持留菌形成機制及治療研究進展

劉小龍，楊萬霞，馬延齡，王 丹，陳 昊

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 1.腫瘤外科；2.檢驗科，甘肅 蘭州 730030)

1944年Joseph Bigger第一次提出持留菌概念，持留菌和持留表型是微生物對不利環(huán)境的一種適應(yīng)性方式?？咕幬镏委熂?xì)菌感染時，幾乎不可能實現(xiàn)完全消滅細(xì)菌，最常見的原因是耐藥菌的存在。但是即使細(xì)菌對抗菌藥物敏感，菌群中總是含有一小部分能夠耐受抗菌藥物致死活性的群體，該亞群由持留菌組成，在遺傳上與其他細(xì)菌相同，但其耐受表型不同，在抗菌藥物環(huán)境下進入休眠狀態(tài)，表現(xiàn)出對抗菌藥物遲鈍的反應(yīng)能力來逃逸抗菌藥物的殺傷作用，待抗菌藥物被代謝清除后，持留菌則又恢復(fù)其生長能力，導(dǎo)致臨床治療失敗和感染復(fù)發(fā)，這是持留菌的持留特點。到目前為止，幾乎所有被檢測的細(xì)菌物種都已確定存在持留菌，甚至是真核微生物亦存在該表型的群體。目前研究證明，抗菌藥物無法根除持留菌，進行體外抗菌藥物試驗發(fā)現(xiàn)，持留菌水平會持續(xù)升高，并且發(fā)現(xiàn)在疾病急性期或者早期持留菌水平較低，而在慢性感染中持留菌表達(dá)水平顯著升高。這種具有逃逸性、適應(yīng)性的特殊群體導(dǎo)致了臨床遷延反復(fù)感染，給未來臨床抗菌藥物治療帶來巨大挑戰(zhàn)。持久性細(xì)胞的臨床意義不僅僅局限于復(fù)發(fā)感染，因為其構(gòu)成一個免受致命抗菌藥物殺滅的細(xì)胞亞群，在抗菌藥物存在下仍然存活，并且可以積累抗性突變。這對未來抗菌藥物使用具有潛在性威脅，極大危害人類健康[1]。

1 持留特性

隨機形成、對抗菌藥物敏感表型可逆是持留菌最大的特點，持留菌不同于耐藥菌，并未發(fā)生基因突變，只是單純抗菌藥物敏感程度發(fā)生改變，在高濃度抗菌藥物環(huán)境下處于靜止或休眠狀態(tài)，對抗菌藥物呈現(xiàn)遲鈍效應(yīng)，高濃度過后又恢復(fù)對抗菌藥物的敏感性，是一種特殊的高持留突變。持留菌休眠狀態(tài)并非一切生理功能的停止，只是處于一種低活力狀態(tài)，另外Drescher等[2]發(fā)現(xiàn)同一菌株在不同的環(huán)境下能誘導(dǎo)出不同的持留菌，可能是微生物互補的生存策略。

2 持留機制

2.1 免疫調(diào)控與持留表型 細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)家族分子，能負(fù)反饋抑制細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，SOCS-1是SOCS家族的一員，某些病原體可以通過上調(diào)SOCS-1逃避宿主免疫攻擊。病原微生物被巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞TLR受體識別后，啟動下游信號通路發(fā)揮免疫作用，發(fā)揮抗感染作用，Mal是TLR2、TLR4的下游信號通路的主要調(diào)節(jié)靶點，SOCS-1蛋白通過對Mal進行泛素化降解抑制免疫應(yīng)答，使炎癥因子減少，使病原微生物逃避宿主免疫應(yīng)答[3-5]。持留菌亦是通過SOCS-1抑制Mal途徑發(fā)揮免疫逃逸，通過TLR4誘導(dǎo)SOCS-1的表達(dá)，SOCS-1沉默后解除了對Mal的抑制，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β等炎癥因子表達(dá)會明顯上調(diào)，形成持留菌的TLR4-SOCS-1-Mal的持留菌免疫逃逸途徑[6]。

2.2 生物被膜與持留表型 大部分感染性疾病都與生物膜有關(guān)，存在于生物膜的微生物易躲避抗菌藥物的清除，持留菌的持留與其菌落形成的生物膜密切相關(guān)，生物被膜在持留菌和免疫大分子之間形成屏障，亦保護持留菌免受抗菌藥物侵害，與其持留作用密切相關(guān)，研究[6-8]表明持留菌產(chǎn)生生物被膜的能力強于無持留能力的一般細(xì)菌，如在肺炎克雷伯菌持留菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株對比中，持留菌被龍膽紫染色顯著深于對照組[6]；另外生物膜中的持留菌其數(shù)量、耐藥性均強于游離持留菌[9]，當(dāng)致死量抗菌藥物作用時，非持留菌和游離持留菌可被殺滅，生物膜中持留菌得以生存；Grant等[10]提出“保護環(huán)境”理論，如人體一些生理性體腔、屏障等，抗菌藥物難以到達(dá)或通過，又如結(jié)核分枝桿菌形成的肉芽腫，都有效躲避了藥物及人體免疫系統(tǒng)的清除，同樣生物膜亦是持留菌的“保護環(huán)境”，持留菌除了自身的耐藥特性外，亦與生物膜形成的微環(huán)境密不可分[11]。

2.3 代謝與持留表型 微生物內(nèi)ATP水平與持留菌的持留特性有關(guān)[12]，研究[13]表明金黃色葡萄球菌變?yōu)槌至艟M入休眠狀態(tài)后，細(xì)胞內(nèi)的ATP水平下降，而且細(xì)胞休眠狀態(tài)的標(biāo)志物在抗菌藥物攻擊時，表達(dá)量會上升100～1 000倍，亦有試驗研究[14-15]表明隨著ATP消耗，持留菌的數(shù)目越來越多，為了進一步驗證ATP與持留菌形成的關(guān)系，有研究[16]在培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基里增加ATP，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間延長，持留菌形成會逐漸減少。

2.4 毒素蛋白/抗毒素蛋白失衡與持留表型 毒素/抗毒素系統(tǒng)是研究比較成熟的持留菌持留機制[17]，毒素/抗毒素系統(tǒng)主要在細(xì)菌線粒體，但其功能尚未闡明，但其在持留菌的特性中發(fā)揮重要作用[18-20]。毒素/抗毒素是廣泛存在于原核生物體內(nèi)的一對操縱子，一個編碼毒素蛋白，另一個編碼抗毒素蛋白，毒素蛋白抑制遺傳物質(zhì)復(fù)制、蛋白翻譯、細(xì)胞周期等過程[21]，抗毒素蛋白調(diào)控毒素蛋白表達(dá)并及時對其降解，其中毒素蛋白會引起持留菌的形成[22]；hipA在大腸埃希菌發(fā)現(xiàn)的編碼毒素蛋白的基因，編碼的毒素蛋白使微生物活性區(qū)域失活而增加微生物對不良環(huán)境的耐受性[23-25]。

3 持留菌的治療

持留菌的休眠特性使多種抗菌藥物治療靶點失活，導(dǎo)致多種抗菌藥物無法將其清除[26]，臨床上治療持留菌的方法主要有使用抗菌藥物及物理、化學(xué)、生物效應(yīng)等方法。

3.1 聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物 聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物并根據(jù)藥敏試驗結(jié)果調(diào)整抗菌藥物的種類和劑量，或輔以抗菌藥物增敏劑來達(dá)到殺滅持留菌的目的，這是臨床最常用的手段[27-28]。研究[29]發(fā)現(xiàn)短時間內(nèi)使用高劑量利福平能更快的清除小鼠結(jié)核分枝桿菌內(nèi)臟感染，亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)延長抗菌藥物作用時間雖然能清除病原菌，但是容易形成高突變持留菌，導(dǎo)致慢性感染反復(fù)[30]，說明延長抗菌藥物使用時間并不可取，容易滋生持留菌。在抗菌藥物使用同時，加以甘露醇、溶解態(tài)氧可有效殺滅病原菌[31-32]。

3.2 非抗菌藥物

3.2.1 低水平直流電 低水平直流電對持留菌具有殺傷作用，應(yīng)用70 μA/cm的直流電可以殺傷98%的銅綠假單胞菌，并且對銅綠假單胞菌持留菌呈現(xiàn)致死性殺傷，而且使用低水平直流電聯(lián)合抗菌藥物有更好的效果，具有協(xié)同作用[32]，對控制與植入式醫(yī)療器械導(dǎo)致的慢性感染有極大的幫助。

3.2.2 溶菌性噬菌體 持留菌在高濃度抗菌藥物環(huán)境中會進入休眠狀態(tài)，再次進入生長狀態(tài)會引起遷延感染，溶菌性噬菌體會對重新生長階段的持留菌殺傷，但對休眠狀態(tài)的持留菌無法溶解清除[33]，從生長狀態(tài)減少持留菌的形成，有效降低持留菌的數(shù)量，對控制感染具有重要意義。

3.2.3 分子抑制劑 在毒素/抗毒素體系中，毒素蛋白會可逆的抑制細(xì)胞的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯，但當(dāng)毒素蛋白持續(xù)作用時，細(xì)胞則會發(fā)生不可逆的生長停滯，因此，Lioy等[34]驗證了通過破壞毒素/抗毒素模式的方法讓毒素蛋白持續(xù)殺滅持留菌，不能再生長增殖。BF8是革蘭陰性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制物，能使持留菌從休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)換為對抗菌藥物敏感狀態(tài)，達(dá)到殺傷持留菌的目的，C10亦可逆轉(zhuǎn)持留菌的抗菌藥物敏感性，改變其休眠狀態(tài)[35]。

4 持留菌的重要價值

4.1 持留菌對于臨床研究的意義 持留菌由于逃逸致死抗菌藥物殺傷的特性，使臨床很多疾病都遷延不愈，反復(fù)發(fā)作，因此，針對持留菌的持留特性，臨床上已經(jīng)逐漸出現(xiàn)很多治療手段，如低水平直流電、溶解性噬菌體等，這些對疾病的徹底治愈都具有很好的幫助。

4.2 持留菌對于微生物種群的意義 持留表型通常被認(rèn)為是微生物種群一種“賭注/保值”，從而避免種群滅絕手段，整個種群把賭注放在非生長或緩慢生長的持留菌，但這些表型變異體很好地適應(yīng)未來的壓力環(huán)境，從而使種群免于滅絕[36]。

5 討論

持留菌是細(xì)菌對于外界不良環(huán)境的應(yīng)激生存狀態(tài)，屬于一種進化形式，目前發(fā)現(xiàn)持留表型不僅存在于細(xì)菌，真核生物中亦出現(xiàn)持留菌[37]，持留菌于抗菌藥物環(huán)境中變?yōu)樾菝呋蛘哽o止?fàn)顟B(tài)，呈現(xiàn)出對抗菌藥物的惰性，待抗菌藥物過后，又會重新生長增值，并且恢復(fù)其對抗菌藥物的敏感性，其躲避抗菌藥物的形式不同于耐藥菌，且未發(fā)生基因突變。

持留菌的形成目前發(fā)現(xiàn)與生物膜的保護作用、胞內(nèi)低ATP狀態(tài)、毒素蛋白的作用、免疫調(diào)控等有關(guān)，臨床亦出現(xiàn)了針對持留菌休眠狀態(tài)的治療方法，這對臨床多種感染性疾病反復(fù)遷延的治療很有針對性，相信不久將會有更多清除持留菌的新技術(shù)、新方法。

由于持留菌與臨床治療相關(guān)，其治療方法主要分為抗菌藥物聯(lián)合治療和非抗菌藥物法，分為直接殺滅休眠狀態(tài)的持留菌、使休眠狀態(tài)持留菌重新獲敏、干擾持留菌形成三條策略[38]。Joseph Bigger第一次發(fā)現(xiàn)持留菌并提及持留菌清除方法，從持留菌的狀態(tài)轉(zhuǎn)化角度提出，分段或者間歇性使用抗菌藥物可以使持留菌從休眠狀態(tài)蘇醒，恢復(fù)對抗菌藥物的敏感性，繼而達(dá)到后續(xù)殺滅的目的，Kim等[35]發(fā)現(xiàn)C10和順式-癸酸能夠恢復(fù)桿菌和通路假單胞菌持留菌的休眠狀態(tài)，使其重新對不同種類的抗菌藥物敏感。菌膜去極化或直接破壞細(xì)胞膜，DNA交聯(lián)，抑制必需酶和反應(yīng)性氧化應(yīng)激產(chǎn)生均是潛在的方法，Hurdle等[39]認(rèn)為細(xì)菌雙層膜及膜重要功能蛋白可作為直接殺滅持留菌的靶點，雖然持留菌特殊的休眠表型和低代謝狀態(tài)，但仍需要完整的細(xì)胞膜保持其生存能力，Hu等[40]發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮衍生的HT6明顯抑制對非倍增金黃色葡萄球菌細(xì)胞的活性，破壞細(xì)胞膜和去極化，能夠殺滅持留菌和耐藥菌，增強已用抗菌藥物的效果。亦有學(xué)者通過質(zhì)和肽因子復(fù)蘇金黃色葡萄球菌持留狀態(tài)，恢復(fù)抗菌藥物殺傷的敏感性。持留菌產(chǎn)生的原因是外界各種原因刺激，因此，抑制應(yīng)激信號，干擾持留菌形成是從源頭上對其進行殺滅，Starkey等[41]發(fā)現(xiàn)抑制假單胞菌中的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)因子MfvR可明顯減少該類持留菌數(shù)目，抑制應(yīng)激信號ppGpp可使多個革蘭陽性菌持留菌數(shù)目減少，雖然消除現(xiàn)有的持留菌極大地促進有效治療，但在抗菌藥物治療之前抑制或減少其形成可有效預(yù)防感染[38]。

本綜述總結(jié)了持留菌的特點、形成機制及治療策略和手段，希望提高臨床對持留菌及其預(yù)防和治療手段的認(rèn)識，解決頑固性感染問題，減少抗藥性發(fā)展的機會，減少患者的身體負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。