黃腐酸離體在體實(shí)驗(yàn)藥理研究新進(jìn)展

周霞萍 張 坤 周永全 朱天南 趙家永

1華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院 上海 200237

2南京富里康生物科技有限公司 南京 210000

3稷山興鄉(xiāng)腐植酸肥業(yè)開發(fā)有限公司 運(yùn)城 043200

4云南格瑞環(huán)保工程有限公司 昆明 650106

5重慶雙豐化工有限公司 重慶 402100

黃腐酸是腐植酸中的一種，腐植酸醫(yī)藥應(yīng)用從唐朝柳宗元著《答崔黯書》開始有記載，歷經(jīng)宋、元、明、清，在1995年原化工部批準(zhǔn)成立中國腐植酸工業(yè)協(xié)會醫(yī)藥專業(yè)委員會后得到了拓寬。2009年4月，曾憲成在“中醫(yī)藥國際論壇”上的報(bào)告《腐植酸醫(yī)藥面向國際論壇》反響強(qiáng)烈[1]。2018年5月，中國腐植酸工業(yè)協(xié)會在山東聊城召開“首屆中華腐植酸醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展論壇”[2]，會上眾多專家的報(bào)告，如北京同仁醫(yī)院袁申元[3]的報(bào)告、昆明理工大學(xué)李寶才[4]的報(bào)告等，點(diǎn)燃了新一代腐植酸人在腐植酸醫(yī)藥研發(fā)上的熱情。會上，新一屆“中國腐植酸工業(yè)協(xié)會醫(yī)藥專業(yè)委員會”成立，促進(jìn)了腐植酸、黃腐酸的藥理研究。鑒于黃腐酸的靶向性，深入藥理研究有重要的現(xiàn)實(shí)意義[5]。

本文基于黃腐酸的優(yōu)勢和特點(diǎn)，運(yùn)用相似論原則，即取類比象的思維方法，通過對大量的主、客體的相互類似現(xiàn)象的分析，找出各種各樣的規(guī)律性[6]。按照黃腐酸的離體實(shí)驗(yàn)藥理研究進(jìn)展、在體實(shí)驗(yàn)藥理研究進(jìn)展、作者單位的案例分析以及研究展望的順序展開論述。

1 黃腐酸的離體實(shí)驗(yàn)藥理研究進(jìn)展

離體實(shí)驗(yàn)是指通過體外實(shí)驗(yàn)方法觀察實(shí)驗(yàn)藥物的藥理藥效，實(shí)驗(yàn)對象主要為體外培養(yǎng)的各種細(xì)胞、細(xì)菌、病毒等病原體。離體實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是不受個體差異干擾，能嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，重復(fù)性好。

早年，王言貴等[7]研究黃腐酸對抗體產(chǎn)生細(xì)胞（APC）、體外培養(yǎng)細(xì)胞及常見細(xì)菌、病毒的影響，結(jié)果表明：黃腐酸鈉對體外培養(yǎng)細(xì)胞無毒性；許偉等[8，9]以離體大鼠皮膚為透皮屏障，用生理鹽水為接受液，測定黃腐酸鈉的透皮吸收量，結(jié)果表明：黃腐酸鈉軟膏以零級動力學(xué)的速率釋放藥，在無角質(zhì)層的皮膚中，透皮速率是完整離體皮膚透皮速率的72倍；Jayasooriya R G P T 等[10]的離體實(shí)驗(yàn)研究顯示，黃腐酸可增強(qiáng)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7）體外抗腫瘤介質(zhì)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞體外凋亡；Huang W S 等[11]研究表明，黃腐酸可減弱耐藥誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116）對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用；Chien S J 等[12]通過研究黃腐酸對同型半胱氨酸誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞環(huán)氧合酶-2表達(dá)的調(diào)控作用，證實(shí)黃腐酸可減弱同型半胱氨酸誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞環(huán)氧合酶-2對人體的影響，可減少患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)；Sanmanee N等[13]研究了黃腐酸對豬輸卵管上皮細(xì)胞（POEC）銅生物利用度的影響，結(jié)果表明：銅-黃腐酸（Cu-FA）在細(xì)胞內(nèi)的吸收明顯高于Cu2+的吸收，但對細(xì)胞的損傷作用比Cu2+要小，通過透射電子顯微鏡和光學(xué)研究及MINTEQA2的計(jì)算結(jié)果揭示，黃腐酸的親水親脂性質(zhì)有助于Cu-FA 和黃腐酸與細(xì)胞表面結(jié)合，說明黃腐酸對POEC 的活性表面有較強(qiáng)的影響，改善了Cu2+的毒性作用，顯示了黃腐酸對環(huán)境和動物健康的雙重作用；Leighann S 等[14]對碳水化合物衍生的黃腐酸（CHD-FA）作為一種潛在的治療口腔生物膜感染的藥理藥效進(jìn)行了探究，結(jié)果表明：CHD-FA 具有廣譜抗菌活性，并具有抑制炎癥的輔助作用；由圖1可以看出，CHDFA 抗菌效果明顯，但不如抗菌藥氯已定（CHX）的效果。

圖1 使用CHD-FA 與未使用的區(qū)別Fig.1The difference between using CHD-FA and not using it

體外培養(yǎng)條件和相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，可極大 地促進(jìn)黃腐酸離體實(shí)驗(yàn)的藥理研究。

2 黃腐酸的在體實(shí)驗(yàn)藥理研究進(jìn)展

在體實(shí)驗(yàn)是指在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)進(jìn)行的藥物作用觀察、藥理分析。實(shí)驗(yàn)動物包括正常動物、疾病病理模型動物。根據(jù)對實(shí)驗(yàn)動物的實(shí)驗(yàn)周期和用藥次數(shù)不同，又分為急性實(shí)驗(yàn)、慢性實(shí)驗(yàn)、壽命延長實(shí)驗(yàn)以及致畸致癌實(shí)驗(yàn)。

北京同仁醫(yī)院早期研究黃腐酸鈉對藥物性甲亢和甲低大鼠血漿環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的影響，結(jié)果表明：藥物性甲亢和甲低組大鼠，cAMP 呈顯著或中等度升高，注射黃腐酸鈉后，可在減輕甲亢或甲低癥狀；同時(shí)使血漿cAMP 水平顯著下降或使之正常，由此推斷黃腐酸鈉可能具有調(diào)節(jié)cAMP的作用，它在臨床所表現(xiàn)的多種藥理作用可能與其對cAMP 的影響有一定關(guān)系[15]。楊光燃等[16～18]開展對胰腺胰島素誘發(fā)的β-細(xì)胞的特點(diǎn)，建立糖尿病大鼠動物模型，得出黃腐酸鈉對實(shí)驗(yàn)性糖尿病周圍神經(jīng)病變有一定的抑制作用，其作用機(jī)制可能涉及代謝和血管兩個方面。何靜等[19]采用腹腔注射四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠造模，研究黃腐酸及黃腐酸鈉的降血糖作用，并對其降糖機(jī)制進(jìn)行初步探討，結(jié)果表明：黃腐酸及黃腐酸鈉明顯降低小鼠體內(nèi)血糖、總膽固醇、血清甘油三酯的含量，增加小鼠的口服糖耐量，得出黃腐酸及黃腐酸鈉具有降血糖及改善脂質(zhì)代謝作用。李月梅等[20]通過研究黃腐酸鈉對小鼠胃腸運(yùn)動及胃潰瘍的實(shí)驗(yàn)，得出黃腐酸鈉的急性毒性很小，具有止瀉、抗胃潰瘍、保護(hù)胃黏膜損傷的作用。Zhao Y等[21]以活體大鼠為模型，研究CHD-FA 是否可以作為增強(qiáng)傷口感染愈合的耐藥病原體外用制劑，結(jié)果表明：CHD-FA 是一種很有前景的耐藥傷口感染外用藥物，能加速大鼠身上感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐多藥銅綠假單胞菌傷口的愈合過程，這與其抗菌和抗炎特性是密切相關(guān)的。劉馳等[22]研究了黃腐酸鈉對大鼠腦缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果表明：黃腐酸鈉能明顯改善血腦屏障通透性，減輕腦水腫、白細(xì)胞的浸潤，降低缺血區(qū)腦組織中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量以及抑制核因子-κBp65（NF-κBp65）的活化，減輕腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)，對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

在體實(shí)驗(yàn)的對象主要為大鼠、小鼠、家兔、家貓、犬、獼猴等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，60%以上的藥理學(xué)研究是通過在體實(shí)驗(yàn)完成的。在體實(shí)驗(yàn)動物在抗應(yīng)激、調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌功能、促進(jìn)新陳代謝、延緩衰老等藥理研究中反應(yīng)明顯，可進(jìn)行急慢性藥效實(shí)驗(yàn)等。

3 案例分析

在查閱文獻(xiàn)的同時(shí)，華東理工大學(xué)針對不同的黃腐酸樣品，通過離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了藥理作用研究，見表1。從表中可知，“富里康-FA”具有利水滲濕、活血化瘀為主的功能，同時(shí)還具有保肝、抗腫瘤、抗白血病等藥理作用；“維媄玾”具有改善微循環(huán)的作用。“SXSJ-FA”樣品，通過對黃腐酸空間結(jié)構(gòu)的改變和衍生，獲得了離體腫瘤細(xì)胞抑制率高于90%的藥效，現(xiàn)正在形成發(fā)明專利。用表1中“富里康-FA”“維媄玾”“CQSFFAk”做腫瘤實(shí)驗(yàn)，對肺腫瘤細(xì)胞的抑制率也都在77%～85%之間。用酶標(biāo)儀測定其中6個黃腐酸樣品的超氧化物歧化酶（SOD）活性，由表2各藥理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，被測樣存在的SOD 活性可催化O2-與H+結(jié)合，生成O2和H2O2，阻止中間產(chǎn)物的積累，因此，具有抗氧自由基、增加免疫等作用[18，19]。針對廣西的1個黃腐酸樣品（GXAYFA）進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)研究，從圖2可以看出，白血病細(xì)胞的存活率與黃腐酸的濃度成反比；而從圖3可以看出，黃腐酸的降糖效果與黃腐酸的濃度成正比。黃腐酸的抗氧自由基、增加免疫等作用還可以發(fā)展跨越到草本類藥妝品、生物農(nóng)藥等前沿領(lǐng)域[20～22]。

云南聯(lián)合藥業(yè)有限責(zé)任公司、復(fù)旦大學(xué)、華東理工大學(xué)等聯(lián)合對黃腐酸進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)條件與評價(jià)指標(biāo)時(shí)，獲得黃腐酸多靶向在體的藥理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示范（表3），當(dāng)藥效（抑制率）超過30%，在醫(yī)學(xué)上要反復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)論證。

表1 黃腐酸的離體藥理實(shí)驗(yàn)分析一覽表Tab.1List of pharmacological experimental analysis of fulvic acid in vitro

表2 運(yùn)用試劑盒-酶標(biāo)儀法測得的黃腐酸SOD 活性Tab.2SOD activity of fulvic acid measured by the kit-enzyme labeling instrument

圖2 四唑鹽比色法（MTT）實(shí)驗(yàn)篩選GXAY-FA 抗白血病細(xì)胞存活條件Fig.2The survival conditions of GXAY-FA anti-leukemia cells by MTT screening

圖3 不同濃度GXAY-FA 的降糖效果Fig.3The hypoglycemic effect of GXAY-FA at different concentrations

表3 黃腐酸多靶向在體的藥理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示范Tab.3Demonstration of multi-target in vivo pharmacological experiment design of fulvic acid

4 展望

生命科學(xué)的發(fā)展從宏觀到微觀，藥理學(xué)的發(fā)展也由整體水平、器官水平、組織水平深入到細(xì)胞水平和分子水平。分子藥理學(xué)是分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能、闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)與傳統(tǒng)藥理學(xué)交叉的新學(xué)科。作為現(xiàn)在藥理學(xué)的主流，在受體、酶系統(tǒng)、離子通道、生物活性物質(zhì)等方面促進(jìn)藥理作用機(jī)制深入到分子水平，為新藥設(shè)計(jì)提供重要依據(jù)。黃腐酸的藥理研究也需從分子方面揭示機(jī)理。

DNA（脫氧核糖核酸）、RNA（核糖核酸）和蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)，在目的基因獲取、表達(dá)和打靶中都有具體的分子生物技術(shù)[23～28]。近藤友大[29]運(yùn)用分子生物學(xué)手段研究了日本的土壤腐植酸性質(zhì)；Yang H L 等[30]采用核小體間DNA斷裂等凋亡特征，研究了腐植酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)；張國剛等[31]在含黃腐酸的天津海底淤泥提取方法研究中，采用分子生物學(xué)DNA 鑒定方式，研究了黃腐酸的抗氧化作用機(jī)制；Orsoya P 等[32]研究了β-葡聚糖和富維酸（批號：210515-012，主要成分中黃腐酸占70%，推薦的劑量250g FA/1000L飲用水）等4種飲用水補(bǔ)充劑對豬腸道上皮細(xì)胞水平的影響，雖各處理都未改變cyp3a29的基因表達(dá)，但β-葡聚糖和富維酸促進(jìn)了內(nèi)毒素治療腸細(xì)胞中趨化因子il-8mrna 的生成；Hideko M 等[33]研究了黃腐酸（SS-FA，過剩污泥中所提取）對KU812細(xì)胞的印跡型過敏反應(yīng)的芯片分析，得出SS-FA影響參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、免疫應(yīng)答、細(xì)胞粘附分子等通道的基因表達(dá)。

當(dāng)前，國際試劑公司阿拉?。ˋladdin）、西格瑪（Sigma）、麥克林（MACKLIN）等都有具有CAS 登記號的黃腐酸，有的標(biāo)注黃腐酸含量≥90%，有的標(biāo)注分子量308.24、227.17；華東理工大學(xué)也測定出數(shù)均分子量500、1000左右的黃腐酸，也有拿到美國FDA 批號的黃腐酸，這為黃腐酸在醫(yī)學(xué)上作更多的離體實(shí)驗(yàn)、在體實(shí)驗(yàn)，甚至細(xì)胞水平、分子水平上的藥理研究減少了障礙。由此，將黃腐酸的生物醫(yī)學(xué)藥理跨越到獸藥、農(nóng)藥、功能食品的研究開發(fā)，其用途將更廣泛[34～47]。

致謝：本文的黃腐酸離體實(shí)驗(yàn)和部分在體實(shí)驗(yàn)的案例分析數(shù)據(jù)是在華東理工大學(xué)國家自然科學(xué)基金主持人劉建文教授所在的藥學(xué)院上海市新藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成的；除了論文標(biāo)注的作者單位，還對山東泉林嘉有現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司、庫車物泰炭素有限公司、上海臻衍生物科技有限公司、南京臻旸生物科技有限公司的制樣進(jìn)行了測試研究，在此一并表示誠摯的感謝！