射干苷元衍生物的制備及其體外抗腫瘤活性研究

陳 帥，袁崇均，羅 森，余夢瑤，王 笳

四川省中醫(yī)藥科學院，成都 610041

川射干為鳶尾科植物鳶尾(IristectorumMaxim.)的干燥根莖，具有清熱解毒、祛痰、利咽之功效，用于熱毒痰火郁結證，如咽喉腫痛、痰濁壅盛、咳嗽氣喘者[1]，其主要藥效成分為異黃酮類物質[2,3]，而射干苷元就是其中的主要有效成分。射干苷元又名鳶尾黃素，5，7，4′- 三羥基- 6- 甲氧基異黃酮，現(xiàn)代研究表明射干苷元具有C6- C3- C6母核結構，也有α、β核不飽和吡喃酮以及C7- OH、C4′- OH等活性中心存在，具有清除自由基、抗脂質過氧化損傷和降低血糖，防止動脈粥樣硬化以及防止血管內(nèi)皮細胞損傷作用，亦有對心肌梗死小鼠心臟有保護作用，還有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、雌激素類作用等[4- 7]。本研究基于射干苷元的抗腫瘤作用，以射干苷元為先導化合物[8]，經(jīng)過結構修飾、改造得到其衍生物射干苷元- 5′- 磺酸鈉、4′，7- 二甲基射干苷元、4′，7- 二甲基射干苷元- 5′- 磺酸鈉、4′，7- 二乙基射干苷元、4′，7- 二乙基射干苷元- 5′- 磺酸鈉，并采用MTT法，考察其衍生物對HCT116、A549、HepG2細胞體外增值的影響[9,10]，初步探討其藥理活性，以期開發(fā)新型抗腫瘤的單體成分藥物。

1 儀器與試藥

1.1 藥品

射干苷元，陜西綠清生物工程有限公司，含量：98.86%，批號：20160502；射干苷元- 5′- 磺酸鈉、4′，7- 二甲基射干苷元、4′，7- 二甲基射干苷元- 5′- 磺酸鈉、4′，7- 二乙基射干苷元、4′，7- 二乙基射干苷元- 5′- 磺酸鈉，含量均≥98%，批號分別為：20160403、20160501、20160503、20160601、20160702，試驗前用生理鹽水配制成所需濃度的液體備用。

1.2 細胞

人結腸癌細胞株HCT116、人肺癌細胞株A549、人肝癌細胞株HepG2均購自中國科學院細胞保存庫。

1.3 主要試劑

氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、濃硫酸、氯化鈉，成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)，分析純，批號分別為2015120401、2015010111、2015010201、2015070304、2015080912、2015120304、2015020301；高糖DMEM，美國GibcoBRL；MTT，乙二胺四乙酸，美國Sigma。

1.4 實驗儀器

液質聯(lián)用儀，型號為RRLC- 6410，美國Agilent；核磁共振波譜儀，型號為AVⅡ，德國Bruker；紫外分光光度儀，型號為UV- 2401PC，日本Shimadzu；紅外檢測儀，型號為FTIR8300，日本Shimadzu公司；微機熔點測定儀，型號為WRS- 2，上海易測儀器設備有限公司；電子天平型號為CPA225D，德國賽多利斯；超純水系統(tǒng)，美國Millipore；CO2培養(yǎng)箱，型號為MCO- 15AC，日本三洋；細胞培養(yǎng)瓶和96孔細胞培養(yǎng)板，美國Corning；酶聯(lián)免疫檢測儀，美國Thermo Fisher；微量移液器，法國GILSON。

2 方法與結果

2.1 化合物的制備

2.1.1 化合物1的制備

取射干苷元500 g，加2 000 mL濃硫酸，攪拌溶解，反應2 h，傾入20 L NaCl飽和溶液中，邊加邊攪拌，析出沉淀，放置過夜，過濾，沉淀用水煮沸溶解，趁熱過濾，放置，析晶，過濾，重結晶一次，過濾，60 ℃減壓干燥，得化合物1(600 g，含量>98%，收率為89.55%)(見圖1)。

2.1.2 化合物2的制備

取射干苷元200 g，加NaOH40 g，混勻，加95%乙醇600 mL于4 L圓底燒瓶中，于水浴中加熱沸騰5分鐘，再加400 mL硫酸二甲酯，反應半小時，取出，立即用鹽酸調pH至2～5，加水攪拌放冷。過濾，得淡黃色粉末，用95%乙醇攪拌均勻，過濾，反復洗滌至濾出液近無色，60 ℃減壓干燥，得化合物2(170 g，含量>98%，收率77.74%)。

2.1.3 化合物3的制備

取化合物1100 g，加NaOH20 g，混勻，加95%乙醇300 mL于2 L圓底燒瓶中，于水浴中加熱沸騰5分鐘，再加200 mL硫酸二甲酯，反應半小時，取出，立即用鹽酸調pH至2～5，加水攪拌放冷。過濾，得淡黃色粉末，用95%乙醇攪拌均勻，過濾，反復洗滌至濾出液近無色，60 ℃減壓干燥，得化合物3(84 g，含量>98%，收率78.53%)。

或者取化合物2100 g，加400 mL濃硫酸，攪拌溶解，反應2小時，傾入4 L NaCl飽和溶液中，邊加邊攪拌，析出沉淀，放置過夜，過濾，沉淀用水煮沸溶解，趁熱過濾，放置，析晶，過濾，重結晶一次，過濾，60 ℃減壓干燥，得化合物3(97 g，含量>98%，收率90.68%)。

2.1.4 化合物4的制備

取射干苷元200 g，加NaOH 40 g，混勻，加95%乙醇600 mL于4 L圓底燒瓶中，于水浴中加熱沸騰5分鐘，再加400 mL硫酸二乙酯，反應半小時，取出，立即用鹽酸調pH至2～5，加水攪拌放冷。過濾，得淡黃色粉末，用95%乙醇攪拌均勻，過濾，反復洗滌至濾出液近無色，60 ℃減壓干燥，得化合物4(182 g，含量>98%，收率76.69%)。

2.1.4 化合物5的制備

取化合物1100 g，加NaOH 20 g，混勻，加95%乙醇300 mL于2 L圓底燒瓶中，于水浴中加熱沸騰5分鐘，再加200 mL硫酸二乙酯，反應半小時，取出，立即用鹽酸調pH至2～5，加水攪拌放冷。過濾，得淡黃色粉末，用95%乙醇攪拌均勻，過濾，反復洗滌至濾出液近無色，60 ℃減壓干燥，得化合物5(88 g，含量>98%，收率77.24%)。

或者取化合物4100 g，加400 mL濃硫酸，攪拌溶解，反應2小時，傾入4 L NaCl飽和溶液中，邊加邊攪拌，析出沉淀，放置過夜，過濾，沉淀用水煮沸溶解，趁熱過濾，放置，析晶，過濾，重結晶一次，過濾，60 ℃減壓干燥，得化合物5(115 g，含量>98%，收率89.39%)。

2.2 化合物的鑒定

化合物1淡黃色針晶(H2O)，HCl- Mg反應陰性，AlCl3顯色呈淡黃色；mp.166～168 ℃;UV(EtOH)λmax:264 nm；IR(KBr)νmax3 465，1 654，1 652，1 575，1 494，1 465，1 278，1 165，1 070 cm-1；ESI- MS：m/z425 [M+Na]+；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.84(1H，s，5- OH)，7.88(1H，s，H- 2)，7.74(1H，d，J= 2.0 Hz，H- 6′)，7.25(1H，dd，J= 2.0，8.5 Hz，H- 2′)，6.94(1H，d，J= 8.5 Hz，H- 3′)，6.21(1H，s，H- 8)，3.70(3H，s，6- OCH3)，1.31(3H，t，4′- CH3)，1.14(3H，t，7- CH3)；上述理化性質和光譜數(shù)據(jù)與文獻[11]報道一致，確定此化合物為射干苷元- 5′- 磺酸鈉。

化合物2淡黃色結晶性粉末(EtOH)，HCl- Mg反應陰性，AlCl3顯色呈淡黃色；mp.164～167 ℃；UV(EtOH)λmax:268 nm；IR(KBr)νmax3 462，1 653，1 609，1 572，1 469，1 298，1 188，1 068 cm-1；ESI- MS：m/z329 [M+H]+；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.84(1H，s，5- OH)，7.76(1H，s，H- 2)，7.43(2H，d，J= 8.5 Hz，H- 2′，H- 6′)，6.93(2H，d，J= 8.5 Hz，H- 3′，H- 5′)，6.52(1H，s，H- 8)，3.92(3H，s，6- OCH3)，3.83(3H，s，7- OCH3)，3.81(3H，s，4′- OCH3)；上述理化性質和光譜數(shù)據(jù)與文獻[12,13]報道一致，確定此化合物為4′，7- 二甲基射干苷元。

化合物3淡黃色針晶(H2O)，HCl- Mg反應陰性，AlCl3顯色呈淡黃色；mp.166～169 ℃；UV(EtOH)λmax:264 nm；IR(KBr)νmax3 445，1 654，1 608，1 587，1 490，1 465，1 280， 1 181，1 084，1 025 cm-1；ESI- MS：m/z453 [M+Na]+；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.88(1H，s，5- OH)，7.96(1H，s，H- 2)，7.84(1H，d，J= 2.0 Hz，H- 6′)，7.46(1H，dd，J= 2.0，8.5 Hz，H- 2′)，6.98(1H，d，J= 8.5 Hz，H- 3′)，6.45(1H，s，H- 8)，3.94(3H，s，7- OCH3)，3.82(3H，s，4′- OCH3)，3.72(3H，s，6- OCH3)；上述理化性質和光譜數(shù)據(jù)與文獻[13]報道一致，確定此化合物為4′，7- 二甲基射干苷元- 5′- 磺酸鈉。

化合物4淡黃色結晶性粉末(EtOH)，HCl- Mg反應陰性，AlCl3顯色呈淡黃色；mp.163～166 ℃；UV(EtOH)λmax:268 nm；IR(KBr)νmax3 465，1 654，1 608，1 577，1 490，1 465，1 290，1 180，1 074 cm-1;ESI- MS：m/z357 [M+H]+；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.80(1H，s，5- OH)，7.86(1H，s，H- 2)，7.43(2H，d，J= 8.5 Hz，H- 2′，H- 6′)，6.95(2H，d，J= 8.5 Hz，H- 3′，H- 5′)，6.43(1H，s，H- 8)，4.15(2H，q，4′- OCH2- )，4.06(2H， q，7- OCH2- )，3.90(3H，s，6- OCH3)，1.51(3H，t，4′- CH3)，1.43(3H，t，7- CH3)；13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：180.8(C- 4)，158.9(C- 4′)，158.1(C- 7)，153.3(C- 9)，153.2(C- 5)，152.6(C- 2)，132.4(C- 6)，129.8(C- 2′，6′)，122.9(C- 1′)，122.5(C- 3)，114.3(C- 3′，5′)，106.3(C- 10)，90.8(C- 8)，64.6(4′- OCH2- )，63.3(7- OCH2- )，60.5(6- OCH3)，14.6(4′- CH3)，14.4(7- CH3)；上述理化性質和光譜數(shù)據(jù)與文獻[14,15]報道一致，確定此化合物為4′，7- 二乙基射干苷元。

化合物5淡黃色針晶(H2O)，HCl- Mg反應陰性，AlCl3顯色呈淡黃色；mp.166～168 ℃;UV(EtOH)λmax:264 nm；IR(KBr)νmax3 475，1 658，1 602，1 579，1 498，1 467，1 265，1 174，1 052 cm-1；ESI- MS：m/z481 [M+Na]+，459，437，330，318，274，245，138，可確認該化合物為C20H19SO9Na，不飽和度為11；比較化合物4和化合物5的核磁數(shù)據(jù)，兩者基本一致，僅前者B環(huán)1H NMR譜上有4個芳氫質子信號，H- 2′和H- 3′互為鄰位耦合，H- 5′和H- 6′互為鄰位耦合；而后者B環(huán)上僅有3個芳氫質子信號，說明有一芳氫質子被磺酸鈉基所取代；13C NMR譜顯示化合物2為20個碳原子，和前者比較，僅少了1個δC114.3，取而代之的是δC130.4，結果與1H NMR譜相印證，由于苯酚磺化反應在室溫進行(20～25 ℃)，只能得到鄰位產(chǎn)物，故取代發(fā)生在C- 3′或C- 5′上，δH7.74、δH7.25互為間位耦合，δH7.25、δH6.95互為鄰位耦合，證實δH7.74為H- 6′，δH7.25為H- 2′，δH6.95為H- 3′，確定取代發(fā)生在C- 5′上，由此確定了化合物5為4′，7- 二乙基射干苷元- 5′- 磺酸鈉，確認為新化合物，結構未見文獻報道。具體表征如下，1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.82(1H，s，5- OH)，7.83(1H，s，H- 2)，7.74(1H，d，J= 2.0 Hz，H- 6′)，7.25(1H，dd，J= 2.0，8.5 Hz，H- 2′)，6.95(1H，d，J= 8.5 Hz，H- 3′)，6.17(1H，s，H- 8)，4.08(2H，q，4′- OCH2- )，3.72(2H，q，7- OCH2- )，3.57(3H，s，6- OCH3)，1.31(3H，t，4′- CH3)，1.14(3H，t，7- CH3)；13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：180.7(C- 4)，154.5(C- 7)，154.2(C- 4′)，153.4(C- 2)，152.7(C- 9)，152.4(C- 5)，133.5(C- 2′)，132.1(C- 6)，130.4(C- 5′)，125.6(C- 1′)，123.4(C- 3)，120.5(C- 6′)，115.3(C- 3′)，106.3(C- 10)，90.9(C- 8)，64.8(7- OCH2- )，64.3(4′- OCH2- )，60.7(6- OCH3)，14.8(7- CH3)，14.6(4′- CH3)。

2.3 化合物的化學結構和合成路線

圖1 化合物的化學結構和合成路線Fig.1 Chemical structures and synthetic route of compounds注：a：依次加入濃硫酸和飽和氯化鈉溶液進行磺酸化反應，收率89.55%；b：依次加入氫氧化鈉，乙醇和硫酸二甲酯進行甲酯化反應，收率77.74%；c：依次加入氫氧化鈉，乙醇和硫酸二甲酯進行甲酯化反應，收率78.53%；d：依次加入濃硫酸和飽和氯化鈉溶液進行磺酸化反應，收率90.68%；e：依次加入氫氧化鈉，乙醇和硫酸二乙酯進行乙酯化反應，收率76.69%；f：依次加入氫氧化鈉，乙醇和硫酸二乙酯進行乙酯化反應，收率77.24%；g：依次加入濃硫酸和飽和氯化鈉溶液進行磺酸化反應，收率89.39%。Note:a:H2SO4 and NaCl solution were added in turn to carry out the sulfonation reactioion,and the yield was 89.55%;b:NaOH,EtOH and DMS were added in turn to carry out the methyl reactioion,and the yield was 77.74%; c:NaOH,EtOH and DMS were added in turn to carry out the methyl reactioion,and the yield was 78.53%.d:H2SO4 and NaCl solution were added in turn to carry out the sulfonation reactioion,and the yield was 90.68%;e:NaOH,EtOH and DES were added in turn for ethyl reaction,the yield was 76.69%;f:NaOH,EtOH and DES were added in turn for ethyl reaction,the yield was 77.24%;g:H2SO4 and NaCl solution were added in turn to carry out the sulfonation reactioion,and the yield was 89.39%.

2.4 化合物對HCT116、A549、HepG2細胞株體外增殖的影響

2.4.1 細胞培養(yǎng)

分別取HCT116、A549、HepG2細胞株以含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。每隔2～3天，以0.05%胰蛋白酶- 0.53 mmol/L EDTA消化傳代。

2.4.2 分組給藥及檢測

分別取對數(shù)生長期的HCT116、A549、HepG2細胞，用胰酶消化，吹散，制備細胞混懸液，顯微計數(shù)，調整細胞濃度，按6×103個/孔接種到96孔板，在37 ℃培養(yǎng)過夜。設置藥物組(化合物1～5濃度為320、160、80、40、20、10、5 μM的系列溶液)，空白對照組(只加培養(yǎng)基)和射干苷元陽性藥對照組(濃度為320、160、80、40、20、10、5 μM的系列溶液)，在96孔板中分別加入適宜濃度的各組樣品，每個濃度做3個重復，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，試驗結束前4 h，將96孔板里的培養(yǎng)液吸出，加入100 μL PBS緩沖液和10 μL 5 mg/mL MTT溶液，37℃孵育4 h，加100 μL 10%SDS溶液(0.01 MHCl配制)，37 ℃孵育過夜，測定OD570，計算各樣品濃度的抑制率(抑制率=(空白組OD- 試驗組OD)/空白組OD×100%)，采用Curve Expert計算IC50。

表1 射干苷元及其衍生物體外抗腫瘤活性結果(n=3)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

化合物CompoundIC50(μM)HCT116A549HepG24133.72±3.53108.25±4.3673.44±2.03524.71±1.8157.68±3.6332.42±1.96射干苷元Tectorigenin198.06±4.53202.50±3.35258.80±5.47

由表1可知，射干苷元及其衍生物對HCT116、A549、HepG2細胞株體外增殖有一定的抑制作用；各化合物組對HCT116、A549、HepG2細胞株的抑制明顯強于射干苷元陽性藥對照組，其中化合物3對A549的IC50為33.67 μM，化合物5對HCT116和HepG2細胞的IC50分別為24.71和32.42 μM，證明其有良好的抗腫瘤活性，從而證實了結構改造的可行性和必要性。

3 討論

從天然植物中尋找安全、高效的抗腫瘤藥物，是開發(fā)抗腫瘤藥物的重要途徑。藥用植物是一個巨大的寶庫，對發(fā)掘新的抗腫瘤藥物有著得天獨厚的優(yōu)勢，特別是四川，有著“中醫(yī)之鄉(xiāng)，中藥之庫”的美譽，川射干作為川產(chǎn)道地藥材，野生資源豐富，采收炮制簡單，提取加工方便，黃酮成分含量高，并具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等諸多藥理活性。本研究基川射干中主要成分射干苷元的抗腫瘤作用，以射干苷元為母體合成一系列化合物，并考察化合物對HCT116、A549、HepG2細胞株體外增殖的影響。結果證實，射干苷元及其衍生物均具有一定的抗腫瘤作用，特別是化合物3對于A549細胞株有良好的抑制活性，化合物5對于HCT116和HepG2細胞株有良好的抑制活性，可作為潛在抗腫瘤化合物繼續(xù)研發(fā)，下一步將深入研究射干苷元及其衍生物的結構與活性關系，探討其抗腫瘤機制，闡述其構效關系。