高效液相色譜法測定乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白及其改性降敏

趙倩如，朱麗英，趙權宇，江 凌

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學 化學與分子工程學院，江蘇 南京 211800；3.南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 211800)

近年來,過敏性疾病的發(fā)病率不斷增加，食物過敏已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。牛乳過敏(CMA)是一種最常出現(xiàn)的食物過敏反應[1]，占所有確診食物過敏病例的9%[2]，嬰兒牛乳過敏發(fā)病率從0.3%到7.5%不等[3]。牛乳過敏是由牛乳中的致敏蛋白引起的一種不良反應，主要由免疫球蛋白介導的免疫反應，可引起過敏性鼻炎、哮喘、濕疹、腹瀉、胃腸出血等癥狀，甚至會導致過敏性休克，嚴重危及嬰幼兒的生命[4]。牛乳中最具有營養(yǎng)價值的蛋白質是乳清蛋白，乳清蛋白中主要的致敏蛋白是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。

目前檢測乳品中過敏原的方法主要有3種：高效液相色譜法(HPLC)、電泳法、免疫化學法。最常見的蛋白電泳方法是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[5-7]和毛細管電泳法[8]以及酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法[9-10]通過抗原抗體特異性結合可以測定過敏原的免疫反應性(與免疫球蛋白結合的能力)。但以上方法在測定β-乳球蛋白時都具有一定的局限性,如電泳技術在定量方面有很大的不足；毛細管電泳重復性差，容易堵塞；ELISA方法對試劑的選擇性高。牛乳中蛋白質種類很多，很難有效檢測，以上技術局限性限制了這些方法在實踐中的推廣應用。反相高效液相色譜法是分析乳清蛋白成分的有效方法之一，與其他檢測方法相比具有分辨率和回收率高、操作簡便、重復性好等優(yōu)勢。反相高效液相色譜法可以高效實現(xiàn)大分子以及復雜物質快速分離，對乳品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進行定性定量檢測[11]。定量檢測技術為開發(fā)市場中低過敏乳制品的質量提供了有效方法。另外，如何通過改性技術降低牛乳致敏性開發(fā)低致敏乳品[12]也成為研究的熱點。

在食品加工過程中，主要采用的降敏方法有3種：物理[13]、化學[14]和生物學[15]方法。酶降解致敏蛋白[16-18]是最常見的一種方法，通過酶將大分子蛋白質水解成小分子肽以被吸收利用，可以降低過敏蛋白的致敏性。沈小琴等[19]研究發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶是最常用來水解牛乳中致敏蛋白的酶。

本研究中，筆者擬建立一種高效液相色譜技術定量檢測乳清蛋白中主要致敏蛋白α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的方法，同時評測該檢測方法的可行性，選擇胰蛋白酶作為酶解代表試劑處理乳清蛋白中的致敏蛋白，采用可視化優(yōu)化方法預測最佳的酶解處理條件[20]，以期為低致敏乳品的開發(fā)提供有效的檢測方法和參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-乳白蛋白標準品(純度≥85%)、β-乳球蛋白標準品(純度≥90%)、酪蛋白、分離乳清蛋白，上海源葉生物科技有限公司；三氟乙酸(色譜純)、乙酸(分析純)，美國 TEDIA 公司；乙腈(色譜純)，上海凌峰化學試劑有限公司；胰蛋白酶，南京都萊生物技術有限公司；蒙牛牛奶、伊利嬰兒配方奶粉，當?shù)爻?。樣品及編號?#，α-乳白蛋白標準品；2#，β-乳球蛋白標準品；3#，分離乳清蛋白；4#，蒙牛牛奶；5#，伊利嬰兒配方奶粉。

1.2 主要儀器

DSHZ-300A型旋轉式恒溫水浴振蕩器，太倉市實驗設備廠；GA88-Ⅱ型超聲破碎儀，無錫上佳生物科技有限公司；UltiMate 3000型戴安高效液相色譜儀色譜儀,Dionex公司；5804R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；GZX-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司；GTL100型恒溫金屬浴，北京萊普特科學儀器有限公司。

1.3 主要溶液及配制

醋酸緩沖液。3.86 g冰醋酸和2.93 g無水醋酸鈉加入蒸餾水定容至1 L。

標準品溶液。分別準確稱量α-乳白蛋白標準品、β-乳球蛋白標準品4 mg，加入2 mL蒸餾水進行溶解，配制成2 mg/mL的標準儲備液，吸取適量標準儲備液，加入蒸餾水進行稀釋，稀釋成質量濃度為2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的標準溶液。

樣品溶液。準確稱量樣品，加入蒸餾水定容至100 mL，待測。牛奶按照文獻[21]優(yōu)化的方法進行處理，將新鮮的牛奶以5 000g轉速低溫冷凍離心20 min去脂肪，去脂肪上清液和醋酸緩沖液等體積混合，以8 000g離心10 min，取上清液待測。

1.4 檢測條件

1.4.1 高效液相色譜條件

流動相A為0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B為0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速為1.0 mL/min，紫外檢測器檢測波長為280 nm，檢測溫度為25℃，進樣量為10 μL。梯度洗脫條件具體見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4.2 流動相及相關溶液前處理

1)流動相A、B以及洗脫液配制完成后需要在簡易抽濾裝置下進行去除雜質；

2)流動相在進行抽濾過后進行超聲，20 ℃條件下超聲30 min以去除氣泡；

3)樣品以及標品溶液在上樣之前用0.22 μm的濾膜進行過濾處理。

1.4.3 方法學驗證

1)樣品中的蛋白含量X的計算見式(1)。

(1)

式中：X為試樣中的蛋白含量，以100 g樣品計算；C為蛋白的質量濃度，mg/mL；V為試樣的實際稀釋液總體積，mL；m為樣品質量，g。

2)利用外推法求得樣品分析方法的檢出限，分別取3種低濃度樣品平行測定3次，求出每種濃度的相對標準偏差，用線性回歸法做出擬合曲線，擬合曲線相交于y軸的點，為S0，則3S0為樣品分析方法的檢出限。

3)分別進行樣品分析方法的精密度、穩(wěn)定性以及樣品回收率的探究，每組實驗重復測定3次，取數(shù)據(jù)的平均值作為檢測結果。

1.5 胰蛋白酶降解

1.5.1 樣品預處理

將樣品4#(市售的牛乳)進行脫脂，將脫脂牛乳加熱至85 ℃，維持10 min以使得蛋白充分變性，調節(jié)恒溫混勻儀至水解溫度，以600 r/min的轉速進行充分混合水解，水解結束后加熱至120 ℃使酶失活。改變酶解溫度、時間、酶量，多次進行實驗。

1.5.2 智能可視化軟件優(yōu)化

采用可視化優(yōu)化方法對酶解工藝條件進行分析處理，預測出最佳的酶解工藝條件。首先確定酶解條件的區(qū)間，酶解條件作為多維空間中的向量，再利用映射模型將多維空間中的簡單數(shù)據(jù)映射到二維平面，在該平面中自動生成目標函數(shù)或輪廓的輪廓。根據(jù)輪廓的分布直觀地定位優(yōu)化的操作方向或區(qū)域，最后在該區(qū)域中找到接近最優(yōu)的點，可以用反演映射方法映射回原始的多維空間，預測出最優(yōu)酶解條件[22]。

2 結果與討論

2.1 高效液相色譜法測定方法相關結果

相比于C4柱，選用常見且分離效果更佳的C8柱對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進行分離，以280 nm為檢測波長，目標物出峰時間短，分離效果好。圖1為1 mg/mL的α-乳白蛋白和2 mg/mLβ-乳球蛋白標準色譜圖。由圖1可知，這兩種蛋白的分離峰形尖銳、分離度較好。其中，α-乳白蛋白在12.1 min出峰，β-乳球蛋白在14.5 min出峰，β-乳球蛋白出現(xiàn)雙峰。根據(jù)Brownlow等[23]報道，β-乳球蛋白隨著pH變化會發(fā)生構象改變，通常它是以二聚體的形式存在，當pH低于3.5或高于7.5時，二聚體解離且構象發(fā)生變化，形成膨脹的單體。

圖1 α-乳白蛋白標樣和β-乳球蛋白標樣譜圖

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性關系

根據(jù)配制的一系列標準品濃度，分別繪制α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的標準曲線，對所得曲線進行線性回歸分析，具體的線性方程和數(shù)據(jù)結果如表2所示。

表2 蛋白線性方程及檢出限

由表2可知，對于2種致敏蛋白，所構建的標準曲線在0.125～2.000 mg/mL的質量濃度范圍內呈線性關系，其相關系數(shù)均大于0.99，說明線性關系良好。這種外標法可以快速定量分析樣品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白濃度。

2.2.2 定量限(LOQ)和檢出限(LOD)

定量限結果發(fā)現(xiàn)，產生所需精密度和準確度的定量α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分別為0.062 5和0.080 0 mg/mL。換算成樣品(以每100 g試樣計算)中的含量α-乳白蛋白為0.03 g，β-乳球蛋白為0.02 g。α-乳白蛋白定量限達到食品安全地方標準(DBS 32/011—2016)為0.03 g，β-乳球蛋白定量限略高于團體標準(T/TDSTIA 007—2019)為0.018 g。

儀器檢出限結果顯示α-乳白蛋白為0.090 0 mg/mL和β-乳球蛋白為0.100 0 mg/mL。結果發(fā)現(xiàn)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白檢出限分別為0.078 0和0.090 0 mg/mL。

2.2.3 精密度

精密度是保證準確度的先決條件。為了進行此次精密度探究，利用α-乳白蛋白和β-乳球蛋白3種不同濃度的標準溶液進行評估，結果見表3。由表3可知，相對標準偏差(RSD)均小于5%，說明該方法對蛋白質具有測量的再現(xiàn)性。

表3 蛋白質檢測精密度數(shù)據(jù)

2.2.4 特異性

以樣品3#為代表進行特異性探究，分別對未處理和經過處理的樣品溶液進行分析檢測，結果見圖2。由圖2可知，經過處理后的2種蛋白的色譜峰峰形尖銳，分離效果好，說明該分析方法對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白具有特異性。

圖2 不同條件下的色譜圖

2.2.5 穩(wěn)定性研究

將配制好的5種樣品的新鮮溶液和經過48 h冷藏后的儲備溶液平行測定3次，研究分析方法的穩(wěn)定性，結果如表4所示。由表4可知，經過48 h后的冷藏儲備液并沒有明顯的降解，相對標準偏差(RSD)均小于5%，說明該方法能在48 h內實現(xiàn)蛋白含量的穩(wěn)定定量測定。

表4 穩(wěn)定性實驗結果

2.2.6 回收率實驗結果

分別取樣品4#和樣品5#各1 mL，每份樣品中等體積加入標準品混合溶液(0.2 mg/mL的α-乳白蛋白溶液和0.4 mg/mL的β-乳球蛋白等體積混合)，如前所述進行蛋白含量分析，每組實驗平行測定3次，結果如表5所示。由表5可知，相對標準偏差(RSD)小于5%，回收率在92%～96%，表明該方法可以實現(xiàn)樣品較高的回收率。

表5 加樣回收率測定結果

2.2.7 不同樣品中致敏蛋白含量測定

利用該色譜分析方法分別對樣品3#、4#和5#進行了2種致敏蛋白的含量測定，具體結果如表6所示。由表6可知，該方法能夠實現(xiàn)不同乳品中致敏蛋白含量的檢測。值得注意的是樣品5#(嬰兒配方奶粉)中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量較低，說明嬰兒配方奶粉中的致敏蛋白含量已經受到控制，不同乳制品中致敏蛋白含量也有所差異，牛乳比嬰幼兒配方奶粉中β-乳球蛋白含量要高，會更容易出現(xiàn)過敏現(xiàn)象。

表6 樣品測定結果

2.3 胰蛋白酶水解

相比于一些物理化學降解方法，酶降解是一個溫和有效的過程，研究表明胰蛋白酶可以有效地降解致敏蛋白，首先設計單因素變量法考察酶降解影響因素(溫度、酶量、水解時間)，每組實驗平行測定3次，取數(shù)據(jù)的平均值作為測定結果，其次進行正交試驗，最后利用可視化方法預測出最佳的酶解條件。

2.3.1 單因素變量實驗結果

2.3.1.1 溫度對酶解效果的影響

選取樣品4#作為水解底物，將牛乳按照之前所述進行處理，分成15份作為水解底物，水解底物為1 mL脫脂牛乳。另外，脫脂牛乳保留1份作為原液進行測定。將胰蛋白酶配制成1 g/L的酶溶液，按照高酶量6 000 U/g胰蛋白酶加入到樣品溶液中，按照之前所述方法進行水解，水解時間設為30 min，溫度梯度設置為25、35、40、45和50 ℃，最后測得水解底物中剩余致敏蛋白濃度。具體結果表7所示。由表7可知，胰蛋白酶在一定的酶量和酶解時間下，在40 ℃水解條件下最佳，溫度過高或者過低水解效果均不佳。因此，在40 ℃左右分別取2個溫度作為酶解溫度的最佳區(qū)間(35、40和45 ℃)，作為溫度因素的3個水平。

表7 不同溫度下的酶解結果

2.3.1.2 酶量對酶解效果的影響

根據(jù)溫度實驗的結果，在40 ℃條件下按照各酶量加到樣品溶液中水解，30 min后測定水解底物中剩余致敏蛋白濃度，具體結果如表8所示。由表8可知，在一定水解溫度和水解時間條件下，酶量與水解效果成正比，但是當超過6 000 U/g胰蛋白酶時，水解效果下降不再明顯。為了保證牛乳中營養(yǎng)成分的同時降低致敏蛋白的含量，本研究以接近母乳中蛋白含量為標準，使用1 000、1 500和2 000 U/g胰蛋白酶為酶量的3個水平。

表8 不同酶量下的酶解結果

2.3.1.3 水解時間對酶解效果的影響

根據(jù)溫度、酶量實驗的結果，在溫度40 ℃、1 000 U/g胰蛋白酶的條件下進行水解，水解時間為10、20、30、40和50 min，最后測得水解底物中剩余致敏蛋白濃度，具體結果如表9所示。由表9可知，隨著時間不斷延長，降解效率越來越高，同樣為了保證乳制品中乳清蛋白的營養(yǎng)不被完全破壞，保持低濃度的β-乳球蛋白，選擇水解時間為20、30和40 min作為時間因素的3個水平。

表9 不同時間下的酶解結果

2.3.2 多因素變量實驗

設計正交試驗，根據(jù)單因素變量的實驗結果，分別挑選溫度、酶量、水解時間最優(yōu)區(qū)間進行正交試驗，結果以剩余蛋白濃度為標準，具體結果見表10和表11。

表10 正交試驗結果

表11 極差分析

由表10～11結果確定了正交試驗最優(yōu)處理條件：溫度40 ℃、1 500 U/g胰蛋白酶、水解時間40 min。

2.3.3 可視化方法優(yōu)化

表12 可視化優(yōu)化方法的優(yōu)化結果

圖3 胰蛋白酶降解工藝降維映射平面圖

可視化誤差分析如表13所示。由表13可知，可視化優(yōu)化方法可用于預測最優(yōu)化酶解條件。

表13 可視化優(yōu)化方法誤差分析

2.3.4 最優(yōu)酶降解條件

根據(jù)正交試驗和可視化方法得到的酶解最優(yōu)條件進行實驗，每組進行3次行平行測定，結果如表14所示。預測胰蛋白酶水解的最佳條件為溫度45 ℃、2 000 U/g胰蛋白酶、水解30 min。由表14可知，在此條件下水解率已達到較高值，且致敏蛋白在蛋白質中比例接近母乳(23%)說明營養(yǎng)沒有被破壞，此條件可作為胰蛋白酶水解的最佳條件。

表14 最佳條件酶解

3 結論

利用反相高效液相色譜法采用Sepax-C8色譜柱對乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量進行檢測分析，并且評測了該方法的可行性，在該方法下樣品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白出峰時間短，分離效果好。同時進行了精密度、穩(wěn)定性和回收率實驗，結果RSD均小于5%，也證實了方法的可行性。利用胰蛋白酶降解致敏蛋白，采用智能可視化優(yōu)化方法預測最優(yōu)酶解條件，結果表明在45 ℃下加入2 000 U/g胰蛋白酶水解30 min后，2種致敏蛋白含量占總蛋白的22.7%，大大降低了乳品中的致敏蛋白含量。本次研究可為乳制品的質量評價及生產低致敏乳品提供依據(jù)。