DNA分子遺傳標記技術在倉儲害蟲中的研究與應用

伍 祎 李志紅 李燕羽 張 濤 曹 陽

（國家糧食局科學研究院1，北京 100037）（中國農業(yè)大學農學與生物技術學院2，北京 100093）

DNA分子遺傳標記技術在倉儲害蟲中的研究與應用

伍 祎1，2李志紅2李燕羽1張 濤1曹 陽1

（國家糧食局科學研究院1，北京 100037）（中國農業(yè)大學農學與生物技術學院2，北京 100093）

DNA分子遺傳標記的產生和發(fā)展，為從分子水平研究重要經濟昆蟲提供了全新的技術和手段。倉儲害蟲在農業(yè)經濟中占有重要地位，通過對倉儲害蟲遺傳物質的研究和分析，能夠從生命的本質上探索倉儲害蟲的系統(tǒng)發(fā)育、遺傳結構和進化機制等問題，為害蟲綜合治理策略提供理論支持。在倉儲害蟲中，分子標記研究起步較晚，研究的重點主要是鞘翅目和嚙蟲目害蟲?；仡?、分析了DNA分子標記技術在倉儲害蟲中的研究與應用，包括倉儲害蟲種類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳多樣性及抗藥性等，并對該技術的研究前景進行了展望。

分子標記 倉儲害蟲 糧食儲藏

倉儲害蟲是危害儲藏期間糧食及其產品的害蟲和害螨的統(tǒng)稱。截至2000年，全世界已記載的倉儲昆蟲和螨類約500種，我國有383種，其中倉儲昆蟲242種，螨類141種[1]。倉儲害蟲對產后糧食帶來巨大損失，據1990～2000年的調查，全世界糧食每年由于倉儲害蟲危害而造成的損失大概有5%～10%，約1億8千萬t，在一些熱帶和亞熱帶國家，糧食收獲后有20%或者更多的損失是由倉儲害蟲造成[2－3]。近年來，在世界范圍內倉儲害蟲對磷化氫抗藥性越來越強，種類也日趨增多，導致熏蒸失敗，并且引起了糧食有害化學藥劑殘留等一系列問題[4]。另外，港口截獲倉儲害蟲的種類快速鑒定，來源追溯等問題也亟待解決。害蟲分子水平上遺傳學和進化策略的研究是解決害蟲問題的基礎，運用DNA分子遺傳標記研究倉儲害蟲，從分子水平了解害蟲遺傳變異的本質具有重要意義。

1 分子遺傳標記在倉儲害蟲中研究的意義和內容

20世紀90年代以來，分子遺傳標記的產生、發(fā)展及其廣泛應用，為從分子水平研究昆蟲提供了全新的技術和手段。通過對昆蟲遺傳物質的研究和分析，能夠了解昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育、遺傳結構和進化機制等問題，能從生命的本質上探索昆蟲的遺傳進化，為研發(fā)新型生物防治技術和綜合治理策略等提供理論支持。在倉儲害蟲中，分子標記研究起步較晚，某些新興的分子標記應用還處于起步階段，運用的分子技術主要是基于PCR的基因序列分析和微衛(wèi)星DNA標記，研究的對象主要是倉儲中危害嚴重的鞘翅目、嚙蟲目以及蛛形綱的螨類等。目前，許多研究者利用分子遺傳技術對倉儲害蟲進行種類鑒定，系統(tǒng)發(fā)育分析，種群遺傳研究，害蟲抗藥性水平，以及害蟲的入侵起源與入侵規(guī)律分析等。

2 DNA分子遺傳標記在倉儲害蟲中的研究進展

2.1 倉儲害蟲種類鑒定研究

傳統(tǒng)的昆蟲種類鑒定技術普遍以成蟲形態(tài)特征為依據，需要嚴格的專業(yè)知識學習和培訓，而且很難對未成熟蟲態(tài)（卵、幼蟲及蛹）、殘損樣品以及形態(tài)相似種類進行快速鑒定。現(xiàn)代分子技術的發(fā)展，尤其是DNA條形碼技術的出現(xiàn)和完善，為物種準確快速鑒定開辟了新方法，同時從基因水平反映物種的進化關系，在提高物種鑒定效率、發(fā)現(xiàn)新種和隱存種等方面具有重要應用價值。在倉儲害蟲中，已成功運用隨機擴增多態(tài)性（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、DNA條形碼和基于PCR特異引物技術實現(xiàn)了物種的快速鑒定。

RAPD是倉儲害蟲中較早應用的分子鑒定技術，實現(xiàn)了擬步甲科和鋸谷盜（Oryzaephilus surinamensis）的鑒定[5－6]。鞘翅目是倉儲害蟲中危害最為嚴重的一大類群，有些種類形態(tài)非常相似，如米象（Sitophilus oryzae）和玉米象（Sitophilus zeamais），Hidayat等[7]運用RFLP技術，擴增了一段mtDNA上1 635 bp基因，結合3種限制性內切酶成功將兩者區(qū)分開來。書虱是嚙蟲目中體形微小的一類害蟲，形態(tài)鑒定難度大。Qin等[8]采用 PCR－RFLP技術，通過擴增一段的16S rDNA基因，鑒定了中國和捷克4種書虱，其中3種書虱產生了地理隔離，為鑒定書虱不同地理來源提供了技術依據。Li等[9]結合形態(tài)和16S rDNA基因序列的方法成功實現(xiàn)了嗜卷書虱（Liposcelis bostrychophila）不同地理種群的快速鑒定，這主要是因為某些物種在長期的進化中，由于外界因素（溫濕度、光照以及地形地貌等）產生了地理隔離，這種變異在基因水平上表現(xiàn)出來，通過分子技術手段得到直觀的體現(xiàn)。

分類學家 Hebert等[10]首次提出“生物條形碼”的概念，認為線粒體COI基因一段約700 bp的片段可作為動物DNA條形碼的基礎，其基本原理在于，假設DNA序列改變率為2%每百萬年，600 bp的序列中就有12個可識別的堿基差異，而多數物種進化歷史均超過一百萬年，理論上可以完成所有物種的分析和鑒定。經證實，超過95%的被測動物類群具有明顯區(qū)分的條形碼序列[11－12]。近年來，DNA條形碼技術已逐步應用在倉儲害蟲的種類鑒定中[13]，該方法具有簡便、快速、專一的優(yōu)點。

Obrepalska－Steplowska等[14]為了將谷象（Sitophilus granaries）與米象和玉米象區(qū)分開來，針對COI條形碼基因和COII基因設計了谷象的特異引物。林陽武[15]針對線粒體上Cytb基因，設計了菜豆象（Acanthoscelides obtectus）、四紋豆象（Callosobruchusmaculatus）、綠豆象（Callosobruchus chinensis）特異性引物，建立了這三種害蟲的分子鑒定技術體系。在書虱的研究中，目前已經針對16S rDNA和COI基因設計出了嗜蟲書虱（Liposcelis entomophila）、嚙書虱（Liposcelis corrodens）和Lepinotus reticulatus的特異引物對[16－18]，能將其與常見倉儲書虱鑒定開來。另外，Wei等[19]針對ITS全序列設計了一組特異引物對中國常見的6種倉儲書虱進行快速鑒定，經一個多重PCR反應便能區(qū)分6種倉儲書虱。蛛形綱的螨類是倉儲害蟲中肉眼很難看見的一個類群，種類豐富，在螨類的分子鑒定中，Webster等[20]利用COI的部分片段對粉螨屬中粗腳粉螨（Acarus siro）及其親緣種小粗腳粉螨（Acarus farris）和靜粉螨（Acarus immobilis）作了種類鑒定。

目前，快速鑒定是分子技術在倉儲害蟲中應用最廣的研究內容之一，涉及到的分子標記包括RAPD、RFLP、基于DNA條形碼設計特異引物技術。在種類鑒定方面，這幾種分子標記技術有其自身的特點，RFLP是發(fā)展最早的DNA標記技術，結果直觀明了，但是檢測周期長，操作技術要求較高，如克隆的制備、同位素標記、Southern印記反應及分子雜交等技術。RAPD技術簡便易行、省時省力，但是結果重復性差，為了得到較穩(wěn)定的結果，各種反應參數必須事先優(yōu)化選擇。基于DNA條形碼設計特異引物技術是近年來國際上普遍應用的技術，其準確性高、重復性好、操作簡單、且適合于高通量的檢測，但是特異引物的鑒定也有其自身的局限性，引物特異性的測試是在一定相似物種范圍內進行的，當相似物種數增加時，可能會產生非特異的擴增，因此在測試某物種的特異引物時，要盡可能多的包含其近似物種的種類，以保證其種類鑒定的準確。因此，在對倉儲害蟲進行分子鑒定時，要綜合考慮測試要求、成本、操作難易等因素，選擇合適的標記技術。

2.2 倉儲害蟲系統(tǒng)發(fā)育研究

生物基因組中含有特別豐富的生物學信息，用基因研究昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育，更有可能比較真實地反映出昆蟲的進化歷史。系統(tǒng)發(fā)育研究是DNA分子標記的技術優(yōu)勢，在倉儲害蟲系統(tǒng)發(fā)育的研究中，鞘翅目和嚙蟲目是研究的重要對象，主要采用基于PCR擴增的序列分析技術，針對線粒體和核糖體基因進行分析，構建倉儲害蟲系統(tǒng)發(fā)育關系。

鞘翅目的研究中，黃永成等[21]、李偉豐等[22]測定了長蠹科害蟲長度為204 bp的線粒體ND4基因序列，并將分子特征與形態(tài)學特征比較分析，探討種、屬的系統(tǒng)進化。王銀竹等[23]分析了長小蠹科系統(tǒng)發(fā)育關系，研究結果表明分子水平的親緣關系與Wood（1993）新修訂的分類系統(tǒng)基本一致，說明長小蠹科的新分類系統(tǒng)可能更趨于合理。劉曉麗等[24]測定了9種擬步甲長度為435 bp的16S rDNA部分基因序列，構建了分子系統(tǒng)樹，結果表明分子水平的親緣關系與傳統(tǒng)的分類觀點相吻合。Alvarez等[25]對同一地域分布的巴西豆象（Zabrotes subfasciatus）和幾種三齒豆象屬豆象的12S rRNA、Cytb、COI基因進行研究，發(fā)現(xiàn)了巴西豆象Cytb基因序列中有外源基因，寄生于豆象的真核生物或原核生物是造成基因轉移主要原因。Tuda等[26]運用3個線粒體基因，采用序列分析的方法，重建亞洲和非洲地區(qū)的瘤背豆象屬系統(tǒng)發(fā)育。

對書虱和螨類的分子系統(tǒng)發(fā)育研究是國外相關研究者普遍關注的焦點。Johnson等[27]聯(lián)合核糖體和線粒體基因片段，重建了嚙蟲亞目的系統(tǒng)發(fā)生關系，明確了嚙蟲目的系統(tǒng)發(fā)育關系以及嚙蟲目與虱目的關系。吳太葆等[28]針對一段mtDNA COI基因序列，分析了橢圓食粉螨（Aleurolyphusovatus）2個中國地理種群，未發(fā)現(xiàn)地理差異。張素卿[29]基于2個核糖體基因對肉食螨亞科常見的2屬4種肉食螨[馬六甲肉食螨（Cheyletusmalaccensis）、強壯肉食螨（C．fortis）、轉開肉食螨（C．aversor）及磷翅觸足螨（Cheletomorpha lepidopterorum）]的系統(tǒng)關系進行分析，認為馬六甲肉食螨和強壯肉食螨是同物異名種。

倉儲害蟲系統(tǒng)發(fā)育研究中，研究的重點已經不只是生物的形態(tài)學特征，而是生物大分子尤其是序列。在倉儲害蟲研究中，由于不同基因片段有其自身的進化速率，同時不同的倉儲害蟲科屬間系統(tǒng)進化速度也不一樣，針對不同研究對象選取不同的基因片段尤為重要。通過系統(tǒng)發(fā)育分析推斷或者評估這些進化關系，以進化樹的形式描述同一譜系的進化關系，包括了分子進化（基因樹）、物種進化以及分子進化和物種進化的綜合。分子標記技術的介入，為全面理解倉儲害蟲不同階元的進化關系提供了有力的技術方法。

2.3 倉儲害蟲種群遺傳研究

種群遺傳研究主要涉及生物入侵的起源探索、群體爆發(fā)判別、擴散路徑預測及入侵機理等內容。種群遺傳學中應用最為廣泛的分子技術主要是DNA序列分析和微衛(wèi)星DNA技術，該類研究是進一步揭示昆蟲尤其是重要害蟲種類入侵來源和擴散問題的基礎[30]。

基于微衛(wèi)星DNA標記技術是分子技術中開發(fā)較晚的方法，是種群遺傳研究的首選。在鞘翅目中，Sembene等[31]研究了塞內加爾5種寄主上的花生豆象（Caryedon serratus）的微衛(wèi)星DNA，從而確定了其微衛(wèi)星位點的多態(tài)性。Alvarez等[32－34]篩選了黑翅豆象（Acanthoscelides obvelatus）和菜豆象的微衛(wèi)星多態(tài)性位點，并運用微衛(wèi)星標記和3個mtDNA基因序列分析相結合的方法，對采自6個國家的菜豆象的進行了遺傳分析，結果表明菜豆象起源于秘魯，由秘魯傳入墨西哥最終進入舊大陸的入侵規(guī)律。在巴西豆象的種群遺傳的研究中，Aebi等[35－36]應用微衛(wèi)星標記技術，發(fā)現(xiàn)了地理隔離與寄主是影響巴西豆象及其天敵群體遺傳結構的最為重要的因子。在嚙蟲目書虱研究方面，目前，已從無色書虱（Liposcelis decolor）、嗜卷書虱和嗜蟲書虱的基因組DNA中成功分離出微衛(wèi)星位點[37－38]，并且運用6個微衛(wèi)星位點分析了澳大利亞無色書虱的種群遺傳結構及其擴散途徑[39]。螨類的研究中，Zou等[40]利用微衛(wèi)星標記研究了中國4個種群的粗腳粉螨，發(fā)現(xiàn)粗腳粉螨已經產生地理隔離，但遺傳距離與地理距離不存在相關性。

基于DNA序列分析研究種群遺傳是倉儲害蟲中普遍采用的研究方法。鞘翅目中，Tuda等[41]針對綠豆象一段522 bp的線粒體基因COI序列，分析了來自3個國家的8個地理種群，結果表明綠豆象可能已頻繁入侵日本。許佳君[42]、顧杰等[43]研究了蠶豆象（Bruchus rufimanus）、豌豆象（Bruchus pisorum）、綠豆象和四紋豆象不同地理種群種間親緣關系，結果表明種群間的遺傳分化程度較低。Blanc等[44]首次運用RFLP技術研究煙草甲（Lasioderma serricorne）15個國家16個地理種群的結構，發(fā)現(xiàn)地理距離不明顯，商品貿易等人為行為是形成煙草甲種群結構的主要原因。嚙蟲目中，魏丹丹[45]采用Cytb基因片段為分子標記，對中國10個嗜蟲書虱地理種群及8個嗜卷書虱地理種群的遺傳結構進行分析，研究發(fā)現(xiàn)兩性生殖的嗜蟲書虱具有更高的遺傳多樣性，地理隔離不是兩種書虱種群間遺傳分化的主要原因。

倉儲害蟲的種群遺傳研究中，普遍是序列分析和微衛(wèi)星標記2種技術相結合。通過分子標記技術對倉儲害蟲種群遺傳研究的現(xiàn)狀分析，可以看出倉儲害蟲由于其生活的特殊環(huán)境，其分子水平的遺傳分化普遍偏低，其傳播和擴散基本是依賴人為活動，如糧食及食品的運輸。因此，要防止倉儲害蟲的進一步危害，必須要加強糧食調運的前期的檢疫處理和后期貿易監(jiān)管。

2.4 倉儲害蟲抗藥性和共生菌研究

倉儲害蟲多數是發(fā)生在糧庫這樣的特定場所，糧庫的類型（平房倉、淺圓倉），糧庫里的熏蒸處理，糧庫中特有的溫濕度環(huán)境以及倉儲害蟲自身共生菌等，這些因素對倉儲害蟲的遺傳水平，種群變化產生重要影響。了解清楚這些問題將對倉儲害蟲的防治管理提供基礎理論支持。

熏蒸處理是糧庫中常用的防治手段，這導致了倉儲害蟲抗藥性的產生，隨著分子遺傳標記技術的發(fā)展，人們能夠在分子水平上進一步了解害蟲的抗藥性機制，這將對害蟲的防治起到極大的推進作用。目前，倉儲害蟲磷化氫抗性的研究中，Schlipalius等[46]發(fā)現(xiàn)了谷蠹（Rhizopertha dominica）和赤擬谷盜（Tribolium castaneum）中與磷化氫抗性密切相關的脫氫酶二聚體（DLD），該酶是毒素降解的核心酶，而線蟲的突變體中DLD增加了對亞砷酸鹽敏感性，這為解決害蟲抗磷化氫的問題提供了理論依據。線粒體是呼吸作用場所，是能量代謝的重要細胞器，普遍認為線粒體是害蟲抗藥性的作用位點，Corrêa等[47]研究了玉米象中線粒體譜系、線粒體裂解和呼吸頻率與磷化氫抗藥性的關系，研究發(fā)現(xiàn)線粒體譜系和磷化氫的敏感性之間沒有任何關系，線粒體上的COI和COII基因片段并不是磷化氫易感性的有效分子標記。在我國，宋旭紅[48]研究了谷蠹不同地理種群對磷化氫抗性及其遺傳分化，結果表明糧食加工企業(yè)的種群具有高抗性，而地方糧庫的種群抗性較低；分子標記分析表明谷蠹種群的遺傳變異與地理位置、倉庫類型及儲糧生態(tài)區(qū)不相關。Sharaf等[49－51]測定了鋸谷盜的基因組，并分析了自然種群和倉庫種群基因組差異，發(fā)現(xiàn)自然條件的鋸谷盜種群比糧倉中的種群表現(xiàn)出更高的遺傳差異水平，推測鋸谷盜種群遺傳結構與其繁殖方式有關。研究表明，倉儲昆蟲的抗藥性和遺傳多樣性與自然條件下的昆蟲有明顯差異，在對倉儲害蟲分子生物學的研究和防治管理中，需要考慮糧庫這樣一個特定環(huán)境，對不同的種群采用不同的防治手段才能取得更好效果。

昆蟲內共生菌與昆蟲宿主生物學密切相關，內共生菌能夠影響昆蟲宿主的種群適合度、入侵能力、適應能力、競爭能力甚至進化等[52]。在倉儲害蟲內共生菌的研究中，Kageyama等[53]通過對倉儲害蟲Wolbachia共生菌wsp基因檢測，在38種59個品系儲糧害蟲中，發(fā)現(xiàn)13種18個品系的儲糧害蟲感染有Wolbachia共生菌，至少6個Wolbachia共生菌品系在多種儲糧害蟲中共享。Hubert等[54]研究了4種倉儲害螨體內的共生菌，不同的害螨共生菌種類不一樣，且共生菌的遺傳分化明顯。目前，僅檢測了某些倉儲害蟲內共生菌的種類，進一步的倉儲害蟲與共生菌相互作用和影響機理研究有待加強，以期為運用共生菌來防治倉儲害蟲提供基礎數據。

3 展望

DNA分子標記在短暫的幾十年，經歷了迅猛發(fā)展，各種標記日趨成熟，新的標記出現(xiàn)和完善周期也迅速縮短，DNA分子標記技術已廣泛的應用于倉儲害蟲各個階元的研究中，如系統(tǒng)學、群體遺傳學、入侵學和抗性機制等。在已經出現(xiàn)的幾十種分子標記中，基本是建立在RFLP、PCR和重復序列的基礎上，每種標記有其自身的特點和運用側重點。

倉儲害蟲對收獲后的農產品造成巨大的損失，在我國農業(yè)經濟發(fā)展中占有十分重要的地位，全面掌握倉儲害蟲分子生物學基礎數據是國家進一步做好“廣積糧、積好糧、好積糧”的重要環(huán)節(jié)，是實施科技興糧戰(zhàn)略的重要內容。但由于目前技術水平、數據分析及人員投入等方面的限制，倉儲害蟲DNA分子標記研究仍未廣泛開展，未來倉儲害蟲分子技術的研究重點建議考慮以下幾個方面：1）倉儲害蟲快速鑒定研究，構建DNA條形碼數據庫，開發(fā)倉儲害蟲DNA條形碼鑒定系統(tǒng)，實現(xiàn)糧堆和食品加工中害蟲尸體和碎片的快速鑒定，為綠色儲糧、蟲情監(jiān)測等提供基礎技術保障；2）倉儲害蟲種群遺傳結構研究，倉儲害蟲隨著糧食調運以及自身的飛翔等因素進行入侵和擴散，種群遺傳規(guī)律研究，可以明確入侵來源、擴散趨勢、擴散路線等，為在蟲情監(jiān)測、糧食調運和害蟲管理提供理論依據；3）倉儲害蟲抗藥性研究，倉儲害蟲抗藥性是日益緊迫的世界性問題，對一種或多種熏蒸劑產生抗藥性的昆蟲及螨類數量日趨增多，DNA分子技術能為抗藥性的監(jiān)測、檢測、機理、評價、治理等問題提供技術方法；4）倉儲害蟲生物防治技術研究，運用分子標記技術檢測糧庫中害蟲天敵（如捕食螨、米象金小蜂、麥蛾繭蜂、黃褐色食蟲蝽及窗虻等）品系，輔助選擇最優(yōu)品系天敵，評估各種天敵對糧庫中生物多樣性影響等。這些研究能補充和完善倉儲害蟲分子遺傳數據，為倉儲害蟲進化生物學的研究提供更豐富的理論依據，為害蟲綜合治理新技術、新方法研發(fā)奠定科學的應用基礎。

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The Research and Application of Dna Molecular Genetic Markers in Stored－Product Pests

Wu Yi1，2Li Zhihong2Li Yanyu1Zhang Tao1Cao Yang1

（Academy of State Administration of Grain1，Beijing 100037）（College of Agronomy and Biotechnology，China Agricultural University2，Beijing 100193）

DNA molecular genetic markers provided a new technique and method for the research of important economic insects onmolecular level.Stored－product pests played an important role in the agricultural economy.The research and analysis on genetic material of stored－product pests had revealed phylogenetic development，genetic structure and evolution mechanism from the essence which could afford a theoretical support for the integrated pest management strategy.The DNA molecular genetic markers had shorter history on applying in stored－product pests.The coleoptera and psocoptera pestswere themain research objects in the previous study.In the paper，the current study and application of DNA molecular geneticmarkers in stored grain insectwere summarized，including species identification，phylogenetic relationships，population genetic variation and resistance.Also the application prospects of DNA molecularmarkers in stored－product pestswere discussed in details.

DNA molecularmarkers，stored－product pests，grain storage

Q1

A

1003－0174（2015）10－0140－07

教育部國家國際科技合作專項（2013DFG32350），北京市自然科學基金（6122020）

2014－04－18

伍祎，女，1980年出生，博士，植物保護

曹陽，男，1958年出生，研究員，糧油儲藏