VD3與大豆分離蛋白相互作用的多重光譜分析與計(jì)算

陳 爽，王小丹，李 瑞，孫洪蕊，王喜波,，江連洲

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130000）

VD3是VD的一種重要形式[1]，可以發(fā)揮調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進(jìn)骨骼的生長，預(yù)防佝僂病、甲亢、癌癥、心血管疾病和增強(qiáng)免疫力等作用[2-4]。VD3是疏水性成分，不溶于水，對(duì)多種環(huán)境因素很敏感，在光、熱和氧氣的作用下，可以很快發(fā)生異構(gòu)化，化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功發(fā)生改變，因此將其直接加入到液體食物或飲料中是不可行的[5]。封裝技術(shù)是提高其穩(wěn)定性，保證其生物活性的理想方法[6]。近年來玉米醇溶蛋白、乳清分離蛋白、大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）及多糖等作為VD3的保護(hù)物質(zhì)，被普遍用于封裝技術(shù)。Abbasi等[7]用超聲輔助乳清分離蛋白對(duì)VD3進(jìn)行封裝，提高了VD3的水溶性和穩(wěn)定性。Lee等[8]用pH值偏移和超聲結(jié)合制備了SPI納米顆粒并對(duì)VD3進(jìn)行封裝，提高了其抵抗紫外線的能力。目前已經(jīng)有很多學(xué)者通過蛋白與VD3進(jìn)行相互作用，對(duì)VD3進(jìn)行保護(hù)，并取得一定進(jìn)展，然而鮮有VD3與SPI相互作用的報(bào)道。

熒光光譜是一種被廣泛用來探索蛋白質(zhì)與外源小分子物質(zhì)（藥物、食品添加劑、表面活性劑、染料和持久性有機(jī)污染物等）相互作用的方法[9]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光光譜詳細(xì)研究VD3與SPI相互作用的重要信息，包括猝滅類型、表觀結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合距離和作用力；運(yùn)用同步熒光和紫外-可見光譜探究VD3對(duì)SPI結(jié)構(gòu)中色氨酸殘基和酪氨酸殘基微觀環(huán)境的影響；運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜研究VD3對(duì)SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證VD3與SPI相互作用的存在，為提高VD3水溶性，制備出負(fù)載率高、穩(wěn)定性強(qiáng)的SPI-VD3納米顆粒，擴(kuò)大VD3應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)，也為開發(fā)新的大豆蛋白產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

VD3（純度＞99%） 美國Sigma公司；低溫脫脂豆粕 山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；乙醇 天津市外環(huán)化工有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純；所用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

粉碎機(jī) 中德中藥機(jī)械有限公司；N24120型電子天平 瑞士Ohaus公司；ALC-310.3型分析天平 德國ACCULAB公司；GL-21M型冷凍離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；UV-240IPC型紫外分光光度計(jì)、FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；F-4500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；79-1型磁力加熱攪拌器金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；HH-4型數(shù)顯攪拌水浴鍋 常州塞浦實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

根據(jù)Sorgentini等[10]描述的方法略作改動(dòng)制備SPI。將脫脂豆粕粉碎過60 目篩得到脫脂豆粉。將脫脂豆粉經(jīng)堿溶酸沉法制得SPI沉淀物。將沉淀物用去離子水復(fù)溶，洗滌兩次以除去殘留其中的鹽離子，然后用2 mol/L NaOH溶液將其pH值調(diào)至7.0。通過冷凍干燥機(jī)將其進(jìn)行干燥獲得SPI粉末，將其貯存于-20 ℃冰箱中備用。測得其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.12%。

1.3.2 VD3溶液的制備

為避免VD3降解，以下操作均在避光條件下進(jìn)行。稱取一定VD3粉末溶于無水乙醇，磁力攪拌以保證其完全溶于乙醇，之后將其稀釋到不同濃度，置于棕色瓶中備用。每次實(shí)驗(yàn)前需重新配制VD3溶液。

1.3.3 SPI-VD3溶液制備

將SPI粉末溶于磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）攪拌4 h配制成4 mg/mL的SPI溶液，備用。

1.3.4 熒光光譜分析

向10 mL SPI溶液（4 mg/mL）中逐漸滴加100 μL不同濃度的VD3溶液，使其中VD3終濃度分別為2.0×10-6、4.0×10-6、6.0×10-6、8.0×10-6、1.0×10-5mol/L，用漩渦振蕩器使其混合均勻，以制備SPI-VD3復(fù)合體系，并分別記為SPI-VD3-1～SPI-VD3-5。分別在293、298、306 K的水浴鍋中保溫10 min。設(shè)置激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長范圍為300～460 nm，激發(fā)狹縫為5 nm，掃描速率為12 000 nm/min，電壓為700 mV，測定內(nèi)源熒光。同步熒光光譜掃描中，室溫條件下，分別固定Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm（Δλ＝激發(fā)波長-發(fā)射波長）進(jìn)行掃描。

1.3.5 紫外-可見吸收光譜分析

以無水乙醇作空白，測定VD3及各樣品在200～500 nm波長范圍內(nèi)的紫外-可見吸收光譜。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將SPI溶液和SPI與VD3混合溶液（SPI質(zhì)量濃度為4 mg/mL，VD3質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL）冷凍干燥，將1 mg冷凍干燥后的樣品與150 mg KBr粉末混合研磨，然后在6～8 T壓力下將混合粉末壓制成固體薄片，以用于傅里葉變換紅外光譜測定。使用FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行全波段（4 000～400 cm-1）掃描，設(shè)置分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件通過方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 VD3對(duì)SPI內(nèi)源熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要依賴于色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）這3 種具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)或共軛雙鍵的氨基酸。在激發(fā)波長為290 nm時(shí)，主要反映了色氨酸和酪氨酸的熒光光譜，苯丙氨酸的作用很弱可以忽略[11]。如圖1所示，VD3的加入使SPI的熒光強(qiáng)度降低，且VD3添加量越多，熒光強(qiáng)度越低，這說明VD3對(duì)SPI產(chǎn)生了熒光猝滅，且VD3含量越高，猝滅效果越強(qiáng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)SPI的最大熒光發(fā)射波長從360.2 nm紅移至362.8 nm，紅移了2.6 nm。這可能是因?yàn)閂D3的存在導(dǎo)致SPI空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，SPI的發(fā)色基團(tuán)酪氨酸殘基和色氨酸殘基的微環(huán)境由疏水環(huán)境向親水環(huán)境轉(zhuǎn)變，蛋白分子解折疊使SPI分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)更加舒展，內(nèi)部色氨酸殘基被遮蔽因而使SPI熒光發(fā)生猝滅[12]。

圖1 VD3對(duì)SPI內(nèi)源熒光光譜的影響Fig. 1 Effect of VD3 on the fluorescence intensity of SPI

2.2 VD3-SPI復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

熒光猝滅有兩種作用機(jī)制，即動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[13]。若熒光猝滅是由猝滅劑與基態(tài)熒光通過弱的作用力形成復(fù)合物導(dǎo)致，即靜態(tài)猝滅。若熒光猝滅僅是由于猝滅劑與激發(fā)態(tài)熒光分子碰撞導(dǎo)致的，則為動(dòng)態(tài)猝滅[14]。猝滅類型可以用Stern-Volmer方程[15]進(jìn)行判斷，如公式（1）所示。

式中：F0為未加入猝滅劑VD3時(shí)SPI的熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑VD3后SPI的熒光強(qiáng)度；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；[Q]為VD3的濃度/（mol/L）；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為不添加猝滅劑時(shí)熒光體的壽命/s，蛋白的平均壽命約為10-8s

根據(jù)Stern-Volmer方程，以[Q]為自變量、F0/F為因變量作圖。VD3-SPI復(fù)合物的Ksv和Kq均可根據(jù)圖中擬合的直線斜率計(jì)算，結(jié)果見表1。對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，溫度升高會(huì)增加離子有效碰撞的數(shù)目，促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移，使熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)增大；而對(duì)于靜態(tài)猝滅，隨著溫度升高，熒光物質(zhì)與小分子形成的復(fù)合物穩(wěn)定性下降，使熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)逐漸減小[16]。本實(shí)驗(yàn)選擇293、298 K和306 K 3 個(gè)溫度，以確定猝滅常數(shù)隨溫度的變化趨勢，進(jìn)而確定VD3對(duì)SPI的猝滅類型。

由圖2可知，本實(shí)驗(yàn)中，VD3對(duì)SPI的Stern-Volmer曲線均呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，且直線的斜率隨溫度升高而減小，即猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小，因此VD3對(duì)SPI的猝滅為靜態(tài)猝滅。猝滅劑對(duì)于生物大分子最大猝滅速率常數(shù)一般為2×1010L/（mol·s）[17]，而VD3對(duì)SPI的猝滅常數(shù)數(shù)量級(jí)為1012（表1），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1010，這進(jìn)一步確定該猝滅是由VD3與SPI結(jié)合形成化合物產(chǎn)生的是靜態(tài)猝滅。

表1 SPI-VD3復(fù)合物的熒光猝滅常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 1 Quenching rate constants and correlation coefficients of SPI-VD3 complex

圖2 不同溫度條件下VD3猝滅SPI的Stern-Volmer圖Fig. 2 Stern-Volmer plots of SPI quenching by VD3 at different temperatures

對(duì)于靜態(tài)猝滅，結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可由式（2）計(jì)算。

式中：F0為未加入猝滅劑VD3時(shí)SPI的熒光強(qiáng)度；F為加入VD3猝滅劑后SPI的熒光強(qiáng)度；KA為表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；[Q]為猝滅劑的濃度/（mol/L）。

根據(jù)公式（2），以lg[Q]為自變量、lg（（F0－F））/F）為因變量作圖，將散點(diǎn)圖進(jìn)行線性擬合得到圖3，3 個(gè)不同溫度下VD3與SPI相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和表觀結(jié)合常數(shù)KA均可根據(jù)直線的斜率和截距計(jì)算得出（表2）。從表2可以看出，VD3與SPI間的表觀結(jié)合常KA數(shù)量級(jí)為104，這表明VD3與SPI在293、298、306 K這3 個(gè)溫度點(diǎn)都發(fā)生了緊密的結(jié)合。當(dāng)溫度由293 K升高到306 K時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)由0.973 3升高到1.094 2，均接近1，其受溫度影響不明顯。

圖3 不同溫度條件下VD3猝滅SPI的雙對(duì)數(shù)曲線Fig. 3 Double logarithmic curves of SPI quenching by VD3 at different temperatures

表2 SPI-VD3復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 2 Apparent binding constants, binding site numbers and correlation coefficients of SPI-VD3 complex

2.3 VD3與SPI相互作用的熱力學(xué)參數(shù)及作用力

通常小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用力有4 種，即氫鍵、靜電作用、范德華力和疏水作用力。Ross等[18]提出藥物小分子與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型可根據(jù)反應(yīng)前后體系的熱力學(xué)參數(shù)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)的相對(duì)大小進(jìn)行判斷。當(dāng)ΔH＞0、ΔS＜0時(shí)，分子間作用力主要是靜電引力和疏水作用力；當(dāng)ΔH＞0、ΔS＞0時(shí)，分子間的主要作用力為疏水作用力；當(dāng)ΔH＜0、ΔS＜0時(shí)，分子間作用力主要是范德華力、氫鍵或質(zhì)子化等作用；當(dāng)ΔH＜0、ΔS＞0時(shí)，分子間作用力主要是靜電引力[19]。本實(shí)驗(yàn)中溫度相差不大，因此焓變可視為常數(shù)[20]?？捎蒝an't Hoff方程計(jì)算出焓變?chǔ)、熵變?chǔ)和吉布斯自由能ΔG的數(shù)值并判定VD3與SPI之間的作用力類型。

式中：K為在相應(yīng)溫度下體系的結(jié)合常數(shù)；R為理想氣體常數(shù)8.314 J/（mol·K）；ΔG為吉布斯自由能/（kJ/mol）；ΔH為焓變/（kJ/mol）；ΔS為熵變/（J/（mol·K））。

通過計(jì)算得大豆蛋白與VD3相互作用的焓變?chǔ)、熵變?chǔ)和吉布斯自由能ΔG，如表3所示。

表3 VD3與SPI結(jié)合的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for interaction between VD3 and SPI

由表3可知，ΔG＜0、ΔH＞0，表明VD3與SPI之間的相互作用為自發(fā)進(jìn)行的吸熱反應(yīng)，溫度升高，將有利于反應(yīng)的進(jìn)行，該結(jié)果與結(jié)合常數(shù)KA隨著溫度升高而增大的變化趨勢相一致，進(jìn)一步確定VD3與SPI是一個(gè)吸熱過程。由ΔH＞0和ΔS＜0可說明靜電引力和疏水相互作用是使VD3與SPI形成復(fù)合物的主要作用力。

2.4 VD3與SPI的結(jié)合距離

對(duì)于藥物小分子物質(zhì)與蛋白形成的復(fù)合物，結(jié)合位置與蛋白質(zhì)分子中熒光基團(tuán)之間的距離可根據(jù)F?rster[21]理論計(jì)算得出。結(jié)合位置與蛋白質(zhì)分子中熒光基團(tuán)距離越近，蛋白質(zhì)越容易儲(chǔ)存與運(yùn)輸藥物小分子，藥物小分子則能更好地發(fā)揮其藥理作用[22]。由圖4可發(fā)現(xiàn)，SPI的熒光光譜與VD3的紫外吸收光譜發(fā)生了重疊，此時(shí)SPI與VD3之間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。各物理量符合式（6）、（7）關(guān)系。

圖4 SPI的熒光光譜與VD3的紫外吸收光譜的重疊光譜Fig. 4 Overlap of fluorescence spectrum of SPI with absorption spectrum of VD3

式中：E為能量轉(zhuǎn)移效率；R0為E為50%時(shí)臨界距離（福斯特距離）/nm；r為供體與受體的結(jié)合距離/nm。

式中：K為供體和受體各項(xiàng)隨機(jī)分布的取向因子，本實(shí)驗(yàn)中取K2為2/3；n為介質(zhì)折射指數(shù)，取水和有機(jī)物平均值1.336；ΦD為給體的熒光量子產(chǎn)率，取值0.15；J為供體的發(fā)射光譜與受體的紫外吸收光譜二者重疊積分（式（8））。

式中：FD（）為供體在 至+d波數(shù)間隔內(nèi)的校正熒光強(qiáng)度，熒光總強(qiáng)度歸一化為1；εA（）為受體在波數(shù) 的摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm））。

能量轉(zhuǎn)移效率E可用公式（9）計(jì)算。

根據(jù)圖4的光譜圖求出積分J，并確定E、K2和n，則R0和r均可被求出。

圖4為SPI的熒光光譜和VD3的紫外吸收光譜，先將熒光總強(qiáng)度歸一化為1，然后將光譜重疊部分分割成極小的矩形，通過式（8）求得重疊積分J（ν）＝8.84×10-15。

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，將K2＝2/3、n＝1.336、ΦD＝0.15和J（ν）＝8.84×10-15代入式（7），求得臨界距離R0＝2.50 nm。再將F＝844、F0＝606帶入式（9）計(jì)算得到能量轉(zhuǎn)移效率E＝0.282。經(jīng)式（6）求得VD3距色氨酸殘基的最短距離r＝2.92 nm。已知臨界距離最大范圍是5～10 nm，給體和受體間結(jié)合最大距離范圍是7～10 nm[23]，R0＜5 nm，r＜7 nm說明VD3與SPI足夠靠近，其結(jié)合是通過非輻射能力轉(zhuǎn)移而促使蛋白質(zhì)的熒光猝滅。

2.5 VD3與SPI相互作用的同步熒光光譜分析結(jié)果

由于同步熒光光譜的最大發(fā)射波長的紅移或藍(lán)移可以反映氨基酸殘基周圍微環(huán)境的極性變化，其常被用于研究蛋白質(zhì)與藥物分子之間相互作用[24]。分別固定激發(fā)和發(fā)射單色器的波長差Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm，進(jìn)行同步熒光光譜掃描，可得到反映酪氨酸殘基和色氨酸殘基微觀環(huán)境變化的熒光特征光譜[25]。

圖5 SPI-VD3體系的同步熒光光譜Fig. 5 Synchronous fluorescence spectra of SPI-VD3 at room temperature

由圖5可知，隨著VD3含量的增加，兩個(gè)同步熒光光譜圖的熒光強(qiáng)度均降低，且其最大吸收波長均有紅移。酪氨酸殘基（Δλ＝15 nm）的最大吸收波長由300 nm紅移至301 nm，紅移1 nm，色氨酸殘基（Δλ＝60 nm）最大吸收波長由294 nm紅移至294.6 nm，紅移0.6 nm。該結(jié)果說明VD3與SPI相互作用使酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍的疏水環(huán)境減弱，導(dǎo)致SPI構(gòu)象發(fā)生改變且酪氨酸殘基的紅移距離比色氨酸的大，VD3與SPI的結(jié)合位點(diǎn)更接近酪氨酸殘基[26]。

2.6 VD3與SPI相互作用的紫外-可見光譜分析結(jié)果

紫外-可見吸收光譜法是用于表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化及蛋白質(zhì)-小分子復(fù)合物相互作用的常用方法之一。一般來說，峰強(qiáng)度變化大小與兩者相互作用強(qiáng)弱有關(guān)，而峰位的改變通常是因?yàn)樾》肿优c蛋白質(zhì)相互作用使生色團(tuán)周圍微環(huán)境改變[27]。圖6顯示了不同濃度VD3對(duì)SPI紫外-可見吸收光譜的影響，隨著VD3濃度的增加，SPI的紫外-可見光吸收光譜吸光度逐漸增強(qiáng)，最大吸收峰波長由259 nm紅移至262 nm，紅移了3.0 nm。說明VD3與SPI發(fā)生了相互作用，使SPI芳香族氨基酸所處的微環(huán)境發(fā)生了變化，VD3誘導(dǎo)SPI肽鏈伸展，造成了SPI構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而增強(qiáng)了吸光度。

圖6 VD3對(duì)SPI紫外-可見吸收光譜的影響Fig. 6 Effect of VD3 on the UV-Vis absorption spectrum of SPI

2.7 VD3與SPI相互作用的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖7 VD3對(duì)SPI傅里葉變換紅外光譜的影響Fig. 7 Effect of VD3 on the Fourier transform infrared spectrum of SPI

傅里葉變換紅外光譜法是一種研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化的常用技術(shù)[28]。其中在酰胺I區(qū)（1 700～1 600 cm-1，主要是C＝O伸縮）和酰胺II區(qū)（1 600～1 500 cm-1，C—N伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)）范圍內(nèi)紅外吸收峰的變化可以反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[29]。由圖7可知，VD3加入后降低了酰胺I區(qū)和酰胺II區(qū)的透光率，且均使酰胺I區(qū)和酰胺II區(qū)發(fā)生了不同程度的紅移。VD3的加入引起SPI酰胺I區(qū)從1 632.93 cm-1藍(lán)移至1 631.96 cm-1，酰胺II區(qū)從1 531.28 cm-1紅移至1 533.13 cm-1，說明VD3使SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過熒光光譜法研究了VD3與SPI之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)VD3會(huì)與SPI結(jié)合產(chǎn)生復(fù)合物而造成靜態(tài)猝滅，在3 個(gè)溫度下均形成了結(jié)合位點(diǎn)接近1的復(fù)合物，VD3與SPI之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用，結(jié)合時(shí)通過非輻射能力轉(zhuǎn)移而促使蛋白質(zhì)的熒光猝滅。二者之間的反應(yīng)為自發(fā)的吸熱反應(yīng)，作用力主要為靜電相互作用和疏水相互作用。VD3的加入使熒光光譜、同步熒光光譜和紫外-可見光譜中樣品的最大吸收波長均發(fā)生紅移，表明SPI中芳香族氨基酸色氨酸殘基和賴氨酸殘基所處的微觀環(huán)境發(fā)生改變，使SPI的分子構(gòu)象發(fā)生改變，SPI肽鏈更加延展。傅里葉變換紅外光譜表明VD3引起SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。