超聲波輔助提取葛根總黃酮的工藝研究

(昭通學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昭通 657000)

葛根[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]，習(xí)稱野葛，為豆科植物野葛的根莖，我國資源豐富，多產(chǎn)于云南、貴州、四川、河南、山西等地[1]。葛根作為藥食兩用植物，可以提高人體內(nèi)肝細胞的生長能力，恢復(fù)人體內(nèi)正常的肝臟功能。同時，它可以促進人體內(nèi)膽汁的分泌，并能有效的消耗人體內(nèi)積累的脂肪，從而減少脂肪肝等疾病的發(fā)生[2, 3]。現(xiàn)代藥理研究表明，葛根中含有黃酮類、三萜類、生物堿類等多種化合物，其中黃酮類化合物是葛根中的主要有效活性成分之一。葛根總黃酮不但具有解酒、鎮(zhèn)痛、解熱等功效，還有抗腫瘤、抗氧化、降血壓和治療心血管疾病等作用[4-6]。近年來，隨著生活水平的提高，人們的保健意識逐漸增加，保健品的開發(fā)日趨受到人們關(guān)注。葛根總黃酮有著豐富的生物活性，以葛根作為原材料提取黃酮類化合物用于保健品開發(fā)和利用正方興未艾[7,8]。目前，從葛根中提取黃酮類化合物有多種方法，諸如滲漉法、浸提法、酶解法和超聲波輔助提取法等[9]。超聲波輔助提取法與其它方法相比，具有提取的總黃酮活性成分較高、提取率高、耗能較小、時間短、設(shè)備簡易和操作簡單等特點[10]。本文以乙醇濃度、超聲時間和料液比3個單因素進行超聲波輔助提取葛根中的總黃酮，并在在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化超聲波輔助提取普洱葛根中總黃酮的提取工藝。為葛根綜合開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

葛根材料采集于2018年9月云南普洱市。

蘆丁對照標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品鑒定所，批號10081-9905)、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑均為分析純(上?；瘜W(xué)試劑廠)。

1.2 儀器

UNICO7200可見光分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)；FA2004電子精密天平(上海右一儀器有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥烘箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SK5200LHC超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；XFB-200家用粉碎機(湖南省吉首市中機械廠)等。

2 實驗方法

2.1 原料預(yù)處理

將葛根洗凈晾干，放入75 ℃的干燥箱中烘干至恒重，用粉碎機粉碎過80目篩，得到葛根粉末，裝入密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別移取質(zhì)量濃度0.824 8 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于10 mL比色管中，各管中分別加入0.4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的亞硝酸鈉溶液，震蕩搖勻，室溫放置5 min，加入0.4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁溶液，震蕩搖勻，室溫放置5 min，再加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的氫氧化鈉溶液，用去離子水定容至10 mL刻度，充分搖勻，室溫放置30 min。以第一只試管的溶液作為空白對照，于波長為510 nm處測定吸光度，平行測定三次取平均值。以蘆丁質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，吸光度y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 葛根中總黃酮的測定

準(zhǔn)確稱取1 g葛根干燥粉末于具塞錐形瓶中，在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間和料液比3個因素下超聲(53 kHz, 200 w)輔助浸提，將所得提取液稀釋定容至50 mL，準(zhǔn)確移取2 mL于10 mL比色管中，按照2.2法測定吸光度，按下式計算葛根總黃酮浸出率。

c為提取液總黃酮的質(zhì)量濃度(mg/mL)；v為提取液的體積(mL)；n為提取液的稀釋倍數(shù)；m為葛根粉末質(zhì)量(mg)。

2.4 單因素試驗

以乙醇體積分?jǐn)?shù)(35%、50%、65%、80%、95%)、超聲時間(12、24、36、48、60 min)、料液比(1∶10、1∶ 20、1∶ 30、1∶ 40、1∶ 50 (g/mL))3個單因素進行超聲(53 kHz, 200 w)輔助浸提葛根中的總黃酮，并測定出各組總黃酮的含量。

2.5 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、超聲時間(B)和料液比(C)作為研究因素，每個因素下設(shè)定3個水平，進行正交試驗，確定超聲波輔助提取葛根中總黃酮的最佳工藝條件。正交試驗設(shè)計如表1所示。

表1 正交試驗因素及水平Tab. 1 Factors and levels of orthogonal test

3 結(jié)果分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

根據(jù)2.2項操作，得到各組蘆丁質(zhì)量濃度對應(yīng)的吸光度，通過計算機對實驗數(shù)據(jù)進行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=9.625x-0.003 8，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，說明蘆丁質(zhì)量濃度在0～0.824 8 mg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，該回歸方程可以用作葛根中總黃酮的含量測定。

3.2 單因素試驗

3.2.1 乙醇濃度

固定料液比為1: 30 (g/mL)，超聲提取時間為24 min，分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%、50%、65%、80%、95%進行平行試驗，并測定出各組總黃酮浸出率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對黃酮提取的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on flavonoids extraction

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，葛根中黃酮的浸出率增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大至50%時，黃酮浸出率達到最高，為2.51%；之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，黃酮浸出率逐漸降低。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因與不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的極性有關(guān)。根據(jù)相似相溶原理，當(dāng)乙醇溶液的極性與葛根中黃酮的極性相近時，其浸出率最高。乙醇體積分?jǐn)?shù)太低時，葛根黃酮浸出不充分，乙醇體積分?jǐn)?shù)較大時，溶液極性降低，葛根中一些脂溶性成分溶出，抑制黃酮的浸出，葛根黃酮浸出率急劇降低，所以確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

3.2.2 料液比

固定超聲時間為24 min，體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液為浸提液，在料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)試驗條件下提取葛根總黃酮，并測定出各組總黃酮的含量。結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，料液比小于1∶30 (g/mL)時，葛根中總黃酮浸出率隨著料液比的加大而增加；當(dāng)料液比為1∶30 (g/mL)時，黃酮浸出率達到最高，為2.54%；之后隨著料液比的增大，黃酮浸出率略有降低。這是因為料液比較小時，葛根中的總黃酮溶出不完全；料液比增大后，促進了葛根中總黃酮的溶出，料液比為1∶30 (g/mL)時，葛根中的總黃酮溶出達到飽和；再繼續(xù)增大料液比，黃酮浸出率反而下降，造成溶劑浪費，所以確定1∶30 (g/mL)料液比為宜。

圖2 料液比對黃酮提取的影響Fig. 2 Effect of material-liquid ratio on flavonoids extraction

3.2.3 超聲時間

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶30 (g/mL) ，選擇超聲時間分別為12、24、36、48、60 min的條件下提取葛根中的總黃酮，并測定出總黃酮的含量。結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲時間對黃酮提取的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic time on flavonoids extraction

由圖3可知，隨著超聲時間的增長，葛根中總黃酮的浸出率增加，當(dāng)超聲時間延長至36 min時，葛根中總黃酮的浸出率達到最大，為2.60%；此后隨著超聲時間的延長，葛根中總黃酮的浸出率逐漸減小。這是因為超聲時間較短時，葛根中的總黃酮并未完全浸出；當(dāng)超聲時間為36 min時，葛根中的總黃酮浸出充分；再繼續(xù)延長超聲時間，使葛根中的其它非黃酮類物質(zhì)也被浸出，且超聲時間過長，浸出的黃酮類物質(zhì)成分會發(fā)生降解，從而導(dǎo)致葛根中總黃酮的提取量減少。因此選擇超聲時間為36 min。

3.3 正交試驗

根據(jù)“2.5”項試驗設(shè)計進行3因素3水平的正交試驗，試驗結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗結(jié)果

分析表2實驗數(shù)據(jù)可得，影響超聲波輔助法提取葛根中總黃酮的因素大小順序為A>C>B；該法提取總黃酮的最佳條件為A1B1C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)35%，超聲時間24 min，料液比1∶40 (g/mL)，葛根中總黃酮的浸出率達到最高。

3.4 最佳工藝條件驗證

由上述“3.3”項得知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%，超聲時間為24 min，料液比為1∶40 (g/mL)時是超聲波輔助提取普洱葛根中總黃酮的最佳工藝。在此條件下，進行3次驗證試驗，葛根總黃酮的提取率分別為2.76%，2.79%，2.73%。平均為2.76%。此結(jié)果高于最佳單因素組合和正交試驗中所得數(shù)據(jù)，說明該條件為超聲波輔助提取葛根中總黃酮的最佳工藝。

4 結(jié)果與討論

我國葛根分布廣，葛根中的黃酮類物質(zhì)有著較高的藥用價值，如何高效、快速、低成本、低耗能地提取葛根中的總黃酮成為人們研究的焦點。提取葛根總黃酮的傳統(tǒng)方法普遍存在耗時長，效率低和耗能高等問題，而超聲波輔助提取法能有效彌補傳統(tǒng)提取方法。本實驗以乙醇作為提取溶劑，研究了乙醇濃度、超聲時間和料液比3個因素對超聲波輔助提取葛根中總黃酮提取的影響，并且采用正交試驗對提取工藝進行了優(yōu)化。實驗結(jié)果表明，最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)35%，超聲時間24 min，料液比1∶40 (g/mL)，黃酮浸出率最高，為2.76%。