熊膽粉產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究

閆廣利，孫暉，邱麗萍，靳喆，吳修紅，李杏花，楊波，王喜軍*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 國家中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.福建歸真堂藥業(yè)股份有限公司，福建 泉州 362100；3.黑龍江黑寶藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150040)

熊膽是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，為脊索動物門哺乳綱熊科黑熊SelenaretosthibetanusCuvier或棕熊Ursus-arctosLinnaeus的干燥膽囊(膽汁)，具有清熱、鎮(zhèn)靜、明目、殺蟲的功能[1]。熊膽傳統(tǒng)通過“殺熊取膽”的方式獲得，現(xiàn)代已開發(fā)了多種活熊膽汁引流技術(shù)，收集黑熊的膽汁加工制成熊膽粉，已獲批國家一類中藥新藥，其單味制劑熊膽膠囊收載于《中國藥典》[2]，并作為原料藥應(yīng)用于萬應(yīng)錠、比拜克膠囊、風(fēng)熱清口服液、龍澤熊膽膠囊、復(fù)方熊膽滴眼液、熊膽救心丸、熊膽痔靈栓、消痔軟膏、梅花點舌丸、麝香通心滴丸等《中國藥典》收載的成方制劑中?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，熊膽粉在肝膽系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼科、肛腸科等疾病中具有顯著的臨床療效，其中除肝膽系統(tǒng)疾病外，熊膽粉的其他療效并非是其主要成分?；切苋パ跄懰岬犬a(chǎn)生的[3]；筆者研究發(fā)現(xiàn)，熊膽粉清熱解毒保肝等作用是其中除掉熊去氧膽酸等小分子膽酸類成分后的大分子蛋白類成分所特有，而且具有高效的抗丙型肝炎病毒作用(IC50<0.2 μg/mL)，這是其他中藥或動物膽汁及?；切苋パ跄懰岬热斯ず铣善匪荒芴娲腫4-7]。熊膽粉廣泛的臨床需求和不可替代的特有藥用價值，決定了熊膽粉產(chǎn)業(yè)化的巨大經(jīng)濟和社會效益。本文對影響熊膽粉生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)進行綜述，以期促進熊膽粉的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 黑熊養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展

黑熊養(yǎng)殖是保障熊膽粉可持續(xù)生產(chǎn)的前提。我國傳統(tǒng)中藥熊膽主要通過“獵熊取膽”的方式獲得，對野外種群造成很大威脅，開展黑熊養(yǎng)殖技術(shù)研究，不僅保障傳統(tǒng)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，同時也更好地保護了熊類野外種群。

我國黑熊養(yǎng)殖業(yè)始于上世紀(jì)80年代，此時主要依靠從野外捕捉或從動物園引入，在飼養(yǎng)場進行馴化和飼養(yǎng)，抽取膽汁時熊要被固定上一個“鐵背心”，用一根膠管插入熊的膽囊，隨用隨取。而且當(dāng)時飼養(yǎng)場設(shè)施簡陋，飼養(yǎng)人員專業(yè)知識缺乏，熊的福利狀態(tài)極差。這種最初的黑熊養(yǎng)殖及殘忍的取膽方式引起了動物保護組織及公眾的抗議，對現(xiàn)在普遍采用的“無管自體造瘺膽汁引流技術(shù)”的黑熊養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生巨大負(fù)面影響[8-9]。

養(yǎng)殖場中黑熊福利問題是一個感情和倫理范疇的題目，是動物保護組織和公眾關(guān)注的焦點問題。我國政府不斷規(guī)范黑熊養(yǎng)殖業(yè)，促進解決人工養(yǎng)殖黑熊的福利問題。林業(yè)部于1997年發(fā)布了《黑熊養(yǎng)殖利用技術(shù)管理暫行規(guī)定》，2008年頒布了林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《黑熊養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)程》，2017年又頒布了林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《黑熊繁育利用技術(shù)規(guī)范》，這些國家法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)引導(dǎo)、規(guī)范了養(yǎng)熊業(yè)，逐步淘汰了規(guī)模小、條件簡陋、專業(yè)人員缺乏、衛(wèi)生狀況差、不能成功繁殖的養(yǎng)熊場，保障了人工養(yǎng)殖黑熊的福利條件，使黑熊養(yǎng)殖業(yè)逐步走向規(guī)范化、規(guī)?；?、可持續(xù)的發(fā)展之路[10]。

在國家法規(guī)和國際公約的引導(dǎo)下，黑熊養(yǎng)殖企業(yè)不斷加強養(yǎng)殖技術(shù)的開發(fā)和規(guī)范操作規(guī)程，示范性引領(lǐng)了行業(yè)的發(fā)展。黑龍江黑寶藥業(yè)養(yǎng)熊場逐步探索建立了黑熊養(yǎng)殖的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程，形成了一套完整的從飼養(yǎng)管理、疫病防治、疫情控制、檔案管理、飼料配制、仔熊哺育和熊膽粉精制加工等方面的科學(xué)的飼養(yǎng)管理體系，目前擁有黑熊3 000余頭。黑寶藥業(yè)養(yǎng)熊場以“本交”繁殖與人工繁育相結(jié)合，解決了在提高胎產(chǎn)率、成活率以及孕檢技術(shù)等方面的問題，同時在人工采精、授精、仔熊哺育和孕檢技術(shù)等方面取得突破性進展，每年出生幼熊成活率達(dá)100%，為熊科動物二代及后代的人工繁殖打下了堅實的基礎(chǔ)。自1999年已有第三代飼養(yǎng)熊誕生并存活，目前圈養(yǎng)條件下繁殖的熊數(shù)量已是圈養(yǎng)熊的主體，其中子Ⅰ代387頭，子Ⅱ代901頭，子Ⅲ代及后代2 264頭。根據(jù)《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》規(guī)定，野生動物人工繁育進入子Ⅱ代或后續(xù)子代應(yīng)當(dāng)被視為馴養(yǎng)動物，其交易不被禁止，即可用于人類生活。目前黑寶養(yǎng)熊場的黑熊人工繁育已進入子Ⅴ代，年人工繁育數(shù)量超過500頭，可合法交易使用。

福建歸真堂藥業(yè)擁有我國南部最大的黑熊馴繁基地，根據(jù)黑熊年齡、發(fā)育狀況，配制不同的營養(yǎng)食譜方，建立了黑熊繁育、飼喂配方、疾病防控、引流膽汁等方面的操作規(guī)范，承擔(dān)起草了國家林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“養(yǎng)熊場符合性規(guī)范”、福建地方標(biāo)準(zhǔn)“黑熊養(yǎng)殖及活熊取膽技術(shù)規(guī)程”，使黑熊馴養(yǎng)繁殖符合法律法規(guī)、達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。歸真堂藥業(yè)現(xiàn)養(yǎng)殖黑熊1 000余頭，其中子Ⅰ代441頭，子Ⅱ代531頭，子Ⅲ代及后代40頭，每年可繁殖小熊150～200頭，出生幼熊成活率達(dá)100%。

黑熊養(yǎng)殖的產(chǎn)業(yè)化，不僅解決了熊膽粉的資源問題，更起到了保護野生黑熊免于獵殺的作用，從源頭上滿足了人類對于野生動物的食用及藥用等需求。正由于此，目前野生黑熊的數(shù)量在逐年大幅度提升。

2 熊膽汁引流技術(shù)

熊膽傳統(tǒng)的制備方法是殺熊取膽，致使藥源動物瀕于滅絕。20世紀(jì)80年代后期，國內(nèi)逐步應(yīng)用活熊膽囊插入引流管采集膽汁，即有管膽汁引流采集技術(shù)，來生產(chǎn)熊膽粉[11-12]。這種方法在膽囊內(nèi)存有常在性引流管，造成膽囊與肝臟的損傷和感染，對熊的健康和壽命造成嚴(yán)重影響，也影響熊膽粉的質(zhì)量[13-14]。而且，這種有管膽汁引流方法需要給熊穿戴“鐵背心”，熊在采集膽汁過程中極為痛苦，由此造成動物保護組織對養(yǎng)熊取膽的激烈抗議。然而，這種有管膽汁引流技術(shù)很快就被新的自體造瘺無管膽汁引流技術(shù)所取代。

國家林業(yè)局《黑熊養(yǎng)殖利用技術(shù)管理暫行規(guī)定》要求“不得采用常流式或異物引流導(dǎo)管，須用熊自體組織作引流導(dǎo)管，取膽熊體不得加裝任何附加裝置”。熊自體造瘺無管膽汁引流技術(shù)符合國家規(guī)定，是通過外科手術(shù)在膽囊切開創(chuàng)口，與自體組織形成瘺管，瘺口固定于腹外，可用于每日非連續(xù)、定時定量進行采集。經(jīng)無管引流取膽的熊不必穿“鐵背心”固定，熊活動自如，自由飲食，而且避免異物存留造成膽囊炎的發(fā)生，同時提高膽汁質(zhì)量和產(chǎn)量。

目前，國內(nèi)大型養(yǎng)熊場已普遍掌握黑熊自體造瘺無管膽汁引流技術(shù)。黑龍江黑寶藥業(yè)與福建歸真堂藥業(yè)從不同角度完善了黑熊自體造瘺無管膽汁引流技術(shù)[15]。即：成年黑熊在完成術(shù)部清洗、除毛、消毒后，于腹中線劍突向下處，切開皮下組織，鈍性分離肌肉，切開肌膜、腹膜，把膽囊緩慢拉出，在膽囊上切開創(chuàng)口，并與肌肉組織形成瘺管，用縫合線適度扎緊再固定膽囊和膽囊皮膚，分別縫合腹膜、脂肪、肌膜、肌肉和皮膚，然后清洗和消毒術(shù)口，并與術(shù)蘇醒后4 h，給予黑熊飼喂蜂蜜水或糖水和雞蛋水；術(shù)后一周內(nèi)，給予黑熊肌注或口服抗生素，防止創(chuàng)口感染，并注意定量飼喂合理搭配的營養(yǎng)飼料。痊愈后每日定時采集熊膽汁。該項無管無痛自體造瘺膽汁引流技術(shù)，實現(xiàn)了在自然生活狀態(tài)下取膽，每天150 mL的膽汁引流量(分泌量1 200 mL以上)，既保證了熊的自身生理需求和身體健康，又保證了熊膽粉的質(zhì)量穩(wěn)定。

熊自體造瘺無管膽汁引流技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是自體造瘺方式和膽汁收集方式，前者會影響術(shù)后溢漏膽汁、引流導(dǎo)管狹窄或閉鎖，后者會影響真正無痛取膽的效果。延邊松寶制藥有限公司建立了一種熊自體組織引流導(dǎo)管及人工縱型皺褶取膽汁的制作方法[16]，即利用熊空腸或膽囊組織作引流導(dǎo)管，吻合或連結(jié)導(dǎo)管與膽囊并理順，做皮外引流口，制成熊自體組織引流導(dǎo)管。期間，熊開腹后在膽底部采用縫合或打結(jié)法造縱型皺褶3～6個，皺褶均勻，閉合嚴(yán)密，解決了術(shù)后溢漏膽汁的難題，并且便于插管取膽，不伴發(fā)引流口、引流導(dǎo)管狹窄或閉鎖，抗感染的免疫力和修復(fù)能力強。采集膽汁時，將已消毒好的軟導(dǎo)管對準(zhǔn)先用酒精消毒的引流口，經(jīng)引流道插入膽囊內(nèi)，膽汁靠重力自然流出于接膽瓶內(nèi)。軟導(dǎo)管與金屬導(dǎo)管不同，不引起膽囊炎和膽囊出血，避免偶有伴發(fā)疼痛的弊病[17]。云南天佑熊業(yè)制藥有限公司建立了一種利用能夠調(diào)節(jié)瘺管括約肌收張而方便收集膽汁的方法，即在黑熊的腹壁和膽囊之間，利用黑熊自身組織在腹壁端制造環(huán)形括約肌，括約肌收縮時能關(guān)閉管腔，舒張時使管腔開放，利用括約肌受植物性神經(jīng)的支配或激素調(diào)節(jié)的特性，采膽時給黑熊喂?fàn)I養(yǎng)液，使黑熊括約肌舒張，管腔開放，用酒精棉球消毒開放的管腔通道口，把消毒后的空心探針探入管腔通道，膽汁即沿著空心探針自動流到接膽汁的杯子中，取膽完成后即可拔出探針[18]。

熊自體造瘺無管膽汁引流技術(shù)完全擺脫了籠養(yǎng)、鐵背心、留存管等對黑熊身心殘害的生產(chǎn)方式，已實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化及產(chǎn)業(yè)化。目前人工養(yǎng)殖黑熊無管引流取膽每頭黑熊每年可產(chǎn)3 kg熊膽粉，而據(jù)調(diào)查獲取1 kg熊膽粉需要獵殺22～25頭熊，那么飼養(yǎng)一頭黑熊相當(dāng)于一年保護66～75頭黑熊免于殺害[9]，因此，該技術(shù)有力解決了熊膽使用和野生動物資源保護之間的矛盾。

3 引流取膽對黑熊健康影響的評價

熊自體造瘺無管膽汁引流技術(shù)極大地改善了人工養(yǎng)殖黑熊的福利問題，使熊膽的可持續(xù)使用成為可能，但長期引流取膽汁是否對養(yǎng)殖黑熊的健康造成影響，仍是社會尤其是動物保護組織關(guān)注的焦點，也是養(yǎng)熊業(yè)能否成為可持續(xù)發(fā)展行業(yè)的關(guān)鍵。

動物行為是指動物在一定環(huán)境條件下，為了完成攝食排遺、體溫調(diào)節(jié)、生存繁殖及滿足其他生理需求而以一定姿勢完成的一系列動作，具有明顯的環(huán)境適應(yīng)機能。東北林業(yè)大學(xué)對福建歸真堂黑熊養(yǎng)殖基地的24頭圈養(yǎng)黑熊晝間行為進行了細(xì)致的調(diào)查，包括休息、飲水、排遺、運動、警戒、體表護理、社群、繁殖、刻板及其他類等10類行為，統(tǒng)計分析了不同季節(jié)、不同年齡段、不同性別取膽與非取膽黑熊晝間行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：冬季時對刻板行為、休息行為、體表護理行為有影響，春季時對繁殖行為有影響；4～6歲取膽對黑熊排遺行為、體表護理行為、刻板行為、社群行為有影響，7～9歲時對黑熊排遺行為和體表護理行有影響；取膽對雌性黑熊社群行為有影響，對雄性黒熊排遺行為有影響[19]；除此之外，取膽對黑熊晝間行為均無影響。該研究指導(dǎo)了熊類養(yǎng)殖向更科學(xué)、合理的方向發(fā)展，養(yǎng)殖場據(jù)此研究完善了圈養(yǎng)黑熊的養(yǎng)殖化管理，在動物室的籠舍內(nèi)增設(shè)供黑熊玩樂的設(shè)施，比如鋼筋爬梯，以達(dá)到豐容的目的，通過增加玩耍行為來減少刻板行為的發(fā)生；在籠舍內(nèi)增設(shè)躲避設(shè)施，降低特殊時期人為干擾給黑熊帶來的必理壓為；除特殊情況(待產(chǎn)雌性黑熊和產(chǎn)仔雌性黑熊)外，其他黑熊盡量不單籠飼養(yǎng)，并且有嚴(yán)重刻板行為的黑熊不和其他無刻板行為或者有輕微刻板行為的黑熊同籠飼養(yǎng)，以減少模仿；在早晚兩次定時飼喂的中間，不定時地少量投喂一些蔬菜、水果，降低定時飼喂模式對刻板行為的影響；按順序每天安排一批熊進入活動區(qū)域活動，廣闊的活動空間減少了黑熊刻板行為的發(fā)生。通過完善的養(yǎng)殖化管理，養(yǎng)殖黑熊的種群和種質(zhì)得到保護。

筆者課題組從行為學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)及系統(tǒng)生物學(xué)等角度對黑龍江黑寶藥業(yè)養(yǎng)殖場黑熊的健康狀況進行了系統(tǒng)研究，評價了長期引流取膽汁對黑熊健康狀態(tài)的影響。首先采用行為學(xué)研究的方法，觀察并分析了養(yǎng)殖熊的各階段行為特點，從整體上初步對人工養(yǎng)殖熊包括引流取膽汁熊的生活質(zhì)量及狀態(tài)做以分析，證明了引流取膽汁黑熊與正常養(yǎng)殖黑熊行為無差異；又進一步再通過對肝功能(ALT、AST等15項指標(biāo))、腎功能(UN、Cr、UA、CO2CP共4項)、胰功能(AMY)、血脂與脂蛋白(CHO、TG等6項指標(biāo))、血糖(GLU)、心肌酶(CK、CK-MB、LDH、HBDH共4項)、電解質(zhì)(P、Mg等8項指標(biāo))、尿液及糞便(SG、UBG等26項)等所包括的65項指標(biāo)比較測定，客觀地評價機體的各系統(tǒng)及器官的功能狀況，未發(fā)現(xiàn)引流取膽汁熊各相關(guān)的器官及系統(tǒng)與非取膽熊有明顯差異(P<0.05)；在此基礎(chǔ)上，又采用代謝組學(xué)的方法，從整體代謝上全面地評價引流取膽汁對正常養(yǎng)殖黑熊機體功能的影響，證實引流取膽汁對黑熊血液及尿液代謝物無影響。通過三方面的系統(tǒng)研究，未發(fā)現(xiàn)長期引流膽汁對黑熊的行為、各系統(tǒng)功能及代謝水平產(chǎn)生影響，闡釋了“無管無痛自體造瘺膽汁引流技術(shù)”的可行性[20]。

4 熊膽粉加工技術(shù)

引流采集的熊膽汁需要進一步處理、加工制成熊膽粉，加工工藝主要包括澄清、除雜、干燥三個步驟。首先，熊膽汁在4～10 ℃靜置澄清；然后，采用離心、過濾或大孔吸附樹脂等方法進行吸附處理，得到水溶性熊膽汁；最后，采用真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥等方法，制備獲得熊膽粉[15]。例如，熊膽汁在10 ℃靜置24 h，靜置后的上清液采用10 000 r/min的高速離心機進行離心處理45 min，離心液即水溶性熊膽汁，再置于真空干燥機中，在60 ℃、相對壓力為-0.06 MPa下，真空干燥48 h后，進行粉碎，過120目篩，即得到含水率2%的熊膽粉成品，為具有玻璃樣光澤的亮金黃色粉末；取熊膽汁靜置后的上清液，于相對壓力0.1 MPa下通過過濾精度為0.5 μm的鈦板鈦棒過濾器進行過濾，濾液采用浸膏噴霧干燥機，在射流速度990 m/s，30 ℃、相對壓力-0.06 MPa下，以超音速速度瞬時干燥，然后粉碎，過120目篩，即得含水率2%的熊膽粉成品，為具有玻璃樣光澤的亮金黃色粉末；取熊膽汁靜置后的上清液，按重量比為1∶80的比例與D101型工業(yè)大孔吸附樹脂混合均勻，用水洗滌至大孔樹脂流出液無膽汁顏色，所得流出液于壓蓋型冷凍干燥機中進行程序升溫冷凍干燥，粉碎后過100目篩，即得含水率為2%的熊膽粉成品，為具有玻璃樣光澤的亮金黃色粉末。齊光偉建立了一種冰晶態(tài)的熊膽粉制備方法，將無管引流法采集的熊膽汁過濾得到濾液，用少量水稀釋后，先后充入氮氣和二氧化碳?xì)怏w，然后進行深度冷凍，使熊膽汁處于一種冰晶狀態(tài)，接著進行升華，由此所得冷凍干燥熊膽粉為玻璃樣光澤的亮金黃色或鮮黃色粉末，顯亮黃色熒光，吸濕率小于2%，水中溶解度大于10%，乙醇中的溶解度大于1.2%[21]。

以熊膽粉為原料，進一步處理制備不同的有效部位，可用于熊膽粉創(chuàng)新藥物開發(fā)。取熊膽粉以水溶解或新鮮熊膽汁，用萬級分子篩濾膜或超濾膜過濾，取沉淀，加水溶解，上葡聚糖凝膠柱，以水或緩沖溶液為洗脫溶劑分離，洗脫液冷凍干燥，得到熊膽大分子提取物，具有抗丙型肝炎病毒的作用，可用于開發(fā)治療丙型肝炎藥物[5-7]。將熊膽粉用乙醇回流提取，提取液回收乙醇濃縮后，再進行堿水解、中和酸化、乙酸乙酯提取、乙酸乙酯結(jié)晶、乙醇結(jié)晶，得熊膽粉總膽酸提取物，其中熊去氧膽酸的含量不低于70%，鵝去氧膽酸含量不高于20%，可用于開發(fā)抗菌、抗病毒、止咳化痰和保肝利膽藥物[22]。采用乙醇對熊膽粉進行提取，制得熊膽醇提物，向熊膽醇提物中加入蒸餾水使溶解，制成熊膽水溶液，上大孔樹脂柱，依次用蒸餾水、95%乙醇進行梯度洗脫，收集95%乙醇洗脫液，蒸干，得到熊膽樹脂柱分離物，拌入硅膠，干燥，置于硅膠柱頂部，以氯仿-甲醇混合溶液為洗脫劑，進行硅膠柱梯度洗脫，收集體積比為4:1的氯仿-甲醇混合溶液為洗脫劑的洗脫液，蒸干，即得熊膽提取物，其中?；切苋パ跄懰岬暮窟_(dá)到65%以上，能夠有效地降低高脂飲食脂肪肝大鼠肝勻漿中甘油三酯和膽固醇的含量，在治療脂肪肝方面具有良好的應(yīng)用前景[23]。將熊膽粉醇提物制成水溶液，上大孔樹脂柱，依次用蒸餾水、20%乙醇、40%乙醇洗脫，收集40%乙醇洗脫液，蒸干，即得熊膽提取物，其中?；切苋パ跄懰岬暮看笥?0%，?；蛆Z去氧膽酸的含量大于60%，可開發(fā)治療燒燙傷的藥物[24]。

5 熊膽粉質(zhì)量控制技術(shù)

熊膽粉化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有結(jié)合型熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸、蛋白質(zhì)、肽、游離氨基酸、磷脂、膽色素、膽固醇、脂肪酸和無機元素[25-26]，其中膽汁酸類成分被認(rèn)為是其主要有效成分，熊去氧膽酸是其特有成分；大分子蛋白類成分具有高效抗丙型肝炎活性；磷脂、膽色素、膽固醇、氨基酸等成分也具有廣泛的生理活性，對這些成分進行含量測定，有利于整體控制熊膽粉的質(zhì)量。

熊膽粉的含量測定以及質(zhì)量控制多以膽汁酸類成分為指標(biāo)，衛(wèi)生部頒布的新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)中熊膽粉的標(biāo)準(zhǔn)分別使用了TLC法和HPLC-UV法對熊膽粉中的膽汁酸類成分進行了鑒別、檢查和含量測定，規(guī)定含?；切苋パ跄懰岵坏蒙儆?3%。該標(biāo)準(zhǔn)中利用?；切苋パ跄懰岬淖贤饽┒宋者M行含量測定，圖譜的基線易發(fā)生漂移，靈敏度較差，給測定工作帶來困難，而利用HPLC-ELSD法能夠解決這個問題，并且能夠?qū)π苣懛壑械呐；切苋パ跄懰岷团；蛆Z去氧膽酸進行同時測定，測定方法具有較好的準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性，適用于熊膽粉的質(zhì)量評價與控制[27-28]。磷脂是重要的生物活性物質(zhì)，其主要成分磷脂酰膽堿(PC)具有改進肌體神經(jīng)功能障礙及紊亂，恢復(fù)腦功能，增強記憶力以及抗衰老等功效。利用HPLC-UV法建立了熊膽粉中磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)的含量測定方法，在15 min內(nèi)完成測定，方法重復(fù)性較好，熊膽粉中PC、PI、PE的平均含量分別為3.6 mg/g、58.3 mg/g、3.9 mg/g[29]。文獻報道[30]，利用酶標(biāo)儀檢測熊膽粉中膽紅素含量為0.78%～1.89%，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)含量為6.41%～9.71%，用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定氨基酸含量為0.52%～2.12%，其中牛磺酸含量最高，為0.48%～1.97%，用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定微量元素，主要含有Ca、K、P、Na、Cu、Zn等元素。

為整體控制熊膽粉的質(zhì)量，筆者課題組建立了熊膽粉HPLC-UV指紋圖譜，并對熊膽粉中主要膽汁酸類成分牛磺熊去氧膽酸和?；蛆Z去氧膽酸進行了含量測定，為熊膽粉的整體質(zhì)量控制提供了方法[31-32]。測定黑寶藥業(yè)生產(chǎn)的10批熊膽粉指紋圖譜，確定19個共有峰，選擇熊去氧膽酸峰為參照峰，利用相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法計算指紋圖譜相似度均大于0.9，說明黑寶熊膽粉總體的化學(xué)組成一致性較好，質(zhì)量穩(wěn)定，可作為黑寶熊膽粉的專屬性指紋圖譜。質(zhì)量跟蹤研究顯示，同一月內(nèi)(每周取樣一次)、同一年內(nèi)(連續(xù)監(jiān)測12個月份)以及不同年份產(chǎn)熊膽粉中兩種膽汁酸類成分的含量都相對穩(wěn)定，不隨季節(jié)交替而產(chǎn)生變化，質(zhì)量穩(wěn)定。這也證明了在規(guī)范、科學(xué)的質(zhì)量檢測方法的監(jiān)控下，通過規(guī)范化養(yǎng)殖管理，完全能夠?qū)崿F(xiàn)對熊膽粉生產(chǎn)質(zhì)量的控制。

6 結(jié)論

熊膽粉是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有不可替代的特有藥用價值，然而由于人工養(yǎng)熊及活體取膽備受爭議，制約了熊膽粉的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。在國家法規(guī)的引導(dǎo)下，黑熊養(yǎng)殖技術(shù)和操作規(guī)范不斷完善，無管無痛自體造瘺膽汁引流技術(shù)不斷優(yōu)化，人工養(yǎng)殖黑熊的福利問題得到解決，膽汁引流不影響黑熊健康和壽命，熊膽粉的加工技術(shù)先進，熊膽粉質(zhì)量得到有效評價及控制，從而解決了我國熊膽粉的藥用及其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵技術(shù)問題，更解決了野生資源利用和保護的矛盾，極大地推動了養(yǎng)熊業(yè)和熊膽粉產(chǎn)業(yè)發(fā)展，熊膽粉已進入規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)、可持續(xù)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展之路。