黃芪- 蒼術(shù)改善糖尿病腎病糖脂代謝的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

王 鑫，吳巧敏，黃超穎，王箴儀，施 敏，周逸鈞，張美芳，陳潔文

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，上海201900

流行病學(xué)調(diào)查顯示，2013年中國18歲以上成年人的糖尿病患病率為10.4%，患病人數(shù)位居全球首位[1]。糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一[2]，近年來我國DKD的患病率也呈增長趨勢。DKD早期發(fā)病隱匿，難以及時發(fā)現(xiàn)，發(fā)展至臨床后期通常難以逆轉(zhuǎn)，最終需接受透析或腎移植治療，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，因此對DKD進(jìn)行早期干預(yù)治療具有重要意義[3]。但DKD的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，研究認(rèn)為其可能與高血糖引起的氧化應(yīng)激、糖脂代謝紊亂、細(xì)胞因子表達(dá)異常、腎組織炎癥反應(yīng)增加、腎臟血流動力學(xué)變化等有關(guān)[4,5]。DKD臨床診斷為：糖尿病引起的慢性腎臟病，主要包括腎小球?yàn)V過率(GFR)低于60 mL/min/1.73 m2或尿白蛋白/肌酐比值(ACR)高于30 mg/g持續(xù)超過3個月[6]。西醫(yī)治療DKD主要關(guān)注控制血糖、血壓、血脂、改善尿蛋白等方面，但這并不能完全阻斷DKD的發(fā)生發(fā)展。

中醫(yī)認(rèn)為DKD屬于“消渴”、“水腫”、“虛勞”等范疇，臨床證型為脾腎兩虛、濕瘀互阻型[7]。近年來，中醫(yī)藥在防治DKD發(fā)生發(fā)展、延緩腎功能等方面顯示出較大的優(yōu)勢。中藥具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、降脂降糖等多種藥理學(xué)特性。黃芪及其成分改善腎臟疾病的機(jī)制可能是通過抗過氧化作用、調(diào)節(jié)內(nèi)皮素、改善血小板功能、調(diào)節(jié)糖代謝。研究表明，黃芪通過下調(diào)腎組織脂聯(lián)素表達(dá)降低糖尿病腎病大鼠血糖和減少尿蛋白[8]。黃芪甲苷可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及影響TGF-β/SMADS信號通路發(fā)揮改善糖尿病腎病作用[9]。蒼術(shù)具有抑制糖原生成、抗缺氧、抗炎、調(diào)節(jié)糖脂代謝等作用[10]。研究表明，蒼術(shù)多糖對STZ誘導(dǎo)大鼠的血糖、血脂具有調(diào)節(jié)作用，主要通過抑制糖類消化酶活性，降低腸道糖類吸收[11]。研究發(fā)現(xiàn)，芪術(shù)顆粒(主要成分為黃芪、蒼術(shù))可通過回調(diào)DKD糖代謝、脂代謝及氨基酸代謝等過程中的代謝中間產(chǎn)物顯著改善DKD糖脂代謝紊亂、尿蛋白水平，保護(hù)腎臟功能，延緩病情進(jìn)展[12,13]。鑒于中藥具有多成分、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，目前黃芪- 蒼術(shù)改善DKD糖脂代謝的分子作用機(jī)制尚未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)是由英國藥理學(xué)家Hopkins在2007年提出，基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，運(yùn)用各種組學(xué)、高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)分析等技術(shù)揭示“藥物- 靶點(diǎn)- 疾病”間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，打破既往單成分- 單靶點(diǎn)- 單疾病的研究模式，對預(yù)測中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制具有重要意義[14]。因此，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)出發(fā)，對黃芪- 蒼術(shù)改善糖尿病腎病糖脂代謝的有效成分、作用靶點(diǎn)及信號通路進(jìn)行探索，根據(jù)GO和KEGG信號通路富集分析其潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 黃芪- 蒼術(shù)活性成分篩選

以黃芪、蒼術(shù)作為研究對象，依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)分別篩選出與黃芪、蒼術(shù)相關(guān)的所有化學(xué)成分，排除其中相同的化學(xué)成分[15]?？诜锢枚?oral bioavailability，OB)是藥物吸收、分布、代謝、排泄中最重要的藥動學(xué)參數(shù)之一，表示口服藥物的有效活性成分被吸收后到達(dá)體循環(huán)的速度和程度。OB值表示活性成分的類藥性(drug- likeness，DL)，值越高表明類藥性越好。參考文獻(xiàn)報道，根據(jù)藥代動力學(xué)參數(shù)確定以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為化合物有效活性成分的篩選條件[16]。

1.2 黃芪- 蒼術(shù)活性成分靶點(diǎn)預(yù)測及構(gòu)建“活性成分- 靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

根據(jù)TCMSP平臺篩選出的化學(xué)成分，以及候選化學(xué)成分的蛋白質(zhì)潛在靶點(diǎn)。用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)中的Uniprot KB搜索功能，輸入靶點(diǎn)名稱并設(shè)定物種為人，將檢索到的所有蛋白靶點(diǎn)得到相應(yīng)的基因名稱(official symbol)[17]。再采用網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape 3.6.1(http://www.cytoscape.org/)構(gòu)建“活性成分- 靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(node)表示活性成分和基因靶點(diǎn)。若某一活性成分作用于該靶點(diǎn)，則以邊(edge)相連。

1.3 糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)檢索

本研究通過將“diabetic nephropathy”、“nephropathy，diabetic”、“diabetic kidney disease”作為檢索詞在人類基因組數(shù)據(jù)庫GeneCards(http://www.genecards.org/)、TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、OMIM(http://www.omim.org/)等公認(rèn)的疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲得目前已報道的與DKD相關(guān)的靶點(diǎn)。將藥物活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集。

1.4 蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖及藥物活性成分- 靶點(diǎn)- 疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

運(yùn)用STRING(https://string- db.org/)和Metascape(http://metascape.org/)數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入上述取交集的靶點(diǎn)，設(shè)定物種為人，進(jìn)行蛋白相互作用分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系(protein- protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 Pathway富集分析

通過DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)富集分析上述獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)，人種設(shè)定為人，富集分析GO(gene ontology)生物學(xué)過程(生物過程、分子功能、細(xì)胞組成)和KEGG(KEGG pathway analysis)信號通路，總結(jié)研究黃芪- 蒼術(shù)改善糖尿病腎病糖脂代謝相關(guān)信號通路。

2 結(jié)果

2.1 篩選黃芪- 蒼術(shù)的有效活性成分

截至2019年4月，通過查找中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)，共收集到黃芪的化學(xué)成分87種，蒼術(shù)的化學(xué)成分49種，匯總?cè)サ糁貜?fù)化學(xué)成分，共有136種，其中同時滿足OB≥30%和DL≥0.18的化學(xué)成分共有29個(見表1)。

表1 黃芪和蒼術(shù)的有效活性成分

2.2 黃芪- 蒼術(shù)作用靶點(diǎn)預(yù)測及“活性成分- 靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出黃芪活性成分的潛在靶點(diǎn)446個，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后剩余213個；篩選出蒼術(shù)活性成分的潛在靶點(diǎn)66個，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后剩余57個。兩者匯總刪除重復(fù)后剩余218個靶點(diǎn)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分- 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(如圖1)，該網(wǎng)絡(luò)中有506條邊，代表活性成分和靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，有9個化合物無對應(yīng)靶點(diǎn)。其中，槲皮素(quercetin)有最多的潛在靶點(diǎn)共154個，其次為山奈酚(kaempferol)有63個潛在靶點(diǎn)。其它如漢黃芩素(wogonin)、異鼠李素(isorhamnetin)、常春藤皂甙元(hederagenin)、芒柄花素(formononetin)對應(yīng)靶點(diǎn)也較多，分別為22、37、24、15個。

圖1 黃芪和蒼術(shù)有效活性成分- 靶點(diǎn)圖Fig.1 Active component- target network between S.membranaceus and A.lancea注：圓圈：靶基因；菱形：化合物。Note:Circle:target gene;Diamond:compound.

2.3 DKD相關(guān)潛在靶點(diǎn)預(yù)測

通過檢索TCMSP、Drugbank、TTD、OMIM、GeneCards等數(shù)據(jù)庫，共獲得目前與DKD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的靶點(diǎn)基因1 412個，將其與活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)取交集，共得到97個靶點(diǎn)。表明這97個靶點(diǎn)可能是黃芪- 蒼術(shù)治療DKD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.4 黃芪和蒼術(shù)活性成分對應(yīng)潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

根據(jù)STRING和Metascape分析得出，黃芪和蒼術(shù)活性成分對應(yīng)潛在靶點(diǎn)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)圖主要為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGFB1)、表皮生長因子(EGFR)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP3)等相互作用(如圖2和圖3)。

圖2 黃芪和蒼術(shù)活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(STRING數(shù)據(jù)庫)Fig.2 PPI network of target proteins in S.membranaceus and A.lancea from STRING database

圖3 黃芪和蒼術(shù)活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(Metascape數(shù)據(jù)庫)Fig.3 PPI network of target proteins in S.membranaceus and A.lancea from Metascape database

2.5 黃芪- 蒼術(shù)改善DKD糖脂代謝信號通路富集分析

運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫，對上述黃芪和蒼術(shù)活性成分對應(yīng)的97個基因靶點(diǎn)進(jìn)行分析，GO功能分析得到1 220個條目，其中1 069個具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中生物過程(BP)條目944個，主要涉及細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、凋亡、程序性細(xì)胞死亡、對內(nèi)源性刺激的反應(yīng)、分子功能的正向調(diào)節(jié)、對類固醇激素刺激的反應(yīng)等生物學(xué)過程；分子功能(CC)條目60個，主要涉及細(xì)胞外空間、胞質(zhì)、膜筏等；細(xì)胞組成(MF)65個，主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)二聚化活性、類固醇激素受體活性、細(xì)胞因子活性、配體依賴性核受體活性、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性等方面，見圖4。

KEGG富集分析篩選到58條通路，其中55條具有顯著意義(P<0.05)，其中有關(guān)糖脂代謝通路有11條，主要涉及mTOR信號通路、胰島素信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路、Jak- STAT信號通路、糖尿病信號通路等(見圖5)。

圖4 黃芪- 蒼術(shù)治療DKD潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)功能分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential target of S.membranaceus and A.lancea for the treatment of diabetic kidney disease注：A:生物過程；B：細(xì)胞組分；C：分子功能。Note:A：biological process;B：cellular component;C:molecular function.

圖5 黃芪- 蒼術(shù)改善DKD糖脂代謝相關(guān)信號通路的KEGG分析Fig.5 KEGG analysis of potential target of S.membranaceus and A.lanceafor the treatment of glucose and lipid metabolism in diabetic kidney disease

3 討論

本次研究的目的是，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析黃芪- 蒼術(shù)改善糖尿病腎病糖脂代謝的有效活性成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號通路，探討其中可能的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪- 蒼術(shù)可能是通過mTOR信號通路、胰島素信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路、Jak- STAT信號通路、糖尿病信號通路等多條信號通路發(fā)揮改善DKD糖脂代謝的作用。研究結(jié)果顯示，黃芪和蒼術(shù)的有效活性成分為29個，預(yù)測出對應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)218個?；钚猿煞? 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，槲皮素和山奈酚的靶點(diǎn)最多，還有漢黃芩素、異鼠李素、常春藤皂甙元、芒柄花素等對應(yīng)的靶點(diǎn)也較多，活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)主要有PIK3CG、AKT1、MAPK1、IGF2等。提示這幾種成分很可能是黃芪- 蒼術(shù)發(fā)揮作用的主要成分。以往研究表明，槲皮素和山奈酚都具有廣泛的藥理學(xué)作用，槲皮素有抗氧化、降血糖、降血脂、抑制腫瘤、抗炎等作用[18]。還有研究認(rèn)為，槲皮素對DKD具有保護(hù)作用，可延緩糖尿病患者腎小球硬化的進(jìn)程，通過降低TGFβ1/Smad表達(dá)抑制高糖引起的腎小球系膜細(xì)胞增殖[19]。山奈酚具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等多種生物學(xué)活性[20]。一項(xiàng)研究顯示，山奈酚通過調(diào)控p38- MAPK信號通路抑制高糖刺激下大鼠腎系膜細(xì)胞增值[21]。這充分表明藥物與靶點(diǎn)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，驗(yàn)證了黃芪- 蒼術(shù)是以多成分、多靶點(diǎn)的方式發(fā)揮改善DKD的作用。

本研究GO富集分析結(jié)果顯示，黃芪- 蒼術(shù)中的有效活性成分廣泛涉及細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、凋亡、程序性細(xì)胞死亡、對內(nèi)源性刺激的反應(yīng)、分子功能的正向調(diào)節(jié)、對類固醇激素刺激的反應(yīng)、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)二聚化活性、類固醇激素受體活性、細(xì)胞因子活性、配體依賴性核受體活性、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性等多種生物學(xué)過程。KEGG富集分析顯示，黃芪- 蒼術(shù)改善DKD糖脂代謝通路有11條，主要涉及mTOR信號通路、胰島素信號通路、糖尿病信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路、Jak- STAT信號通路、MAPK信號通路等。這一結(jié)果提示黃芪- 蒼術(shù)具有多靶點(diǎn)- 多通路改善DKD糖脂代謝的重要作用。目前研究認(rèn)為DKD發(fā)病機(jī)制主要涉及糖脂代謝改變、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、細(xì)胞凋亡、炎癥等方面。研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下產(chǎn)生糖基化終產(chǎn)物激活PKC、NF- κB、MAPK、Jak- STAT等信號通路，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成及沉積[22,23]。這些證據(jù)表明mTOR信號通路、胰島素信號通路、Jak- STAT信號通路等在DKD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，與本研究的研究結(jié)果一致，同時也表明，疾病的調(diào)控機(jī)制存在復(fù)雜且相互交叉的關(guān)系。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從理論上初步分析了黃芪- 蒼術(shù)改善DKD糖脂代謝的主要活性成分及可能機(jī)制，探討了黃芪- 蒼術(shù)對DKD相關(guān)信號通路的作用，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究探討黃芪- 蒼術(shù)的確切機(jī)制提供線索。對黃芪- 蒼術(shù)改善DKD糖脂代謝的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行研究，體現(xiàn)中藥多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，也為今后研究中藥復(fù)方改善DKD的分子作用機(jī)制提供依據(jù)。