間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體抗炎免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展*

周 娟， 熊 偉， 尹云玉， 修光輝， 孫 潔， 凌 斌

昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，昆明650032

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，不僅能促進(jìn)損傷組織的再生修復(fù)，還具有一定的抗炎及免疫抑制作用。然而，移植后的MSC存活數(shù)量有限，存活期短，定向分化為受損細(xì)胞起到直接修復(fù)作用的能力非常有限。而間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(mesenchymal stem cell derivrd exosomes，MSC-Exo)通過攜帶各種生物活性因子(mRNA、microRNA、細(xì)胞因子、趨化因子、免疫調(diào)節(jié)因子等)，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞表型、功能和歸巢，抑制炎癥，對促進(jìn)損傷組織修復(fù)起主要作用[1]。目前，MSC-Exo作為無細(xì)胞療法逐步替代MSC，被廣泛用于治療各種自身免疫性及炎癥性疾病，如：系統(tǒng)性硬化癥[2]、自身免疫性肝炎[3]、炎癥性腸病[4]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[5]、骨關(guān)節(jié)炎[6]、膿毒癥[7]等。但是MSC-Exo抗炎免疫調(diào)節(jié)機(jī)制還不完全清楚，本文就近5年有關(guān)MSC-Exo抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)及臨床研究做一綜述。

1 外泌體的概念與生物學(xué)特性

外泌體(exosomes)是一種細(xì)胞內(nèi)吞來源的直徑在30～100 nm之間的細(xì)胞外囊泡。于1983年首次于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[8]，起初僅被看作是細(xì)胞清除代謝廢物的手段未被重視，直到20世紀(jì)90年代末，研究發(fā)現(xiàn)外泌體可能是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，才重新激起人們對外泌體研究的興趣。外泌體細(xì)胞來源廣泛，如：腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板以及干細(xì)胞等。外泌體攜帶與細(xì)胞來源相關(guān)的多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，能作為信號分子傳遞給其他細(xì)胞參與細(xì)胞活動的重要調(diào)控[9]。幾乎所有外泌體都含有參與膜轉(zhuǎn)運和融合的蛋白質(zhì)(如Rab GTPases、flotillin、膜聯(lián)蛋白)、參與多泡體生物合成的蛋白(如Alix、TSG101)、熱休克蛋白(如HSP60、HSP70、HSP90)、四跨膜蛋白(如CD63、CD9、CD81和CD82)等[10]。

2 MSC-Exo的生物學(xué)功能

MSC不同于其他細(xì)胞的特殊之處即具有強(qiáng)大的自我復(fù)制功能和多向分化潛能，具有低免疫源性和免疫調(diào)節(jié)特性，被越來越多地應(yīng)用于自身免疫病動物及臨床實驗中[11]。MSC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的具體機(jī)制還不是特別清楚，目前的觀點：MSC通過旁分泌細(xì)胞因子，在細(xì)胞膜上表達(dá)連接蛋白Fas配體，與細(xì)胞直接接觸導(dǎo)致活化的T細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)受體細(xì)胞免疫耐受以及改善自身免疫細(xì)胞表型而發(fā)揮作用[12-13]。

由于應(yīng)用MSC存在很多不可忽視的問題，如生物安全問題、長期保存與運輸問題、非治療目的分化等[14]?；谝陨县酱鉀Q的問題，尋找替代干細(xì)胞的治療途徑顯得尤為重要。最近幾年研究人員把注意力轉(zhuǎn)向一種特殊的旁分泌機(jī)制——外泌體[15]。相關(guān)研究顯示，MSC-Exo具有源細(xì)胞的生物學(xué)特性、選擇性組裝、靶向性投遞、高效修復(fù)受損組織、安全性高、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存等優(yōu)點，作為運載MSC多種分泌產(chǎn)物的載體參與了MSC與損傷細(xì)胞之間的細(xì)胞通訊，起到關(guān)鍵信使的作用[16]。外泌體攜帶的酶以及化學(xué)物質(zhì)可長期不被降解，無潛在毒性；PBS重懸后可于-80℃保存6個月，且生物化學(xué)活性不受影響，用于治療疾病具有一定的安全性[17]。

MSC-Exo電鏡下呈橢圓或碟狀的囊泡結(jié)構(gòu)，直徑約40～100 nm，密度為1.13～1.19 g/mL[18]。MSC-Exo內(nèi)含多種蛋白質(zhì)成分、MSC膜脂質(zhì)成分，能與親脂性染料PKH26結(jié)合，并表達(dá)MSC表面粘附特異性分子CD44、CD29、CD105及外泌體相關(guān)蛋白質(zhì)，如CD9、CD63、CD81、Alix等[18-19]。應(yīng)用Western blot法和流式細(xì)胞術(shù)檢測外泌體表面蛋白標(biāo)志物和特異性蛋白標(biāo)志物可鑒定外泌體。目前，MSC-Exo主要通過超速離心法、超濾法、密度梯度離心法、免疫磁珠法、色譜法及試劑盒法等方法分離并提純[20-21]。超速離心法是目前外泌體分離的“金標(biāo)準(zhǔn)”，由于其提取的外泌體形態(tài)均勻，蛋白濃度高，并且純度相對較高，不存在未知的潛在雜質(zhì)污染，可以大量的提取，滿足實驗的基本需求，利于后續(xù)的實驗研究，并且基于不同來源MSC-Exo的生物學(xué)特點，發(fā)明了各種不同改良方式，在實際工作中已被廣泛運用。

雖然MSC來源不同(如來源于骨髓、脂肪、胎盤、臍帶等)，可將MSC-Exo進(jìn)一步分為更多的亞類，但是它們所分泌的外泌體具有共同的特性。MSC-Exo通過攜帶不同的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA(包括lncRNA、microRNA、siRNA、mRNA等)，將囊泡內(nèi)的生物學(xué)活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞，參與體內(nèi)多種生物學(xué)活動，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)細(xì)胞再生等[22]。

3 抗炎免疫調(diào)節(jié)功能

3.1 減輕炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)是多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，在炎癥過程中損傷因子的釋放造成組織和細(xì)胞的破壞，MSC-Exo通過攜帶各種抗炎相關(guān)細(xì)胞因子，發(fā)揮抗炎效應(yīng)。研究表明，MSC-Exo可抑制TLR4-MyD88-NF-κB途徑，降低炎癥微環(huán)境中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12水平，升高抗炎因子IL-10、TGF-β水平[23]，改善心肌梗死、急性肺損傷、膿毒癥等疾病的預(yù)后。炎癥及缺血微環(huán)境加劇急性心肌梗死進(jìn)程，血管生成在組織修復(fù)中起至關(guān)重要的作用，Teng等[24]研究發(fā)現(xiàn)，局部注射骨髓MSC-Exo，能明顯降低梗死心肌的炎癥細(xì)胞浸潤及促進(jìn)新生血管形成，恢復(fù)血流，改善心功能。人脂肪MSC-Exo通過攜帶高表達(dá)的miR-125a，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成[25]。脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后的炎癥反應(yīng)通過NF-κB途徑誘導(dǎo)A1型神經(jīng)毒性星形膠質(zhì)細(xì)胞活化是加劇脊髓損害的關(guān)鍵，將骨髓MSC-Exo與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，可明顯降低A1型毒性星形膠質(zhì)細(xì)胞比例，靜脈注射骨髓MSC-Exo，病灶中A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞比例及P65陽性細(xì)胞核比例明顯降低，炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)明顯減少，而髓鞘堿性蛋白(MBP)，突觸素(Syn)和神經(jīng)元核(NeuN)表達(dá)則明顯升高[26]。MSC-Exo的抗炎作用在Cosenza等[6]研究的小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型實驗中進(jìn)一步被證實，實驗結(jié)果顯示，TGF-β3預(yù)處理的骨髓MSC-Exo有明顯的軟骨保護(hù)作用，可明顯升高TGF-β3預(yù)處理的軟骨細(xì)胞合成代謝標(biāo)記基因ACAN、COL1、COL2B表達(dá)，降低分解代謝、炎癥標(biāo)記基因MMP-13、ADAMTS5、iNOS表達(dá)。miR-146a是眾所周知的具有抗炎作用的microRNA，在MSC-Exo中高表達(dá)，調(diào)節(jié)靶組織IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1和CCL-5等炎癥因子水平[27]。IL-1β預(yù)處理人臍帶MSC，可明顯上調(diào)外泌體中的miR-146a表達(dá)，降低外周血促炎因子IL-6、TNF-α表達(dá)，上調(diào)抗炎因子IL-10表達(dá)，改善肝臟、肺臟、腎臟的炎性損傷，降低膿毒癥小鼠的死亡率[27]。骨髓MSC-Exo還高表達(dá)miR-223，傳遞到受損心肌，下調(diào)Sema3A和STAT3表達(dá)，降低心肌組織炎癥因子水平，減輕膿毒癥心肌損傷[7]。人臍帶MSC-Exo通過抑制STAT3信號通路，使肺內(nèi)miR-17表達(dá)上調(diào)，miR-204表達(dá)下調(diào)，降低促炎因子單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)和缺氧誘導(dǎo)的有絲分裂因子水平，抑制血管重塑和低氧性肺動脈高壓[28]。另外，將人臍帶MSC-Exo注入炎癥性腸病(IBD)小鼠體內(nèi)，小鼠結(jié)腸組織和脾臟中IL-10、TGF-β基因表達(dá)增加，IFN-γ、TNF-α、IL-1β，IL-6、iNOS和IL-7基因表達(dá)降低，炎癥性腸病嚴(yán)重程度明顯降低[4，29]。

3.2 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型及功能

在許多炎性疾病中，MSC-Exo有明顯的抑制巨噬細(xì)胞活化的作用，誘導(dǎo)促炎表型M1向抗炎表型M2的轉(zhuǎn)換。在心肌梗死模型中，骨髓MSC-Exo可通過激活NF-κB及AKT1/AKT2途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，表現(xiàn)為CD11b、iNOS表達(dá)降低，CD206、ArgI表達(dá)升高，減輕梗死后炎癥及心肌細(xì)胞凋亡[30]。Deng等[31]又發(fā)現(xiàn)，人脂肪MSC-Exo可通過激活S1P/SK1/S1PR1途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，減少缺氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡及TGF-β1誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞纖維化，改善心肌梗死后的心臟纖維化和炎癥反應(yīng)。動脈粥樣硬化是脈管系統(tǒng)的慢性炎性疾病，Li等[32]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射的骨髓MSC-Exo，可定向遷移到動脈粥樣硬化斑塊并選擇性地在巨噬細(xì)胞附近聚集，通過miR-let7/IGF2BP1/PTEN途徑大大減少巨噬細(xì)胞在斑塊中的浸潤，并且通過miR-let7/HMGA2/NF-kB途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化，減少動脈粥樣硬化斑塊面積。肺泡巨噬細(xì)胞和浸潤的單核細(xì)胞在肺部炎癥和纖維化的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，Mansouri等[33]發(fā)現(xiàn)骨髓MSC-Exo可使單核細(xì)胞向免疫抑制及抗炎表型轉(zhuǎn)化，對肺泡細(xì)胞進(jìn)行分析，骨髓MSC-Exo可升高肺纖維化小鼠肺泡總巨噬細(xì)胞(CD45+CD11b-CD11c+CD64+)比例和非經(jīng)典單核細(xì)胞(CD45+CD11b+MHCⅡ-CD64lo/intCCR-2-Ly6clo)比例，降低促炎經(jīng)典單核細(xì)胞(CD45+CD11b+MHCⅡ-CD64lo/intCCR-2+Ly-6chi)比例。有趣的是，在骨髓細(xì)胞分析中也發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果，注射骨髓MSC-Exo預(yù)處理的骨髓來源的單核細(xì)胞也可明顯改善肺纖維化的膠原沉積及炎癥反應(yīng)，使LPS誘導(dǎo)的脾源性F4/80+巨噬細(xì)胞低表達(dá)CD86、MHCⅡ及CD40，TNF-α釋放減少，IL-10釋放增加。IL-1β預(yù)處理的臍帶MSC，可明顯上調(diào)外泌體中的miR-146a，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M2極化，有效增強(qiáng)MSC的免疫調(diào)節(jié)特性[34]。在高氧誘導(dǎo)的支氣管肺發(fā)育異常新生小鼠中，MSC-Exo同樣可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2極化，改善高氧誘導(dǎo)的炎癥及免疫異常[35]。此外，骨髓MSC-Exo還可使結(jié)腸炎模型小鼠巨噬細(xì)胞向M2極化，并使巨噬細(xì)胞進(jìn)入結(jié)腸組織減少，維持屏障完整性，減輕結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)[36]。

3.3 調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞功能

MSC-Exo可通過攜帶各種免疫調(diào)節(jié)因子(細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子等)，影響B(tài)細(xì)胞、T細(xì)胞的活動，刺激血管生成，防止細(xì)胞凋亡，阻止氧化反應(yīng)，調(diào)節(jié)炎癥進(jìn)程[37]。Matula等[38]在研究人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AD-MSC)與T淋巴細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，通過T細(xì)胞的納米通道介導(dǎo)，AD-MSC摻入大量T細(xì)胞膜成分，繼而分泌大量具有免疫調(diào)節(jié)作用的外泌體。Chen等[39]在研究骨髓MSC-Exo的免疫調(diào)節(jié)特性時發(fā)現(xiàn)，將骨髓MSC-Exo與外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)輔助Th1細(xì)胞向Th2轉(zhuǎn)化，外周血Th17細(xì)胞比例降低，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及CD3+T細(xì)胞比例增加。MSC-Exo通過FasL誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，或活化PD-1通路抑制T細(xì)胞活化，導(dǎo)致免疫耐受，介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞[40-41]。MSC-Exo使Th1細(xì)胞IFN-γ分泌降低，IL-4分泌增加，Th17細(xì)胞IL-17和IL-22分泌降低，IL-10的分泌提高，提示MSC-Exo調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的復(fù)雜性和可塑性。Cosenza等[5]在研究MSC-Exo對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)炎模型的軟骨保護(hù)作用時，發(fā)現(xiàn)MSC-Exo有明顯的免疫抑制作用，將MSC-Exo分別和脾細(xì)胞分離的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC-Exo以劑量依賴性方式抑制T淋巴細(xì)胞增殖，并降低CD8+IFN-γ+、CD4+IFN-γ+T淋巴亞群百分比，增加CD4+IL-10+Th1調(diào)節(jié)細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比；降低與B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中總IgG水平，抑制B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平升高，這種免疫抑制作用與MSC-Exo高表達(dá)TGF-β1、PGE2及IL-1RA有關(guān)。MSC-Exo具有抗原特異性的抗炎反應(yīng)，在MSC-Exo處理的小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型中，觀察到免疫細(xì)胞Th1型向Th2型的轉(zhuǎn)變，淋巴結(jié)中CD19+IL-10+Breg細(xì)胞亞群明顯增加，IL-6、IL-1β水平降低。MSC-Exo抑制B細(xì)胞的增殖和向分泌免疫球蛋白的漿細(xì)胞的分化，外泌體中的CCL2直接抑制漿細(xì)胞分泌免疫球蛋白抗體[42]。為了評估MSC-Exo的免疫調(diào)節(jié)作用，在體外將骨髓MSC-Exo與外周血單個核細(xì)胞共培養(yǎng)，T細(xì)胞增殖率下降了1.65%，抑制作用與外泌體的量呈正相關(guān)，研究結(jié)果還顯示人臍帶MSC-Exo有更強(qiáng)的抑制作用[43]。Rahman等[44]研究發(fā)現(xiàn)骨髓MSC-Exo可攜帶高通量的miR-375，抑制PBMC的增殖，減輕1型糖尿病胰島細(xì)胞移植免疫排斥反應(yīng)，增強(qiáng)Treg細(xì)胞的功能，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

3.4 調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞表型及自然殺傷細(xì)胞的增殖

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)在免疫系統(tǒng)中起前哨作用，通過捕獲受傷上皮的抗原被激活，活化的DC遷移至引流淋巴結(jié)，將抗原信息傳遞至T淋巴細(xì)胞，使T細(xì)胞活化，啟動免疫應(yīng)答，CD4+T和CD8+T細(xì)胞進(jìn)一步分泌細(xì)胞因子或直接殺傷。Harrell等[45]在研究慢性氣道炎癥所致慢性阻塞性肺病(COPD)小鼠模型及臨床樣本時發(fā)現(xiàn)，運用生物工程產(chǎn)品“外泌體來源的多個同種異體蛋白”(exosome-derived multiple allogeneic protein paracrine signaling，Exo-d-MAPPS)處理小鼠可影響DC的遷移及抗原提呈特性，使具有免疫原性的成熟DC轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖吣褪苄虳C，DC表達(dá)CD80減少，分泌IL-12減少，分泌IL-10增加，進(jìn)而影響CD4+Th1、CD4+Th17，CD8+CTL細(xì)胞的激活。另外，Exo-d-MAPPS還促進(jìn)免疫抑制性IL-10產(chǎn)生，調(diào)節(jié)CD4+FoxP3+T細(xì)胞(Treg)增殖，從而減輕慢性氣道炎癥。和動物模型中觀察到的類似，Exo-d-MAPPS治療顯著改善了COPD患者的肺部狀況和生活質(zhì)量。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)在固有免疫和適應(yīng)性免疫中起紐帶作用，參與抗感染免疫、腫瘤排斥、自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制以及抑制耐受的維持。Ko等[46]在研究外泌體的抗腫瘤免疫機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，脂肪MSC-Exo處理肝癌模型大鼠后循環(huán)NKT細(xì)胞的百分比顯著升高，此外，免疫組織化學(xué)檢測也表明，腫瘤內(nèi)CD8α+NKT細(xì)胞數(shù)量明顯高于對照組，提示脂肪MSC-Exo可通過NKT細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。研究表明，帶有NKG2D配體的MSC-Exo能抑制NK細(xì)胞的毒活性，減少NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子(包括TNF-α、IL-1β、INF-γ、IL-17)產(chǎn)生[47]。胚胎肝MSC-Exo通過攜帶潛伏期相關(guān)肽(LAP)、TGF-β和血小板反應(yīng)蛋白1(TSP1)，在NK細(xì)胞中誘導(dǎo)下游TGF-β/Smad2/3信號傳導(dǎo)，抑制NK細(xì)胞的增殖、活化和細(xì)胞毒性[48]。骨髓MSC-Exo也可通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞，促進(jìn)缺血后神經(jīng)恢復(fù)和大腦重塑[49]。

4 展望

越來越多的證據(jù)表明，基于MSC的免疫抑制機(jī)制主要歸因于MSC分泌的外泌體。MSC-Exo富含源自MSC的生物活性分子(mRNA、microRNA、細(xì)胞因子、趨化因子、免疫調(diào)節(jié)因子等)發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞表型、功能及歸巢的作用[22]。本文我們著重介紹了有關(guān)MSC-Exo在減輕自身免疫和炎性疾病方面的治療作用及分子機(jī)制的最新認(rèn)識。目前研究顯示，局部和全身施用MSC-Exo均可有效抑制炎癥組織中有害的免疫反應(yīng)，并促進(jìn)受損實質(zhì)細(xì)胞的存活和再生。MSC-Exo的抗炎作用依賴于炎癥免疫細(xì)胞中免疫調(diào)節(jié)性miRNA和免疫調(diào)節(jié)蛋白的傳遞，使M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為免疫抑制性M2型巨噬細(xì)胞，DC向免疫耐受型轉(zhuǎn)換，淋巴細(xì)胞Th1型向Th2型的轉(zhuǎn)變以及產(chǎn)生更多的Treg細(xì)胞。外泌體有可能取代細(xì)胞療法，緩解從血液、組織或骨髓獲得干細(xì)胞移植治療的壓力，以MSC-Exo裝載藥物或基因治療內(nèi)容物可能最終會成為精確靶向治療的工具[50]。但是，關(guān)于MSC-Exo產(chǎn)生和修飾以及外泌體質(zhì)量和功能仍然需要我們更深入的了解，而且不同來源的MSC-Exo在傳遞可能增加或限制疾病的信號中的作用也需要更清楚的認(rèn)識。為了進(jìn)一步闡明MSC-Exo的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，需要利用蛋白質(zhì)組學(xué)和高通量測序細(xì)化外泌體遞送蛋白質(zhì)及RNA種類及功能，進(jìn)一步探索外泌體和細(xì)胞外囊泡之間免疫調(diào)節(jié)能力的差異。此外，MSC-Exo在進(jìn)入臨床應(yīng)用之前還需要實施嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化程序和有效的效價測定。