，即使是在細(xì)胞并沒有出現(xiàn)形態(tài)變化的基礎(chǔ)上，也能彌補血清濃度作為診斷標(biāo)志物的缺陷，科學(xué)評估患者預(yù)后。Zheng等[6]分別對患者手術(shù)前后的AFP-mRNA 進行檢測，結(jié)果顯示AFP-mRNA 陽性患者具有較高的復(fù)發(fā)率。Shuangchun 等[7]利用RT-PCR 對肝癌患者外周血中的AFP-mRNA 進行檢測，結(jié)果顯示術(shù)前和術(shù)后的AFP-mRNA 數(shù)值水平均與患者腫瘤體積的大小具有明顯相關(guān)性，同時在部分AFP 總體濃度較低的患者中，也能檢測出AFP-mRNA。因此，從整體上看，AFP-mRNA 在早期肝癌的診斷和輔助治療方面均具有重要作用，并且可以幫助臨床評估肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特征，對于病情復(fù)發(fā)的預(yù)測也十分關(guān)鍵。

2 異常凝血酶原（PIVKA-Ⅱ）

凝血酶原是一種由肝細(xì)胞合成的標(biāo)志物，而PIVKA-Ⅱ與凝血酶原之間的差別就在于谷氨酸殘基未經(jīng)羧基化。PIVKA-Ⅱ作為一種新型的肝癌腫瘤標(biāo)志物，具有無活性的特點，其凝血酶原前體的特點十分復(fù)雜。有學(xué)者在研究[8]中發(fā)現(xiàn)，利用放射免疫法測定PIVKA-Ⅱ水平，肝癌患者中可發(fā)現(xiàn)PIVKA-Ⅱ水平與正常人相比明顯上升，因此提出將其作為肝癌腫瘤標(biāo)志物進行檢測的想法，但是其對應(yīng)的作用機制，尚未研究出完整的體系。從敏感度和特異性功能方面來看，PIVKA-Ⅱ在早期肝癌的診斷中，具有靈敏度、特異度高等特點，特別是將其與其他檢測方式聯(lián)合應(yīng)用時，會大大提高PIVKA-Ⅱ的血清水平[9]。根據(jù)臨床的有關(guān)研究[10]證明，目前PIVKA-Ⅱ是AFP 診斷肝癌的互補指標(biāo)，針對部分在AFP 檢測中水平較低或者趨于臨界點的肝癌患者，可以在二次檢測中應(yīng)用放射免疫法測定其PIVKA-Ⅱ水平，以提高診斷的準(zhǔn)確率和肝癌患者診斷的陽性率。而在這種互補指標(biāo)的檢測中，絕大部分的肝癌患者檢測結(jié)果顯示PIVKA-Ⅱ升高或者AFP 升高，并不會出現(xiàn)兩種檢測結(jié)果數(shù)值均上升的現(xiàn)象。

目前，隨著醫(yī)療檢測水平的不斷進步，化學(xué)發(fā)光法應(yīng)用于肝癌早期診斷的檢測中，大大提高了檢測的靈敏度，在此類診斷方式的基礎(chǔ)上，肝癌患者PIVKA-Ⅱ水平分界點保持在40mAu/mL 上，在高?；颊叩谋O(jiān)測和隨訪觀察中都具有較高的臨床使用價值。Shan 等[11]采用新型的化學(xué)發(fā)光法來測定PIVKA-Ⅱ水平，以分析PIVKA-Ⅱ?qū)τ诟伟┰缙谠\斷的價值，結(jié)果顯示在低分化或者中等分化的肝癌患者中會出現(xiàn)PIVKA-Ⅱ水平上升的趨勢，這說明化學(xué)發(fā)光法定期測定PIVKA-Ⅱ可以有效診斷出早期肝癌患者的發(fā)病情況，并可以作為肝癌的預(yù)測、篩選及預(yù)后的參考指標(biāo)之一。此外，PIVKA-Ⅱ作為機體的一種獨立要素，還可以提高肝臟移植后癌變復(fù)發(fā)的檢出率，有效預(yù)測病情的復(fù)發(fā)情況，有利于及時實施臨床診治。Miki等[12]在研究中指出，肝癌患者在發(fā)病期間出現(xiàn)深靜脈血栓的因素包括PIVKA-Ⅱ的影響，但是AFP 卻與血栓的形成之間并不存在關(guān)聯(lián)。因此，PIVKA-Ⅱ在乙肝相關(guān)肝癌患者的早期診斷方面具有許多優(yōu)勢。

3 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）

GGT 是一種存在于肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞的糖蛋白。在大量的白鼠試驗中，可以檢出癌變的肝細(xì)胞、變異細(xì)胞以及增生結(jié)節(jié)的大鼠，均呈GGT 陽性結(jié)果，而在肝癌患者的血清檢測中，可以明顯發(fā)現(xiàn)其GGT 活性水平不斷上升。但是，與前文兩種檢測方法相比，GGT 作為診斷標(biāo)志物的一種，在肝癌的早期診斷中特異性較差，有的良性肝病、膽胰疾病患者也可能會檢測出GGT 上升的結(jié)果[13]。因此，無法將GGT 單獨應(yīng)用到肝癌的早期診斷中。目前，有學(xué)者在研究[14]中采用聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳法對GGT 進行區(qū)帶分離，結(jié)果顯示在9 ～11 條區(qū)帶中，GGT 的檢測靈敏度高達88%，假陽性率低于6%，并且與腫瘤大小之間并不存在相關(guān)特性。在AFP 陰性肝癌患者中，采用GGT 檢測時靈敏度可達到76%以上，從一定程度上彌補了AFP 檢測的不足之處。徐曉宏等[15]在研究中對肝癌患者、非肝癌患者、肝癌轉(zhuǎn)移患者的GGT-mRNA水平進行檢測，結(jié)果顯示，非肝癌患者的外周血中的GGT-mRNA 類型主要為A 亞型，肝癌及其癌旁組織的GGT-mRNA-B 型陽性率明顯高于非肝癌患者。在33 例肝癌患者中，其中15 例在外周血檢測中檢出了GGT-mRNA-B 亞型，另外在AFP 結(jié)果呈陰性的12 例肝癌患者中，有6 例檢測出了GGT-mRNA-B亞型，在肝臟惡化的進展中有著GGT-mRNA 的亞型的轉(zhuǎn)變，這提示GGT 的基因表達異常與肝癌發(fā)展具有相關(guān)性。

4 轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）

轉(zhuǎn)化生長因子β 是一種生長調(diào)節(jié)蛋白，主要作用于肝細(xì)胞的再生過程，其分型包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，它們在基因轉(zhuǎn)錄中分別可以表現(xiàn)出不同的編碼，從具體的表現(xiàn)形式來看，TGF-β1作用于內(nèi)皮細(xì)胞及其結(jié)締組織；TGF-β2作用于上皮細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞組織；TGF-β3作用于間質(zhì)性細(xì)胞[16]。TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長因子中的主要分型，參與了許多疾病及腫瘤的發(fā)展，具有雙面性，在肝癌的細(xì)胞組織生長和分化階段起到了重要的作用，不僅可以傳遞細(xì)胞增殖的信號，同時在一定情況下能夠抑制細(xì)胞增殖。在肝細(xì)胞中，無法通過有效手段直接合成TGF-β1，通過非實質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生后，可以促進TGF-β1與細(xì)胞黏附分子相結(jié)合，從而形成腫瘤轉(zhuǎn)移或侵襲的現(xiàn)象。有學(xué)者在研究中指出[17]轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1在肝癌早期診斷中靈敏度為93.8%，特異性為65.7%，與腫瘤大小或血清AFP 濃度之間均無明顯的相關(guān)性，但是與AFP 進行聯(lián)合檢測，可以提高肝癌早期診斷的陽性率。Huang 等[18]對肝癌患者進行外周血總RNA 測定，結(jié)果顯示肝癌患者的TGF-β1基因陽性率為55.2%，明顯高于慢性肝炎、肝硬化等疾病患者；同時對肝癌患者進行分期檢測，結(jié)果顯示Ⅲ期肝癌患者的TGF-β1基因陽性率為84.5%，明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期肝癌患者。以上研究結(jié)果均提示了在肝癌病變的過程中，組織分化與TGF-β1mRNA 的表達形式具有相關(guān)性，并且在一定程度上影響著肝癌的發(fā)展進程，而外周血TGF-β1mRNA 作為一種靈敏度較高的標(biāo)志物，在用于肝癌的早期診斷、癌變轉(zhuǎn)移等方面可以起到理想的監(jiān)測效果。

5 MicroRNA（miRNA）

miRNA 是一類非編碼單鏈的RNA 分子，在臨床上與多種腫瘤疾病具有相關(guān)性。在不同的腫瘤表達譜中，miRNA 也會表現(xiàn)出一定的差異性，因此在許多研究中都證實了可以將miRNA 的表達譜作為腫瘤診斷標(biāo)志物的其中一種。Hu 等[19]研究了miR-375 在肝癌早期診斷中的敏感度和特異度，結(jié)果顯示miR-375 的敏感度為100%，特異度為95.8%。Hou 等[20]在試驗中也對miR-375 和miR-199a-3p 進行了效果檢測，證時了這兩者均可以作為標(biāo)志物應(yīng)用到肝癌的早期診斷中。miRNA 是腫瘤細(xì)胞主要分泌的一種分子，參與著腫瘤細(xì)胞生成、脫落的全過程，并且伴隨腫瘤細(xì)胞組織的變化，其表達量也會明顯改變。因此，miRNA 的表達量可以反映人體內(nèi)健康或疾病的信息，應(yīng)用于肝癌的早期診斷中能夠起到重要的參考作用。

6 展望

在全球范圍內(nèi)，我國是肝癌高發(fā)的國家之一，特別是病毒感染的發(fā)生與肝癌出現(xiàn)具有密切聯(lián)系，引起了社會各界的廣泛關(guān)注，與此同時，肝癌的防治工作也成為了我們研究的重點方向，成為了臨床一項艱巨的任務(wù)。在篩選高危人群后，通過相關(guān)標(biāo)志物來對高危人群進行病情監(jiān)測，對于早期診斷肝癌和早期治療均具有重要的意義。早期診斷在臨床中可以為患者爭取手術(shù)治療的時間，在提高生存率、改善預(yù)后方面起到了不可替代的作用。在臨床的各類檢測方法中，超聲、MRI 及CT 等檢查方式雖然能夠在一定程度上檢測出肝癌病變的情況，但對于一些良性肝癌惡化、癌變組織轉(zhuǎn)移等情況難以作出合理的預(yù)測。

肝細(xì)胞癌變過程十分復(fù)雜，并且由于個體因素的不同，癌變基因表達異常的現(xiàn)象仍需要通過有效的標(biāo)志物來進行觀察和診斷。在肝癌細(xì)胞分化中，合并分泌微量蛋白進入外周血，這是在正常人群中難以檢測到的病理現(xiàn)象。現(xiàn)階段，臨床對于肝癌診斷的標(biāo)志物數(shù)量較多，無法通過單一的標(biāo)志物來進行多種表現(xiàn)形式肝細(xì)胞癌變的診斷，例如在AFP-L3 的檢測中，與GGT 和轉(zhuǎn)化生長因子β1均無明顯的相關(guān)性，但卻能夠起到一定的互補作用。肝癌診斷標(biāo)志物作為表達內(nèi)源凝血系統(tǒng)的指標(biāo)，反映了血漿凝血因子不同分級的表達水平，同時可以通過指標(biāo)情況來判斷受檢者肝臟病變的嚴(yán)重程度，因此應(yīng)對這些標(biāo)志物進行分析，以配合臨床早期診斷。

目前，對于肝癌早期診斷的研究中，通常采用多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測的方法，以提高肝癌陽性的準(zhǔn)確率。隨著臨床對肝癌檢測的深入研究，新的肝癌標(biāo)志物也會逐漸問世，應(yīng)用到臨床實踐中，因此尋找靈敏度更高的肝癌標(biāo)志物定性定量的檢測方法是亟需研究的課題。近年來，量子點標(biāo)記腫瘤標(biāo)志物的檢測方法被提出，引起了眾多學(xué)者的興趣，也會通過大量的實驗去研究多色量子點標(biāo)記不同的肝癌標(biāo)志物，以實現(xiàn)多種肝癌標(biāo)志物能夠同時進行分析檢測，不斷提高檢測靈敏度，同時應(yīng)用到肝癌的病情監(jiān)測、術(shù)后隨訪及復(fù)發(fā)預(yù)測中。