ASXLl基因突變?cè)谠l(fā)性血小板增多癥中的臨床意義

王彥麗 陳運(yùn)平 閆世彬 夏景清 李智慧

臨沂市中心醫(yī)院，山東 臨沂 261000

骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms,MPN)是來源于多能造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，臨床表現(xiàn)多為血栓、出血及髓外造血[1]。原發(fā)性血小板增多癥、真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性骨髓纖維化為經(jīng)典MPN[2]。原發(fā)性血小板增多癥(ET)是MPN的一個(gè)亞型，以血小板持續(xù)增多并伴有一系列臨床癥狀為特征。自2005年MPN患者發(fā)現(xiàn)JAK2V617F基因突變[3- 5]，人們對(duì)MPN的發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。2013年，在ET及PMF患者中發(fā)現(xiàn)CALR基因突變[6- 7]。JAK2、CALR基因的發(fā)現(xiàn)使得MPN的發(fā)病機(jī)制有了新的生物學(xué)標(biāo)志及預(yù)后指標(biāo)，但不能解釋不同MPN的顯著差異。研究顯示，幾乎所有髓系腫瘤都有ASXLl檢出并參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但ASXL1在ET中的突變情況及臨床意義尚不明確[8- 9]。本研究分析了295例ET患者ASXLl基因突變情況，并與JAK2V617F、MPL及CALR各類基因突變比較臨床指標(biāo)差異，初步探討其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 病歷資料

選擇我院2014年1月—2019年6月血液科收治的血小板增多癥患者295例。中位年齡58(19～87)歲，其中女150例，男145例。均確診為ET[10]。

1.2 ASXL1、JAK2V617F、MPL和CALR基因突變檢測(cè)

提取骨髓樣本中基因組DNA。ASXL1基因突變檢測(cè)采用NGS。使用Illumina的Nextseq500測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序。JAK2V617F突變采用AS- PCR熒光探針法檢測(cè)。MPLexon10突變檢測(cè)采用Sanger測(cè)序法。其上游引物序列為：TGACCTTGCGGGCCGAC，下游引物序列為：GATCTGGGGTCACAGAGCGA。使用3730XL測(cè)序儀進(jìn)行電泳，采用DNA序列軟件Sequencher V4.5進(jìn)行突變分析。CALRexon9突變檢測(cè)采用PCR+片段分析法。其上游引物序列為：FAM- CTGGTCCTGGTCCTGATGT，下游引物序列為：TCTCACAGAGACATTATTTGGC。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用3500XL測(cè)序儀(Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行高分辨率毛細(xì)管凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用片段分析軟件GENEMAPPERID V4.1(Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS21.0軟件分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ASXL1、JAK2V617F、MPL、CALR基因突變分析

ASXLl基因結(jié)果顯示：ASXLl基因突變率為5.8%(17/295)，突變方式為移碼突變、點(diǎn)突變及無義突變：Gly646Trpfs(n=7)、Pro808Leufs(n=1)、Thr823X(n=1)、Glu768X(n=1)、E727X(n=1)、G646Wfs(n=2)、R634X(n=1)、L823X(n=1)、Y591X(n=1)及Ser834X(n=1)；患者平均年齡為57歲(40～85歲)。JAK2V617F突變的發(fā)生率為39.7%(117/295)，患者的平均年齡為60歲(18～87歲)。MPL基因突變發(fā)生率為2.7%(8/295)，突變類型包括MPLW515K(n=4)、MPL W515L(n=1)、MPL W515R(n=1)、 MPLS505N(n=1)。CALR基因結(jié)果顯示：CALR基因突變率為30.5%(88/295)，主要突變類型包括：I型(p.L367fs*46 del52bp)56例(63.6%)、II型 (p.K385fs*47 ins5bpTTGTC)32例(36.4%)。CALR突變患者的平均年齡為58歲(26～86歲)。 在本組患者中，ASXL1在ET中主要以雙突變形式共存，有11例患者同時(shí)伴有CALR、ASXLl基因突變，具體資料見表1，其余為：ASXLl/JAK2V617F(n=3)，ASXLl/MPL(n=1)，MPL/CALR(n=1)。

表1 11例ASXL1、CALR基因雙突變?cè)l(fā)性血小板增多癥患者基因類型

2.2 不同基因突變類型原發(fā)性血小板增多癥患者的臨床實(shí)驗(yàn)室特征

ASXLl突變患者外周血：白細(xì)胞(9.7±1.4)×109/L，血紅蛋白(110±6.9)g/L，血小板(1067±39)×109/L，與JAK2V617F、CALR單突變及三陰性組相比，ASXL1基因突變組患者有較低的血紅蛋白水平及更高的血小板計(jì)數(shù)，與突變陰性組相比，ASXLl突變組白細(xì)胞水平低于陰性組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 不同基因突變類型原發(fā)性血小板增多癥患者的臨床實(shí)驗(yàn)室特征

注：P1值為ASXL1突變組與CALR突變組比較；P2值為ASXL1突變組與JAK2突變組比較；P3值為ASXL1突變組與三陰性組比較。

3 討 論

表觀遺傳調(diào)節(jié)中維持基因表達(dá)穩(wěn)態(tài)的兩類重要表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白為Trithorax家族(Trithorax group，TrxG)和polycomb家族(polycomb group， PcG)。TrxG蛋白的主要功能是維持基因的活化狀態(tài)，而PcG則負(fù)責(zé)蛋白保持發(fā)育過程中同源異形基因的沉默。人類ASXLl基因是trxG和PRC(Polycomb- group repressor complex)的增強(qiáng)子，具有抑制/激活雙重特性，在多種組織中廣泛表達(dá)[11]。ASXLl編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)于所有造血細(xì)胞，具有對(duì)轉(zhuǎn)錄的雙向激活與抑制作用[12]。Fisher等[13]建立的ASXL1敲除的小鼠模型表明ASXL1對(duì)于維持正常的造血功能是必須的。

ASXLI作為表觀遺傳調(diào)節(jié)子可與TET2、JAK2V617F、CEBPA、RUNXl等基因突變共存。ET患者中ASXL1、DNMT3A、TET2、EZH2、IDH突變常常伴隨JAK2、MPL或CALR的突變[14]。國(guó)內(nèi)研究顯示，ASXLl突變是ET患者中除JAK2及CALR突變外檢出率最高的基因事件，多為多基因共存。多基因檢測(cè)可以為ET預(yù)后分層及靶向治療靶點(diǎn)提供更多依據(jù)[15]。本組295例ET患者進(jìn)行基因檢測(cè)，ASXLl基因突變率為5.8%(17/295)，均為移碼突變、點(diǎn)突變或無義突變，ASXLl突變高頻與CALR突變共存，本組結(jié)果與既往研究基本一致[16]。Brecqueville等人[17]在53例ET患者中發(fā)現(xiàn)兩種類型的ASXLI突變：p.Trp796Gly和p.Gly646Trp。目前，關(guān)于ET中ASXLl突變的臨床意義少見報(bào)道。本組ASXLl突變患者與其他單基因突變相比血小板水平明顯升高，血紅蛋白水平明顯降低，這提示ASXL1突變ET患者的巨核系、紅系增殖異常顯著。總之，ASXL1基因突變是ET患者的重要生物學(xué)標(biāo)志之一。ET的發(fā)生可能由于一個(gè)或多個(gè)基因的共同作用結(jié)果,如JAK/STAT通路相關(guān)基因(CBL、LNK、NRAS)、表觀遺傳調(diào)控相關(guān)基因(TET2、EZH2、ASXL1、DNMT3A、IDH)及剪接因子相關(guān)基因(SF3B1、SRSF2、U2AF1)等[18- 19]。針對(duì)ET發(fā)病過程中起決定作用的基因，研制更多的靶向藥物，是根本改變ET預(yù)后的關(guān)鍵。ASXLl基因突變的ET患者多個(gè)基因突變?nèi)绾尉C合作用于疾病的發(fā)生及發(fā)展尚未明確，需要進(jìn)一步的深入研究。未來隨著NGS檢測(cè)更多致病基因并進(jìn)行更深的功能研究，將對(duì)我們認(rèn)識(shí)ET的發(fā)病機(jī)制、預(yù)后和治療發(fā)揮重要的作用。