環(huán)狀RNA 的生物學(xué)特性及其對(duì)牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響*

張 碩 劉洪臣

環(huán)狀RNA(circular RNAs,circRNAs)是一類特殊的內(nèi)源性非編碼RNA，廣泛存在于真核生物、原核生物、病毒及古生菌中。CircRNAs 不同于線性RNA，其3’和5’末端相連接，形成共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被核酸外切酶降解，從而更加穩(wěn)定。最初，circRNAs 被認(rèn)為是異常剪接形成的無價(jià)值的副產(chǎn)物，但隨著生物信息分析技術(shù)的發(fā)展及高通量測序技術(shù)的成熟和應(yīng)用，circRNAs 重要的生物學(xué)功能被不斷探索和揭示。CircRNAs 可參與細(xì)胞生命活動(dòng)、胚胎發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育及人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展，并且是腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和糖尿病等疾病早期診斷的理想生物標(biāo)志物[1]。

骨缺損在口腔頜面缺損中很常見，可由牙周炎骨吸收、無牙頜剩余牙槽嵴吸收以及由創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤等造成，對(duì)患者的外形、功能和心理造成嚴(yán)重影響。隨著骨組織工程的不斷發(fā)展，利用組織工程骨修復(fù)頜面部骨缺損，從而恢復(fù)患者的美觀和功能已成為當(dāng)今口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。成骨細(xì)胞作為骨組織工程的種子細(xì)胞，可由牙源性、骨髓源性和脂肪源性等多種間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化而來。其中，牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞(dental mesenchymal stem cells,DMSCs)自我更新能力強(qiáng)、免疫原性低且具有多向分化潛能，尤其是骨向分化能力，使其在骨組織工程中具有廣泛應(yīng)用前景[2]。

DMSCs 成骨分化能力的正常發(fā)揮是修復(fù)缺損骨組織效果的保障。目前研究表明，circRNAs 可以通過多種分子和信號(hào)通路調(diào)控DMSCs 成骨分化，進(jìn)而影響骨代謝過程[3]。因此，對(duì)circRNAs的生物學(xué)特性進(jìn)行表征并綜述其對(duì)DMSCs 成骨分化的作用機(jī)制研究，有助于從新的角度了解骨再生過程，同時(shí)為尋找治療口腔頜面部骨缺損的潛在有效靶點(diǎn)提供新的途徑和理論基礎(chǔ)。

1.circRNAs 概述

1.1 circRNAs 的生物合成 根據(jù)circRNAs 在基因組中的來源及構(gòu)成序列不同，可分為：外顯子環(huán)狀RNA(exon circRNA,EcircRNA)、外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA(exon-intron circRNA,EIcircRNA)和內(nèi)含子環(huán)狀RNA(circular intronic RNA,ciRNA)。它們都源自于同一親本基因，在順式及反式作用元件的調(diào)控下，特異性序列剪接環(huán)化而形成，屬于基因內(nèi)circRNAs[4]。若circRNAs 為不同的親本基因融合后產(chǎn)生，如非小細(xì)胞肺癌患者血清中的F-circEA由EML4-ALK 基因融合產(chǎn)生，則稱為融合基因來源的環(huán)狀RNA(fusion-circRNA,f-circRNA)[5]。目前認(rèn)為circRNAs 合成的驅(qū)動(dòng)方式主要有三種：索套驅(qū)動(dòng)環(huán)化或外顯子跳躍、內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化或直接反向剪接、RNA 結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)驅(qū)動(dòng)環(huán)化[6]。

1.2 circRNAs 的特點(diǎn) circRNAs 具有穩(wěn)定性高、進(jìn)化保守、組織特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。與線性RNA 不同，circRNAs 不具有5’端帽子和3’端poly(A)尾巴，其閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以抵抗核酸外切酶的降解作用，因此穩(wěn)定性更高。此外，研究表明circRNAs 在不同物種間存在較多相似的序列，這種進(jìn)化的相對(duì)保守性使得在豬、小鼠等動(dòng)物模型中鑒定出的多種circRNAs 生物標(biāo)志物在人類臨床也具有應(yīng)用潛力[7]。CircRNAs 在表達(dá)上具有組織特異性，例如，源于Rmst 和Klhl2 的circRNAs 在小鼠大腦中大量富集，但在肺和肝組織中無表達(dá)[8]；在腫瘤組織和正常組織中circRNAs 表達(dá)差異顯著，且不同腫瘤細(xì)胞的circRNAs 表達(dá)也呈現(xiàn)種類和含量的差異，如hsa_circ_002059 在胃癌組織中低表達(dá)[9]，hsa_circ_0001649 在肝癌細(xì)胞中顯著低表達(dá)[10]。

1.3 circRNAs 的功能

1.3.1 作為miRNA“海綿” circRNAs 上存在miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)，即miRNA 反應(yīng)原件(miRNA response elements,MREs)，可以競爭性結(jié)合miRNA，抑制其與靶mRNA 結(jié)合，調(diào)控靶基因表達(dá)，起到miRNA“海綿”的作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_33287 可以通過靶向結(jié)合miR-214-3p 分子的3’-UTR，消除miR-214-3p 對(duì)RUNX3 的抑制作用，上調(diào)RUNX3 的表達(dá)[12]；hsa_circ_0068871 可作為miR-181a-5p“海綿”，消除miR-181a-5p 對(duì)FGFR3 的抑制，從而激活STAT3 信號(hào)[13]。此外，一種circRNA 的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可螯合多種miRNA 分子，影響其靶標(biāo)的表達(dá)，如circHIPK3 可以通過18 個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合9 種miRNAs，調(diào)控人類細(xì)胞增殖[14]。

1.3.2 與RBPs 作用 CircRNAs 上可存在一個(gè)或多個(gè)RBPs 的結(jié)合位點(diǎn)。CircFoxo3 通過結(jié)合周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinases 2,CDK2)及周期蛋白依賴性激酶抑制劑1(cyclin dependent kinase inhibitor 1,p21)形成復(fù)合體，抑制CDK2 功能，進(jìn)而阻斷細(xì)胞周期[15]。CircPABPN1可以結(jié)合HuR 蛋白，阻礙HuR 蛋白與線性轉(zhuǎn)錄本PABPN1 的結(jié)合，從而下調(diào)PABPN1 的表達(dá)水平[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs 經(jīng)過N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修飾后，能夠以HRSP12 依賴的方式結(jié)合m6A 識(shí)別蛋白YTHDF2，介導(dǎo)RNase P/MRP 復(fù)合物降解circRNAs[17]。

1.3.3 參與調(diào)控基因的表達(dá) circRNAs 能夠調(diào)控RNA 轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接，進(jìn)而調(diào)控宿主基因的表達(dá)。CircRNAs 多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)，而EIcircRNAs和ciRNAs 位于細(xì)胞核[18]。研究發(fā)現(xiàn)，一些核內(nèi)EIcircRNAs 可以在轉(zhuǎn)錄水平起到調(diào)控作用，如circ-EIF3J 和circ-PAIP2 能夠結(jié)合U1 小核核糖核蛋白(U1small nuclear ribonucleoprotein,U1snRNP)，形成的復(fù)合物進(jìn)一步募集RNA 聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)，正調(diào)控親本基因的表達(dá)[18]；另外，ciRNAs 也可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，如ci-ankrd52 和ci-sirt7 在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合Pol Ⅱ并作用于親本基因的啟動(dòng)子，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄過程[19]。

此外，circRNAs 在剪接水平上也可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。通過反向剪接模式形成的EcircRNAs，競爭性減少了由線性拼接而產(chǎn)生的線性RNA 的表達(dá)[20]。例如，circMbl 的合成依賴剪接因子MBL的第二個(gè)外顯子序列環(huán)化，而circMbl 中存在MBL的結(jié)合位點(diǎn)，影響了MBL 前體mRNA 的剪接，調(diào)控線性基因的表達(dá)[20]。

1.3.4 編碼蛋白質(zhì) circRNAs 一般被認(rèn)為是一種內(nèi)源性非編碼RNA，但越來越多研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs 具有編碼蛋白質(zhì)的功能。Circ-ZNF609經(jīng)過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)驅(qū)動(dòng)后，能夠直接翻譯小鼠成肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)，參與成肌分化過程[21]。另外，circRNAs 經(jīng)過m6A 甲基化修飾后，能夠識(shí)別并結(jié)合YTHDF3蛋白，進(jìn)而通過螯合eIF4G2 蛋白及一些翻譯起始因子，驅(qū)動(dòng)自身的翻譯，表達(dá)蛋白質(zhì)[22]。CircRNAs的編碼蛋白質(zhì)功能具有重要的臨床疾病治療意義，如circ-FBXW7 能夠翻譯FBXW7-185aa 蛋白，與FBXW7 蛋白協(xié)同作用，下調(diào)c-myc 蛋白的表達(dá)，抑制惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生[23]。

1.3.5 其他功能 circRNAs 可廣泛、穩(wěn)定地存在于細(xì)胞外泌體中，使得其可作為癌癥診斷的生物標(biāo)記物，如在結(jié)腸癌患者和健康人的血清外泌體中，可篩查出多種表達(dá)量具有明顯差異的circRNAs[24]。CircRNAs 還能夠通過反轉(zhuǎn)錄的方式衍生出假基因，對(duì)細(xì)菌、小鼠、人類等生物體的基因組結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[25]，例如在小鼠基因組中可鑒別到來源于circRFWD2、circDIAP3 和circSATB1 的假基因，其中circRFWD2 可衍生出至少33 個(gè)假基因[26]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)circRNAs 具有調(diào)節(jié)mRNA 穩(wěn)定性的功能，如小鼠巨噬細(xì)胞中的circ-RasGEF1B能夠增強(qiáng)TLR4/LPS 通路中mRNA ICAM-1 的穩(wěn)定性[27]。

2.circRNAs 對(duì)DMSCs 成骨分化的影響

DMSCs 來源廣泛，包含多種干細(xì)胞參與牙的形成，包括牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)、牙濾泡細(xì)胞(dental follicle cells,DFCs)、根尖乳頭干細(xì)胞(stem cells of apical papilla,SCAPs)、牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)、脫落乳牙干細(xì)胞(stem cells of human exfoliated deciduous teeth,SHEDs)、牙胚細(xì)胞(tooth germ stem cells,TGSCs)、牙槽骨間充質(zhì)干細(xì)胞(alveolar bone mesenchymal stem cells,ABMSCs)和牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)。DMSCs 可分化為成骨細(xì)胞，用于修復(fù)受損的骨組織[28]，因此其在骨組織工程的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，對(duì)DMSCs 成骨機(jī)制的研究也成為熱點(diǎn)。目前有研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs 可以調(diào)控DMSCs骨向分化，在骨代謝進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[3]。

2.1 調(diào)控PDLSCs 成骨分化 PDLSCs 來源于牙周膜，具有形成牙骨質(zhì)和骨組織的能力，可應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)。PDLSCs 經(jīng)體外誘導(dǎo)可形成礦化結(jié)節(jié)，可檢測到堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨唾液蛋白(bonesialoprotein,BSP)表達(dá)[29]；在小型豬的牙周炎模型中，應(yīng)用自體PDLSCs 與復(fù)合生物支架結(jié)合后植入牙槽骨缺損處，可觀察到有大量新骨生成[30]；PDLSCs 分別與骨及粘骨膜組織工程支架材料復(fù)合后體內(nèi)移植,可顯著增高犬的牙槽嵴高度，實(shí)現(xiàn)牙槽嵴的增高重建[31]。

Zheng 等[32]誘導(dǎo)PDLSCs 成骨分化3、7、14天，檢測不同階段差異表達(dá)的circRNAs，結(jié)果顯示共有52 個(gè)circRNAs 持續(xù)發(fā)生改變。進(jìn)而分析了miRNA 轉(zhuǎn)錄組并構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其中一些miRNAs 已被證明可以調(diào)節(jié)成骨過程，比如miR-204 靶向作用于Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor-2,RUNX2)抑制成骨并促進(jìn)MSCs 的脂肪生成，miR-2816 通過過表達(dá)RUNX2 促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。因此，調(diào)控這些miRNAs 的circRNAs，如circNOTCH3和circCD59，可能在PDLSCs 成骨分化過程中發(fā)揮重要作用。

Gu 等[33]對(duì)PDLSCs 成骨誘導(dǎo)7 天，鑒定差異表達(dá)的circRNAs 并構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測這些mRNAs 可能顯著參與成骨細(xì)胞分化、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、Wnt 通路和調(diào)控干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路。其中，circRNA BANP 和circRNA ITCH 可能與成骨相關(guān)的miR-34a 和miR-146a 相互作用，并分別通過MAPK 通路中的關(guān)鍵基因DUSP1、FAS、RAC1 和PDGFRA、TGFBR2、MYC 調(diào)控PDLSCs 成骨分化。然而，它們的確切調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待研究。

Li 等[34]研究了circRNA CDR1as 和miR-7 在PDLSCs 成骨分化中的潛在作用，發(fā)現(xiàn)CDR1as 在成骨分化過程中顯著上調(diào)，而miR-7 則顯著下調(diào)。敲低CDR1as 和過表達(dá)miR-7 會(huì)抑制ALP 活性、茜素紅S 染色和成骨基因的表達(dá)。此外，發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因GDF5 的3’-UTR 具有miR-7 的結(jié)合位點(diǎn)，敲低GDF5 可以部分逆轉(zhuǎn)miR-7 抑制劑對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。并且CDR1as 或GDF5 的下調(diào)會(huì)抑制Smad1/5/8 和p38 MAPK 的磷酸化，miR-7 的上調(diào)會(huì)降低磷酸化Smad1/5/8 和p38 MAPK 的水平。進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示CDR1as 敲低會(huì)導(dǎo)致骨形成減少。因此，認(rèn)為CDR1as 通過下調(diào)miR-7 的表達(dá)，抑制miR-7 對(duì)GDF5 的負(fù)調(diào)控作用，進(jìn)一步激活pSmad1/5/8 和p38 MAPK 通路，促進(jìn)PDLSCs 骨向分化。

Wang 等[35]對(duì)PDLSCs 進(jìn)行機(jī)械力誘導(dǎo)，在其成骨分化過程中檢測到2678 個(gè)差異表達(dá)的circRNAs。其中circRNA436 顯著下調(diào)，且circRNA-miRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)顯示circRNA436 與miR-107 和miR-335 存在相互作用關(guān)系。有研究表明miR-107 可能下調(diào)Dkk-1 抑制骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展，miR-335 可通過Wnt/β-catenin 通路影響MSCs 成骨分化過程[36]。因此，circRNA436可能通過Wnt/β-catenin 通路調(diào)控PDLSCs 成骨分化。此外有研究發(fā)現(xiàn)MAPK 通路可在機(jī)械應(yīng)力作用下的成骨細(xì)胞增殖中起重要作用[37]，而顯著上調(diào)的circRNA4214 可能通過MAPK 信號(hào)通路促進(jìn)機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs 成骨分化。另外，circRNA126、circRNA3140、circRNA4045、circRNA4251 可能分別與miR-101、miR-21、miR-335、miR-107相互作用，調(diào)控機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs 成骨分化。

2.2 調(diào)控DFCs 成骨分化 DFCs 是牙囊基質(zhì)內(nèi)未分化的細(xì)胞，在體外可誘導(dǎo)生成類似牙骨質(zhì)和骨的結(jié)構(gòu)，提示其具有分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的潛能[38]；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠DFCs 經(jīng)過骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)2 及地塞米松刺激后，結(jié)合β-TCP 支架，移植到免疫缺陷小鼠的背部，可以觀察到有新骨形成[39]。此外，從人類牙濾泡中分離出的DFCs 可分化成骨用于修復(fù)鼠顱骨缺損[40]。

Du 等[41]誘導(dǎo)大鼠DFCs 成骨分化28 天，篩選出266 個(gè)差異表達(dá)的circRNAs。生物信息學(xué)分析顯示這些差異circRNAs 可參與MARK 和TGF-β等信號(hào)通路。并在Fgfr2 基因中發(fā)現(xiàn)了顯著上調(diào)的circFgfr2，可能調(diào)控其下游靶標(biāo)miR-133 并對(duì)BMP6 起作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使circFgfr2 在rDFCs 中過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致miR-133 表達(dá)下調(diào)及BMP6表達(dá)上調(diào)。因此認(rèn)為circFgfr2 可能作為miR-133“海綿”，上調(diào)BMP6 的表達(dá)，從而在rDFCs 成骨分化過程中起到陽性調(diào)控因子的作用，但具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

2.3 調(diào)控SCAPs 成骨分化 SCAPs 可從尚未發(fā)育完全的根尖組織中獲得。研究發(fā)現(xiàn)，牙乳頭細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后植入免疫缺陷大鼠體內(nèi)，能夠形成牙骨質(zhì)-編織骨樣組織，并在該結(jié)構(gòu)周圍觀察到牙骨質(zhì)-骨細(xì)胞樣細(xì)胞[42]，表明其具有成牙骨質(zhì)和成骨分化的潛力。另外，有體外研究發(fā)現(xiàn)胰島素生長因子(insulin growth factor,IGF)-1 和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)能夠促進(jìn)SCAPs 骨向分化[43,44]。

Li 等[45]通過構(gòu)建成骨誘導(dǎo)7 天的SCAPs 模型，篩選出650 個(gè)組間表達(dá)差異顯著的circRNAs。GO分析顯示這些差異表達(dá)的circRNAs 宿主基因主要參與生物調(diào)控以及細(xì)胞代謝過程。KEGG 分析發(fā)現(xiàn)這些宿主基因與MAPK 信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和細(xì)胞內(nèi)胞吞作用等有密切的關(guān)系。并且選擇10 個(gè)circRNAs、21 個(gè)miRNAs 及19 個(gè)mRNAs 構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)，提示circRNAs 可能作為競爭性內(nèi)源RNA 在SCAPs成骨分化過程中發(fā)揮作用。

2.4 調(diào)控DPSCs 成骨分化 DPSCs 為牙髓來源，可在體外形成新鮮自體骨，植入免疫缺陷大鼠皮下4 周后能夠改建為板層骨[46]。DPSCs 還可以復(fù)合多種支架材料，在體內(nèi)外成骨，這顯示了其在骨組織工程中應(yīng)用的巨大潛力[47]。此外，有研究表明，DPSCs 表面存在的雌激素受體利于DPSCs 骨向分化形成骨組織[48]；在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加維生素K2，可以在體外促進(jìn)DPSCs 成骨[49]。

Ji 等[50]發(fā)現(xiàn)在DPSCs 成骨誘導(dǎo)過程中，circRNA124534 的表達(dá)顯著上調(diào)，而miR-496 下調(diào)，且二者存在結(jié)合位點(diǎn)。研究表明circRNA124534可以促進(jìn)DPSCs 在體內(nèi)外成骨分化，而過表達(dá)miR-496 逆轉(zhuǎn)了circRNA124534 的成骨分化作用，敲低miR-496 則能夠上調(diào)β-catenin 水平進(jìn)而促進(jìn)DPSCs 的成骨分化。因此證實(shí)了circRNA124534可以通過miR-496/β-catenin 通路調(diào)控DPCSs成骨分化過程。

Ji 等[51]研究顯示hsa_circ_0026827 的表達(dá)在DPSCs 源性成骨細(xì)胞分化過程中顯著增加，而下調(diào)其表達(dá)會(huì)抑制該過程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0026827 可以作為miRNA“海綿”，結(jié)合miR-188-3p，上調(diào)miR-188-3p 的下游靶標(biāo)Beclin1 和RUNX1 的表達(dá)，進(jìn)而通過Beclin1 介導(dǎo)的自噬和RUNX1 促進(jìn)DPSCs 成骨分化，即從機(jī)制上闡明了hsa_circ_0026827 的表達(dá)對(duì)體內(nèi)異位骨形成所具有的重要促進(jìn)作用。

3.結(jié)語

隨著生物測序技術(shù)日臻成熟，越來越多circRNAs被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)circRNAs 的特性、功能及與疾病的關(guān)系也在逐步被揭示。DMSCs 的成骨分化潛能在骨組織工程中具有廣泛的應(yīng)用前景，探討circRNAs對(duì)DMSCs 成骨分化的調(diào)控機(jī)制有助于從多角度理解骨代謝過程，并為治療口腔頜面部骨缺損提供潛在的靶點(diǎn)。目前研究表明circRNAs 可通過circRNA-miRNA-mRNA 相互作用調(diào)節(jié)DMSCs成骨分化進(jìn)程。于是，可對(duì)circRNAs 進(jìn)行調(diào)控，在多種分子和信號(hào)通路的參與下促進(jìn)DMSCs 骨向分化，發(fā)揮其種子細(xì)胞功能，修復(fù)牙槽骨和顱面骨缺損，最終實(shí)現(xiàn)患者頜面部的美觀與功能重建。