裸燕麥球蛋白源多肽對D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化能力的影響

付 媛，張美莉，高韶輝，張 宇

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

衰老是一個復(fù)雜的自然過程，是所有生物的共同特征。關(guān)于衰老的自由基學(xué)說是由英國人Harman[1]于1956年提出的。該學(xué)說認(rèn)為，自由基對生物體內(nèi)的大分子會產(chǎn)生極大的危害作用。隨著年齡的增長，抗氧化酶類活性下降，使體內(nèi)消除自由基的能力下降，體內(nèi)過量的自由基就會引起脂質(zhì)過氧化，損傷生物膜，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，以致機(jī)體多器官、多系統(tǒng)的功能減退，進(jìn)而導(dǎo)致疾病和衰老[2-3]。目前，清除生物體內(nèi)過量的自由基已成為抗氧化研究的核心，而天然抗氧化劑以其安全、高效的特點(diǎn)，正引起廣大學(xué)者的關(guān)注。

裸燕麥又稱莜麥[4]，在我國高寒地區(qū)糧食生產(chǎn)中占有重要地位[5]。裸燕麥?zhǔn)鞘澜绻J(rèn)營養(yǎng)價值很高的糧種之一，其富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[6]。近年來，對于燕麥蛋白來源的抗氧化劑——燕麥肽的研究報道增多。藺瑞等[7]通過Osborne法制得裸燕麥球蛋白，并利用鹽析、SephadexG-100凝膠層析、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法對其進(jìn)一步純化，得到了分子質(zhì)量分別為4.4×104、3.4×104～2.9×104、2.5×104Da的組分，并測得其對O2-·、·OH、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力都較強(qiáng)，尤其對O2-·的清除能力大于VC，顯示較高的抗氧化能力。龐小一等[8]利用堿性蛋白酶水解燕麥，再通過超濾分離，得到分子質(zhì)量小于5.0×103Da的燕麥肽，測得其對DPPH自由基清除率達(dá)80.11%。張美莉等[9]利用堿性蛋白酶對裸燕麥球蛋白進(jìn)行酶解，分別得到分子質(zhì)量為1.07×104～1.34×105Da的組分I和分子質(zhì)量為114～861 Da的組分II，并且測得這兩種組分對O2-·、·OH、DPPH自由基都具有非常強(qiáng)的清除能力。任清等[10]通過酶膜反應(yīng)器利用Alcalase酶解燕麥麩蛋白制備抗氧化肽，測得其對DPPH自由基清除率可達(dá)57.39%。徐建國等[11-12]制備燕麥抗氧化肽，并測定其對DPPH、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸陽離子自由基都具有清除作用；同時發(fā)現(xiàn)燕麥發(fā)芽過程中，燕麥肽含量及其抗氧化性均呈增加的趨勢。馬薩日娜等[13]將裸燕麥谷蛋白水解物經(jīng)過超濾處理后，獲得5 個分子質(zhì)量肽段的組分。再通過強(qiáng)酸型陽離子樹脂732對分子質(zhì)量大于3.0×104Da肽段進(jìn)行分離得到組分D，結(jié)果顯示其清除·OH的能力非常強(qiáng)（半數(shù)清除質(zhì)量濃度為1.532 mg/mL）。由此可見，裸燕麥蛋白源多肽的體外抗氧化能力非常強(qiáng)，但是，其對機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力報道得很少。本實(shí)驗以D-gal致衰老小鼠為模型，研究裸燕麥球蛋白源多肽（peptide from naked oat globulin，PNOG）在機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力及其對機(jī)體衰老進(jìn)程的影響，以期為燕麥產(chǎn)品的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸燕麥，產(chǎn)自內(nèi)蒙古武川縣，曬干、粉碎、過60 目篩，備用。健康昆明種小白鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，購自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗動物部，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蒙）2016-0001。

D-半乳糖（D-galactose，D-gal） 美國Sigma公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g） 英國BDH Chemicals公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、單胺氧化酶試劑盒、總蛋白定量測試盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP型萬分之一分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DZ-1BCII真空干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；L6S紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Epoch2多功能微孔板檢測儀 美國BioTek公司；H2500R-2高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PNOG的制備

按本實(shí)驗室前期研究方法[9]制備燕麥多肽：裸燕麥粉經(jīng)石油醚脫脂、10 g/100 mL NaCl溶液提取，在堿性蛋白酶（酶用量10 000 U/g）、底物質(zhì)量濃度5 g/100 mL、溫度60 ℃、pH 9.0條件下水解3 h，制得PNOG，冷凍干燥，備用。

1.3.2 實(shí)驗動物分組及處理

昆明種健康小鼠60 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為6 組：正常對照組，衰老模型組，PNOG低、中、高劑量治療組，VC陽性對照組。除正常對照組外，其他各組按120 mg/（kg mb·d）頸背部皮下注射D-gal，正常對照組注射等量生理鹽水；PNOG低、中、高劑量治療組每日分別灌胃PNOG 200、600、1 000 mg/（kg mb·d），VC陽性對照組每日灌胃100 mg/（kg mb·d）。每日定時灌胃、注射一次，連續(xù)6 周，期間自由飲食飲水，觀察小鼠體征表現(xiàn)，每周稱量體質(zhì)量一次[14-16]。

1.3.3 生化指標(biāo)的測定

末次給藥后禁食12 h，眼眶取血，斷頸處死，解剖小鼠，迅速取出肝、腦，用4 ℃生理鹽水沖洗表面殘血，濾紙吸干水分。臟器指數(shù)按下式計算。

小鼠血樣于4 ℃冰箱放置12 h，3 000 r/min離心20 min，取血清，檢測血清中SOD、GSH-Px及CAT的活性。分別取0.2 g肝、腦組織，剪碎后冰浴上勻漿，加入9 倍體積預(yù)冷生理鹽水配制成10%的組織勻漿液，6 000 r/min低溫離心10 min，取上清液測定小鼠各組織測定GSH-Px活性、單胺氧化酶-B（monoamine oxidase B，MAO-B）活性、MDA含量。

血清、肝、腦組織中血清中SOD、GSH-Px、CAT、MAO-B活性，MDA含量以及肝、腦組織的總蛋白含量均按試劑盒說明書測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件對結(jié)果進(jìn)行t檢驗統(tǒng)計學(xué)處理，測定結(jié)果數(shù)據(jù)均用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠的一般行為學(xué)觀察

衰老模型組連續(xù)皮下注射D-gal 3 周后，毛色逐漸變得沒有光澤且易脫落，皮膚變粗糙、沒有彈性，尾部出現(xiàn)斑點(diǎn)，精神狀態(tài)變得倦怠，體型變瘦，體質(zhì)量增加緩慢，呈現(xiàn)出明顯衰老體征。由表1可見，各組小鼠初始體質(zhì)量基本一致，無統(tǒng)計學(xué)差異；而最終體質(zhì)量中，衰老模型組小鼠體質(zhì)量極顯著低于正常對照組（P＜0.01），從體質(zhì)量增加值也可以看出，衰老模型組體質(zhì)量增長極顯著低于正常對照組（P＜0.01），表明建模成功。灌胃PNOG后，與衰老模型組相比，體質(zhì)量增量都明顯加快，中、高劑量組呈現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01），低劑量組呈現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。VC陽性對照組與衰老模型組相比體質(zhì)量增量也極顯著提高（P＜0.01）。說明灌胃PNOG可提高衰老小鼠體質(zhì)量。李薇等[17]報道的灌胃石榴籽油能顯著增加D-gal衰老小鼠體質(zhì)量，這與本實(shí)驗結(jié)果一致。

表1 PNOG小鼠體質(zhì)量的影響（n＝10）Table 1 Effect of PNOG on body mass in aging mice (n= 10)

2.2 小鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果

表2 PNOG對小鼠臟器指數(shù)的影響（n＝10）Table 2 Effect of PNOG on organ indexes in aging mice (n= 10)

從表2可以看出，衰老模型組的肝、腦組織的臟器指數(shù)明顯低于正常對照組，呈極顯著差異（P＜0.01），說明建立小鼠衰老模型成功。灌胃PNOG后，中、高劑量組的臟器指數(shù)均顯著提高（P＜0.05）。表明PNOG具有較好的拮抗肝萎縮和腦萎縮的作用。史珅等[18]研究發(fā)現(xiàn)用蘋果多酚灌胃后，小鼠肝、腦指數(shù)明顯高于衰老模型組，與本實(shí)驗的結(jié)果一致。

2.3 PNOG對小鼠血清中SOD、GSH-Px及CAT活力的影響

研究表明，人體內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng)，包括SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化酶系。SOD通過催化O2-·歧化為H2O和O2，來抑制和阻斷自由基反應(yīng)，降低自由基代謝產(chǎn)物的生成[19-21]。GSH-Px能特異地催化還原型谷胱甘肽（L-glutathione，GSH）過氧化物的還原反應(yīng)，它雖然不直接清除自由基，但是可以阻斷由過氧化物引發(fā)的自由基對機(jī)體的損害，保護(hù)細(xì)胞膜免受過氧化物的損傷[20-21]。CAT雖不能直接清除·OH，但可以降低·OH的前體——H2O2的濃度，從而起到延緩衰老的作用[22]。SOD和GSH-Px聯(lián)合作用可有效防止組織細(xì)胞過氧化損傷。GSH-Px亦可與CAT協(xié)同作用，催化對生物體有害的H2O2的分解，以減少自由基和過氧化脂質(zhì)的形成。

表3 PNOG對小鼠血清中SOD、GSH-Px及CAT活力的影響（n＝10）Table 3 Effect of PNOG on SOD, GSH-Px and CAT activities in serum of aging mice (n= 10)

由表3可知，與正常對照組相比，衰老模型組血清中SOD、GSH-Px及CAT活力均極顯著降低（P＜0.01）。灌胃PNOG后，血清中SOD、GSH-Px及CAT活力均顯著提高，與衰老模型組相比，中、高劑量組呈現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01）。VC陽性對照組血清中SOD、GSH-Px及CAT活力與衰老模型組相比也極顯著升高（P＜0.01）。表明PNOG可提高衰老小鼠血清中SOD、GSH-Px及CAT活力，提高小鼠的抗氧化能力。研究表明，當(dāng)機(jī)體遭受自由基攻擊而被氧化時，外加抗氧化劑可使機(jī)體內(nèi)抗氧化酶類活性得到提高[23-24]。馮沼潤等[25]研究顯示，灌胃天葵子水煎劑可顯著提高D-gal致衰老小鼠血清中SOD、GSH-Px及CAT活性，這與本實(shí)驗結(jié)果一致。

2.4 PNOG對小鼠肝組織中GSH-Px、MAO-B活力以及MDA含量的影響

MAO-B存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，是催化單胺氧化脫氨反應(yīng)的酶。隨著年齡的增長，MAO-B的活力不斷增加，因此MAO-B活力的增加是衰老的一個重要指標(biāo)[26]。MDA含量可直接反映組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的速率和強(qiáng)度，間接反映細(xì)胞的損傷程度，其越高，生物膜破壞越嚴(yán)重[27]。

從表4可以看出，與正常對照組相比，衰老模型組肝組織中GSH-Px活力極顯著降低、MAO-B活力及MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。灌胃PNOG后，肝組織中GSH-Px活力顯著升高，與衰老模型組相比，中、高劑量組呈現(xiàn)出極顯著差異；MAO-B活力極顯著降低；高劑量組MDA含量呈現(xiàn)出極顯著降低（P＜0.01）。VC陽性對照組與衰老模型組比較，肝組織中GSH-Px活力極顯著升高，MAO-B活力及MDA含量極顯著降低（P＜0.01）。表明PNOG可提高衰老小鼠肝組織中GSH-Px活力、降低MAO-B活力及MDA含量，提高小鼠的抗氧化能力。

表4 PNOG對小鼠肝組織中GSH-Px、MAO-B活力及MDA含量的影響（n＝10）Table 4 Effect of PNOG on GSH-Px and MAO-B activities and MDA content in liver tissue of aging mice (n= 10)

2.5 PNOG對小鼠腦組織中GSH-Px、MAO-B活性以及MDA含量的影響

表5 裸燕麥球蛋白源多肽對小鼠腦組織中GSH-Px、MAO-B活力及MDA含量的影響（n＝10）Table 5 Effect of PNOG on GSH-Px and MAO-B activities and MDA content in brain tissue of aging mice (n= 10)

由表5可以看出，與正常對照組相比，衰老模型組腦組織中GSH-Px活力極顯著降低、MAO-B活力及MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。灌胃PNOG后，腦組織中GSH-Px活力顯著升高，與衰老模型組相比，中、高劑量組呈現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01），低劑量組差異顯著（P＜0.05）；MAO-B活力極顯著降低（P＜0.01），并且隨著灌胃劑量的增加，MAO-B活力與衰老模型組差異逐漸增大；MDA含量也呈下降趨勢，高劑量組呈現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01），中劑量組呈現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。VC陽性對照組腦組織中GSH-Px活力顯著升高、MAO-B活力及MDA含量顯著降低，與衰老模型組比較，呈極顯著差異（P＜0.01）。表明PNOG可提高衰老小鼠腦組織中GSH-Px活力、降低MAO-B活力及MDA含量，提高小鼠的抗氧化能力。馬蕾等[28]報道，灌胃薔薇紅景天原花青素可顯著提高D-gal致衰老小鼠肝、腦組織中GSH-Px活力，顯著降低MAO-B活力及MDA含量，這與本實(shí)驗結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

PNOG可以有效提高D-gal致衰老小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)，增強(qiáng)小鼠血清中SOD、GSH-Px及CAT的活性，增強(qiáng)肝、腦組織中GSH-Px活性，降低肝、腦組織中MAO-B活性以及MDA含量，表明PNOG可清除衰老小鼠體內(nèi)過多的自由基，減少其對機(jī)體的損害，灌胃600～1 000 mg/（kg mb·d）PNOG與灌胃100 mg/（kg mb·d）VC的作用相當(dāng)。提示PNOG具有較強(qiáng)的清除體內(nèi)自由基的作用。