安五脂素對D- 半乳糖致衰老小鼠心肌損傷的保護作用及機制研究

劉春娜，王 瑤，張羽翀，袁 瑞，張馨蕓，李 欣，陳建光，李 賀

(北華大學(xué)藥理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

作為機體重要的器官，心臟為機體提供充足血液，使機體各個細胞、器官組織維持正常代謝與生理功能。有研究報道，衰老或其他刺激會引起心臟的氧化損傷[1]，進而影響心臟的正常功能。自由基學(xué)說是衰老學(xué)說的主要學(xué)說之一，從抗氧化角度保護衰老機體的心臟功能是目前研究的熱點。安五脂素主要來源于華中五味子，是組成木脂素重要成分之一[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，五味子對衰老小鼠的腦和肝臟具有一定的保護作用[3]，但安五脂素對心臟的保護作用尚無研究。因此，本研究報道安五脂素對D- 半乳糖所致衰老小鼠心臟氧化指標(biāo)的影響及相關(guān)機制，為開發(fā)抗衰老的藥物及保健品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安五脂素(純度≥98%)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；羧甲基纖維素鈉(分析純)購自山東濰坊力特復(fù)合材料有限公司；D- 半乳糖購自美國Sigma試劑有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；PVDF膜購自Amersham Hybond公司；過硫酸銨購自Sigma公司；吐溫- 20(分析純)購自天津永大試劑公司；10%SDS購自Sigma公司；脫脂奶粉購自美國BD公司；Tris、Glgcine購自Gentihold公司；甲醇(分析純)購自天津市匯杭化工科技有限公司；NaCl(分析純)購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；Nrf2、血紅素氧合酶1(HO- 1)抗體，兔原二抗購自ABolonal公司；RIPA裂解液和BCA試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；臺式低速離心機購自eppendorf公司；全自動酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司；蛋白質(zhì)電泳槽購自美國BIO RAD公司；pH計購自METTLER TOLEDO公司；顯影儀購自SAGECREATION公司。

1.2 動物分組及給藥

清潔級健康ICR雄性小白鼠50只，體重(20±2)g，由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。小鼠采取分籠飼養(yǎng)，且維持12 h∶12 h晝夜循環(huán)，飼料供給充足，自由飲水。

將小鼠隨機分為5組，每組10只?？瞻讓φ战M(CON)：每天灌胃羧甲基纖維素鈉溶液及頸后皮下注射生理鹽水；D- gal模型組(D- gal)：每天灌胃羧甲基纖維素鈉溶液及頸后皮下注射D- 半乳糖(300 mg/kg)；安五脂素低劑量組(AN- L)：每天灌胃安五脂素，皮下注射D- 半乳糖(五脂素1 mg/kg，D- 半乳糖300 mg/kg)，安五脂素中劑量組(AN- M)：每天安五脂素灌胃，皮下注射D- 半乳糖(安五脂素2 mg/kg，D- 半乳糖300 mg/kg)，安五脂素高劑量組(AN- H)：每天安五脂素灌胃，皮下注射D- 半乳糖(五脂素4 mg/kg，D- 半乳糖300 mg/kg)。

1.3 測定方法

小鼠飼養(yǎng)實驗結(jié)束后，脫頸處死小鼠，取部分心臟組織加入9倍預(yù)冷的生理鹽水制備10%的心臟組織勻漿，以1200 r/min離心10 min后取上清液，按照試劑盒說明書檢測心臟組織的SOD活性及MDA含量。進行蛋白提取，SDS- PAGE電泳，洗膜轉(zhuǎn)膜及封閉。按需求加入Nrf2抗體(1∶1000)，HO- 1抗體(1∶1000)，GAPDH抗體(1∶50 000)，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min。再加入GAPDH第二抗體(1∶50 000)，室溫搖床雜交1 h后，洗膜3次，每次10 min。最后在PVDF膜上加入ECL顯影液，用顯影儀進行成像，用Image J軟件對蛋白印跡條帶進行處理和分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 安五脂素對D- 半乳糖致衰老小鼠心臟SOD活性的影響

由圖1可知，與CON組比較，D- gal模型組小鼠心臟SOD活性顯著降低(P<0.01)，與D- gal衰老模型組相比，安五脂素低劑量組小鼠心臟組織SOD活性升高不明顯(P>0.05)，安五脂素中、高劑量組小鼠心臟組織SOD活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

2.2 安五脂素對D- 半乳糖致衰老小鼠心臟MDA含量的影響

由圖2可知，與CON組比較，D- gal模型組MDA含量顯著升高(P<0.01)，而安五脂素中、高劑量組小鼠心臟組織MDA的含量下降(P<0.05或P<0.01)，安五脂素高劑量組MDA含量高于空白對照組MDA含量。但安五脂素低劑量組D- gal模型組比無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 安五脂素對D- 半乳糖致衰老小鼠心臟Nrf2及HO- 1蛋白表達影響檢測

由圖3可知，與CON組比較，D- gal模型組Nrf2含量無顯著性差異(P>0.05);與D- gal衰老模型組相比，安五脂素高劑量組小鼠心臟組織Nrf2含量顯著升高(P<0.01)；與CON組比較，D- gal模型組HO- 1含量升高(P<0.05)，而安五脂素高劑量組小鼠心臟組織HO- 1含量明顯下降(P<0.05)。

3 討 論

D- 半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型是基于衰老自由基及代謝理論[4]，已經(jīng)被廣泛接受。機體在一段時間內(nèi)大量注射D- 半乳糖，產(chǎn)生大量自由基，超出機體清除能力，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，進一步導(dǎo)致機體器官代謝紊亂，功能障礙等，最終導(dǎo)致機體衰老[5]。本研究前期工作顯示，連續(xù)皮下注射D- 半乳糖7周，可以成功建立小鼠的亞急性衰老模型。本研究應(yīng)用該模型[6]觀察了安五脂素對該模型小鼠心臟氧化指標(biāo)的影響。機體過量活性氧(ROS)可使脂質(zhì)過氧化[7]，最終氧化產(chǎn)物為MDA。因而，MDA含量可直接反應(yīng)機體脂質(zhì)過氧化水平，間接反應(yīng)由于過量的ROS引起細胞損傷程度。SOD是機體重要的抗氧化劑之一[8]，是機體內(nèi)清除自由基的關(guān)鍵酶類，使機體老化程度得以緩解。

本研究結(jié)果顯示，與D- gal衰老模型組相比，安五脂素中、高劑量給藥組小鼠心臟組織的SOD活性均有不同程度升高，提示安五脂素具有升高SOD活性，增加心臟抗氧化能力的作用。MDA檢測結(jié)果顯示，與D- gal模型組比，安五脂素中、高劑量給藥組小鼠心臟組織MDA含量顯著降低，提示安五脂素降低了心臟的氧化損傷。

Nrf2是調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激損傷一重要轉(zhuǎn)錄因子[9]，當(dāng)存在氧化應(yīng)激損傷時，Nrf2進行核移位，快速進入細胞核中[10- 11]，與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)相結(jié)合，從而激活Nrf2調(diào)控的相關(guān)抗氧化酶基因的表達，如激活HO- 1表達，抑制氧化應(yīng)激作用。HO- 1是Nrf2依賴性基因，有消除ROS作用[12]，本研究結(jié)果顯示，安五脂素能夠上調(diào)心臟組織中Nrf2及HO- 1蛋白表達，進而發(fā)揮抗氧化作用。

本研究選用低、中、高3個劑量觀察安五脂素的相關(guān)功能及機制。研究結(jié)果顯示，與模型組比較，安五脂素中、高劑量組小鼠心臟組織SOD活力及MDA含量及Nrf2、HO- 1的表達有統(tǒng)計學(xué)差異，而低劑量組未見差異。提示安五脂素對D- 半乳糖所致衰老小鼠心臟氧化指標(biāo)的影響可能具有劑量依賴性，其具體的劑量效應(yīng)關(guān)系尚待進一步研究。

綜上所述，安五脂素能夠升高D- 半乳糖所致衰老小鼠心臟組織中SOD活力，降低MDA含量，該作用與其上調(diào)Nrf2及HO- 1蛋白有關(guān)。