CYP450電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用進(jìn)展*

黎夏彤，裴新月，樊 璨，王 詩

(湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

藥物代謝是藥物在體內(nèi)產(chǎn)生藥效、毒性和失效的主要過程，細(xì)胞色素P450(CYP450)作為人體和生物體內(nèi)一類重要的氧化還原蛋白酶，參與約90%常用藥物的代謝和轉(zhuǎn)化[1]。而且CYP450廣泛的基因多態(tài)性是造成臨床不同個(gè)體間藥物代謝差異的主要原因之一[2]。因此，研究和探索CYP450介導(dǎo)的藥物代謝，對于新藥的設(shè)計(jì)和開發(fā)、治療藥物監(jiān)測及精準(zhǔn)醫(yī)療都具有十分重要的意義。目前研究藥物代謝的方法有體內(nèi)代謝法和體外代謝法，體內(nèi)代謝法需要消耗大量的動(dòng)物和樣品，并且人體的內(nèi)環(huán)境較為復(fù)雜，差異性明顯。體外代謝法是通過在體外模擬生理環(huán)境進(jìn)行代謝反應(yīng)，直接觀察代謝CYP450對藥物的選擇性代謝，確定藥物代謝途徑及結(jié)構(gòu)變化。體外代謝常用的方法有液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、代謝模擬法、熒光檢測等，熒光檢測方法可以實(shí)現(xiàn)藥物的高通量篩選，但是需要熒光探針，涉及試劑種類繁多；而其它方法也具有耗時(shí)長、平行檢測數(shù)量有限、過程繁瑣等不足。因此，研究出一種簡單方便、穩(wěn)定性好、靈敏度高的分析技術(shù)對CYP450在藥物代謝方面的研究具有重要意義。但生物體內(nèi)CYP450的催化反應(yīng)需在電子供體NAD(P)H的協(xié)同下才能完成，因此，體外代謝研究中面臨NAD(P)H的再生及CYP450酶體系穩(wěn)定性有限的問題[3]。考慮到電化學(xué)是用于引發(fā)氧化反應(yīng)的經(jīng)典手段，科研人員嘗試將CYP450固定在電極表面[4-5]構(gòu)建CYP450電化學(xué)生物傳感器，由電極替代NAD(P)H直接為CYP450提供電子，通過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)來探究CYP450催化的體外藥物代謝[6]。

電化學(xué)生物傳感器是一種對生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測的儀器。酶生物傳感器是將敏感材料酶作為識(shí)別元件，通過電化學(xué)裝置轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)對物質(zhì)的測定分析。1967年，Updike等[7]采用聚丙烯酰胺膠體將葡萄糖氧化酶固載在電極上，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖酶電極的測定功能，研制出世界上第一支葡萄糖傳感器。從此，酶生物傳感器的研究得到了快速的發(fā)展，先后經(jīng)歷了以天然物質(zhì)和電子作為媒介體，到電極與酶之間無媒介體直接進(jìn)行電子傳遞的過程。Kazlauskaite等[8]1996年報(bào)道了第一個(gè)CYP450在電極上直接電子轉(zhuǎn)移。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，酶生物傳感器被廣泛用于藥物檢測中。影響電化學(xué)酶生物傳感器檢測藥物的關(guān)鍵因素是電子與酶的耦合效率，通過電極傳遞的所有電子參與催化代謝反應(yīng)而不進(jìn)行其他非特異性反應(yīng)，因此，提高酶與底物的耦合效率對于CYP450的催化效率至關(guān)重要。我們主要對近幾年CYP450在電化學(xué)生物傳感器方面不同的構(gòu)建方法以及在藥物代謝中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 CYP450電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建

1.1 基于裸電極的CYP450電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建

將CYP450直接吸附到未經(jīng)過修飾的電極上，如石墨電極、玻碳電極、金電極等構(gòu)建酶生物傳感器，是較為原始的構(gòu)建方法。Fleming等[9]將P450 1991A2直接吸附到熱解石墨電極上，在Em值為-132mV處有一對可逆的氧化還原峰，KS值高達(dá)(550±50)s-1，但沒有產(chǎn)物形成。Fantuzzi等[10]將P450 2E1直接吸附到裸玻碳電極上，在Em值(-90±5)mV處有一對明顯的氧化還原峰，KS為5s-1，但是對底物對硝基苯酚沒有電催化作用。Ducharme等[11]發(fā)現(xiàn)巰基對金有很高的親和力，通過P450表面的半胱氨酸巰基與金原子之間形成共價(jià)鍵固定P450酶，然而這種酶與金電極直接連接的固定會(huì)導(dǎo)致酶失活。在裸電極上直接吸附酶構(gòu)建生物傳感器，大多數(shù)都有電化學(xué)效應(yīng)，電極與酶直接接觸能發(fā)生電子傳遞，然而這種直接吸附可能會(huì)導(dǎo)致一部分酶失活，從而不能發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)或者電催化能力弱。

1.2 基于薄膜的CYP450電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建

酶生物傳感器構(gòu)建成功的關(guān)鍵在于酶被固定在電極上仍然能保持活性并且不變性，通常是利用酶與電極之間的特殊層或膜來保持酶的自然狀態(tài)。目前大多數(shù)CYP450電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建是利用不同的化合物來創(chuàng)建這樣的一層膜，包括導(dǎo)電聚合物、殼聚糖或脂類等物質(zhì)。在聚合物中使用包埋法能夠固定電極上的CYP450并增強(qiáng)它們的電活性，從而減少酶的流失。Sugihara等[12]采用聚吡咯法將P450cam固定在氧化銦錫(ITO)電極上，并對其活性進(jìn)行電化學(xué)控制。結(jié)果表明，在ITO電極上固定P450cam不變性，且CYP450cam的數(shù)量易于控制，該電極能催化樟腦為代謝產(chǎn)物羥基樟腦。Dai等[13]研究了新型環(huán)氧共聚物P(GMA-co-MPC)與乙炔黑組成的復(fù)合膜修飾玻碳電極固定CYP3A4，P(GMA-co-MPC)/AB/CYP3A4/GCE對己烯雌酚具有較高的電催化效果。乙炔黑是一種很好的導(dǎo)電材料，與共聚物形成復(fù)合材料既能保持酶不變性而且還能顯著加速CYP450與電極之間的電子轉(zhuǎn)移。

殼聚糖是一類具有良好成膜性和生物相容性的材料，將一些導(dǎo)電性物質(zhì)加入該生物膜中，既能保持酶活性，又能加快酶與電子之間的速度。石墨烯是一種很好的導(dǎo)電性物質(zhì)，與殼聚糖形成復(fù)合膜能顯著提高酶傳感器的性能。盧菊生等[14]用殼聚糖(CS)修飾石墨烯(GR)形成的復(fù)合納米膜GR/CS，通過一鍋煮化學(xué)還原的方法得到GR/CS/Au，先利用戊二醛作為交聯(lián)劑，將CYP1A2共價(jià)連接在GR/CS/Au復(fù)合膜的氨基上，然后以羰基二咪唑作為羥基的活化劑，將CYP3A4共價(jià)連接到復(fù)合膜的羥基上，在GR/CS/Au復(fù)合膜上構(gòu)建1010型雙酶復(fù)合體。這種修飾方法對CYP1A2和CYP3A4均有良好的電化學(xué)活性，同時(shí)雙酶復(fù)合體對底物氯吡格雷有很好的電催化作用，可以進(jìn)行級聯(lián)代謝。

酯類物質(zhì)能為CYP450提供良好的生物微環(huán)境，固定在電極上能使酶不容易失活，被廣泛用來構(gòu)建酶傳感器。Gong等[15]研究了重組CYP55B1固定在磷酸二十六烷酯(DHP)膜上在EPG電極上的直接電化學(xué)，循環(huán)伏安法測量結(jié)果顯示有很好的氧化還原峰，在-0.50V出現(xiàn)還原峰，-0.45V出現(xiàn)氧化峰。Wu等[16]用蒙脫土(nano-SWy-2)和二十六烷基磷酸酯(DHP)復(fù)合膜在EPG電極固定大鼠CYP1A1。CYP1A1-nano-SWy-2-DHP/EPG有明顯的峰電流，異相電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)(KS)為46.8s-1。此外，Bavishi等[17]將CYP79A1，CYP71E1重組在包含有酯類的納米圓盤固定在金電極上，納米圓盤可以為膜蛋白提供一個(gè)類似于天然膜的環(huán)境。用循環(huán)伏安法進(jìn)行測量，結(jié)果顯示CYP79A1在(80±5)mV vs Ag/AgCl有一對很好的可逆氧化還原峰，CYP71E1在(72±5)mV vs Ag/AgCl有一對很好的氧化還原峰。CYP79A1的KS為1.4s-1，CYP71E1的KS為1.8s-1。

近年來仿生傳感器的開發(fā)也為酶提供了生物樣環(huán)境，將酶直接固定在一些具有生物膜性材料的電極上，在保持酶活性的同時(shí)也節(jié)約了成本。Yan等[18]把強(qiáng)吸電子基氟原子引入卟啉分子作為CYP450模型，合成了聚合膜FeTFPP。將導(dǎo)電性物質(zhì)還原氧化石墨烯rGOFeTFPP合成rGO-poly(FeTFPP)增加導(dǎo)電性，構(gòu)建rGO-poly(FeTFPP)/GCE傳感器。這種酶電化學(xué)生物傳感器對底物多巴胺表現(xiàn)出良好的電化學(xué)催化作用，穩(wěn)定性好，靈敏度高，有較好的應(yīng)用前景。

1.3 基于納米材料的CYP450電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建

納米粒子具有較大的比表面積，可以提高酶、蛋白質(zhì)等生物分子的固定量，加快電子傳遞速率，提高傳感器的靈敏度。同時(shí)，由于納米顆粒具有良好的生物兼容性，還可以使固定于載體上的這些生物分子保持較好的的活性[19]。

納米金由于尺寸小、比表面積大、吸附力強(qiáng)，以及良好的生物相容性、導(dǎo)電性等，在電化學(xué)酶傳感器中具有廣泛的應(yīng)用[20]。Wang等[21]將金納米自組裝在半導(dǎo)體SnO2電極上形成單層，細(xì)胞色素C吸附在此電極上進(jìn)行了直接電化學(xué)研究，不僅提高了酶與電極表面電接觸效率，還對葡萄糖有良好的電催化作用。Rua等[22]采用兩種不同的固定化策略對酶進(jìn)行電化學(xué)檢測，陽離子聚合物聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)修飾玻碳電極固定CYP4502D15得到GC/PDDA/2D15，同時(shí)金納米粒子(AuNPs)修飾玻碳電極得到GC/AuNPs/2D15，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GC/PDDA/2D15沒有電催化能力，而AuNPs存在時(shí)，GC/AuNPs/2D15電流的大小幾乎高出4倍，而且GC/AuNPs/2D15能夠使美托洛爾羥基化。金納米顆粒有很好的特性，有效擴(kuò)大了電極表面電信號(hào)[23]，加速酶與電極之間的電子轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)對底物的催化。Liu等[24]將金納米粒-殼聚糖復(fù)合物在玻碳電極上固定CYP2B6的方法也可以提高電子轉(zhuǎn)移速率。在除氧溶液中，對CYP2B6/AU-殼聚糖修飾的GCE觀察到一對穩(wěn)定的氧化還原峰-0.433V/-0.457V。加入底物有又明顯的還原峰，對底物進(jìn)行了測定，并用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，說明該傳感器的靈敏度較高、穩(wěn)定性較好。

碳納米管具有優(yōu)良的生物兼容性和較高的比表面，固定在電極上能加速酶與電極之間的電子轉(zhuǎn)移速率，提高CYP450電化學(xué)生物傳感器的檢測性和穩(wěn)定性，對提高靈敏度和降低檢測限也有很大的影響。Baj-Rossi等[25]將碳納米管通過滴鑄法沉積在碳糊絲網(wǎng)印刷電極上，形成三維多孔納米結(jié)構(gòu)。對底物環(huán)磷酰胺、依托泊苷、異環(huán)磷酰胺表現(xiàn)出良好的催化效應(yīng)，靈敏度范圍為8～925nA/μmol/L。Carrara等[26]在絲網(wǎng)印刷電極上滴鑄多壁碳納米管用于固定不同亞型的酶構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，用修飾的電極固定CYP4503A4測定環(huán)磷酰胺，其靈敏度從0.26nA/μmol/L mm2提升到0.63nA/μmol/L mm2，檢測限從59μmol/L降低到12μmol/L；還用CYP4502C9測定萘普生，靈敏度從0.11nA/μmol/L mm2升到0.25nA/μmol/L mm2，檢測限從187μmol/L降低到82μmol/L。

另外，新型納米材料和技術(shù)的應(yīng)用，也可以用來構(gòu)建酶電化學(xué)生物傳感器，使其靈敏度和穩(wěn)定性更好。納米材料一般尺寸小，能使傳感器更微型化。由于ZnO納米線(ZnONW)具有獨(dú)特的疏水特性，為生物分子的固定化提供了理想的“微環(huán)境”，能應(yīng)用到酶傳器構(gòu)造中。Wang等[27]對單個(gè)ZnONW器件進(jìn)行壓電效應(yīng)增強(qiáng)藥物代謝和傳感的研究，該裝置通過用ZnONW固定CYP2C9，有效刺激了甲苯甲酰胺的代謝，不僅可以提高代謝效率，還可以提高靈敏度。此外，通過高效液相色譜法(HPLCMS)分析表明，該代謝過程成功地從甲苯甲酰胺生成了4-羥基甲苯甲酰胺。Llaudet等[28]建立了一種新的蛋白質(zhì)固定化方法，用于確定酶的定向和電子傳遞，無需表達(dá)后修飾。為了提高固定化CYP450的面積密度，提出了一種基于溶膠-凝膠的三維固定化方案，該方案由導(dǎo)電聚合物聚(3，4-乙基二氧噻吩)(PEDOT)連接的碳納米管(CNT)組成，設(shè)計(jì)了在溶膠-凝膠基體中使用有線碳納米管來形成三維電極系統(tǒng)，對BM3及其突變體進(jìn)行了電化學(xué)酶活性檢測，該方法能提高固定化酶的活性。量子點(diǎn)又稱半導(dǎo)體納米晶，具有高比表面積、高表面活性及小尺寸等特點(diǎn)，對外界的光、電、溫度等十分敏感，作為電極的表面修飾劑可以增加固定的分子量，靈敏度高，響應(yīng)速度快。Xu等[29]通過CYP2C9功能化修飾CdTe量子點(diǎn)，固定在氧化銦錫電極上，陰極光電流明顯增大，表明光能誘導(dǎo)電子從QD轉(zhuǎn)移至CYP2C9。

2 CYP450電化學(xué)生物傳感器在藥物代謝的應(yīng)用

Asturias-Arribas等[30]采用共價(jià)鍵結(jié)合的方法將CYP2D6固定在絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上，用計(jì)時(shí)安培法測定可卡因，該傳感器的靈敏度較高、穩(wěn)定性好，線性濃度范圍為4.9～45.4μmol/L，并可成功應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測。Cui等[31]用聚乙烯亞胺-石墨烯納米復(fù)合材料(PEI-RGO)在玻碳電極上固定CYP2D6，制得CYP2D6/PEI-RGO/GCE電化學(xué)生物傳感器，該傳感器對曲馬多顯示了很好的催化效果，米氏常數(shù)為23.85μmol/L，還測定了美托洛爾KM為9.88μmol/L，苯乙雙胍KM為26.22μmol/L，非那西汀KM為43.46μmol/L。Mi等[32]采用1-芘丁酸修飾的氮摻雜石墨烯納米復(fù)合材料(PB-NGnanocomposites)在玻碳電極(GCE)上固定CYP1A1構(gòu)建CYP1A1/PB-NG/GCE傳感器，并對底物苯并[a]芘(B[a]P)檢測，KM值25.6μmol/L。Cui等[33]通過靜電吸附酶在二氧化鈦納米管陣列(TNAs)的內(nèi)壁構(gòu)建一個(gè)納米管陣列酶的反應(yīng)器(CYP2C9/Au/TNA)，隨著底物甲苯磺丁脲濃度的增加，電化學(xué)效應(yīng)增大，KM值4.8μmol/L，檢測限為0.52μmol/L。Yan等[34]將導(dǎo)電性物質(zhì)還原氧化石墨烯(rGO)引入聚合膜(FeTFPP)中合成rGO-poly(FeTFPP)，構(gòu)建rGO-poly(FeTFPP)/GCE傳感器，該電化學(xué)生物傳感器具有靈敏度較高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，能夠?qū)Χ喟桶愤M(jìn)行檢測，線性濃度范圍為0.05～300μmol/L，檢測限為0.023μmol/L。

3 總結(jié)和展望

肝臟是人體主要的代謝器官，大多數(shù)藥物進(jìn)入人體后需經(jīng)肝臟代謝才能排出體外，而CYP450是肝微粒體中重要的酶，因此，構(gòu)建CYP450電化學(xué)生物傳感器對藥物代謝進(jìn)行檢測具有非常重要的意義。我們綜述了近幾年來CYP450在電化學(xué)生物傳感器中的構(gòu)建方法，以及在藥物代謝中的應(yīng)用。今后，CYP450直接固定在生物膜性材料的電極上進(jìn)行電子傳遞和催化代謝，將成為科研領(lǐng)域的熱點(diǎn)，不僅可以解決酶失活的問題，還能降低成本，節(jié)約資源。不同方法構(gòu)建的酶電化學(xué)生物傳感器也為不同種類的藥物代謝的檢測提供廣闊的應(yīng)用前景。