基因與干細胞治療感音神經性聾的研究現(xiàn)狀

王新蘭田海月鐘翠萍向大偉

1中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（蘭州730050）

2寧夏醫(yī)科大學臨床學院研究生院（銀川750004）

3中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院（蘭州730050）

感音神經性聾是世界上發(fā)病率最高的致殘性感官缺陷，嚴重影響患者的生活質量，尤其是在兒童時期，可能導致言語和語言的發(fā)育延遲。2016年全國聽力障礙與耳病調查顯示，我國中度以上聽障人口達7106萬，SNHL占比達70%以上。2012年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，超過5.3%的世界人口（約3.6億人）患有致殘性聽力障礙，其中四分之一的聽力障礙始于兒童時期，80%的聾人和聽力障礙者生活在低收入和中等收入國家[1]。

目前臨床對于SNHL的治療主要有助聽器、振動聲橋、人工耳蝸植入等[2]，盡管這些技術近些年取得了一定進展，但患者感知到的聲音與“先天性”耳蝸的聲音存在差別，且并非所有的SNHL患者都適合這些方法，這說明當前技術并不能從根本上解決耳聾問題。因此，如何修復受損的HCs和SGNs，恢復其功能已成為耳科研究的熱點。來自世界各地的科學家正在探索修復受損HCs和SGNs形態(tài)和功能的治療方法，其中有學者提出利用細胞或基因治療技術來替代或修復損傷細胞。隨著基因與干細胞技術的迅速發(fā)展，動物模型中的方法取得了可喜的進展，科學家主要嘗試從三方面恢復HCs數(shù)量及內耳功能，其一是用實驗方法靶向敲除限制HCs分化的基因;其二是應用基因轉染技術誘導HCs分化再生;其三是利用各種干細胞移植代替死亡的HCs。本綜述討論了基因與干細胞治療SNHL的研究現(xiàn)狀，并探討了當前阻礙其臨床應用的可能障礙和局限性。

1 干細胞治療SNHL

1.1 干細胞的研究背景

干細胞療法的臨床應用始于1968年，最初干細胞用于骨髓移植術，其有效成分是造血干細胞。此后，隨著干細胞研究方法及臨床技術的不斷改進，干細胞治療在臨床的應用越來越廣泛?，F(xiàn)有臨床研究已經證明，干細胞對神經退行性疾病、免疫疾病、心腦血管疾病、生殖系統(tǒng)疾病以及肝、腎、胰等器官的重大疾病治療方面發(fā)揮重要作用，并展現(xiàn)出驚人的治療潛力，其安全性及有效性逐漸得到醫(yī)學界的認可[3]。作為一種新的治療方法，干細胞療法正在嘗試用于治療SNHL患者。哺乳動物的HCs和SGNs在出生以前就停止生長了,耳蝸HCs和SGNs損傷后都不能再生和修復，而干細胞在適宜的條件下可以分化為幾乎所有的細胞類型，因此，利用干細胞修復受損的HCs和SGNs，恢復其功能成為聽力學研究的熱點。

干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有自我復制、再生為各種組織器官的潛能、自動歸巢、免疫原性低、良好的與宿主細胞整合能力、作為細胞載體導入相應的外源基因以及極強的遷徙能力,遷徙到耳蝸病變組織[4]。在一定條件下，它可以分化為多種功能細胞，因此被醫(yī)學界稱為“萬能細胞”，以上特點決定了干細胞療法在SNHL患者治療中可能具有潛在的應用價值。目前可用于SNHL患者耳蝸修復的干細胞主要有以下幾種:胚胎干細胞、造血干細胞、神經干細胞、骨髓間充質干細胞、誘導多能干細胞和內耳干細胞[5]。

1.2 干細胞治療SNHL的研究現(xiàn)狀

SNHL是由毛細胞的缺失或涉及到聽覺皮質的傳入神經通路（主要病變?yōu)槎丠Cs和/或SGNs變性或缺失）的損傷引起，這類患者主要由耳毒性藥物、噪音、老化和遺傳因素等多種因素造成[6,7]。因此，HCs和SGNs再生是治療SNHL的重要目標。助聽器和耳蝸植入是目前中重度SNHL患者重返聽覺世界的唯一希望，但仍有很多局限性，例如佩戴助聽器患者，需要一定的殘余聽力；人工耳蝸植入患者，必須經過術后訓練建立植入物與大腦之間的有效信號傳輸，而極重度SNHL患者兩者效果都不佳。干細胞以其良好的融入宿主組織的能力而聞名，并已成功應用于大腦、脊髓和眼睛等幾項移植實驗，以替換受損的神經元和感覺細胞。近年來，干細胞被引入哺乳動物耳蝸HCs再生新治療策略的研究中，初步結果表明，移植的干細胞能夠遷移或移植到耳蝸和前庭末端器官以及螺旋神經節(jié)，代替受損的HCs和SNGs，這表明干細胞在一定程度上可以達到治療SNHL的目的。

利用干細胞治療SNHL目的是通過誘導干細胞到耳蝸病變所需部位來恢復正常細胞的功能。就聽力損失來說，干細胞有分化為新的毛細胞、神經元和支持細胞的潛能。文獻報道骨髓源性間充質干細胞（MSCs）是最有前景的用來修復內耳細胞之一,且原發(fā)性間充質干細胞在內耳存活時間最長[8]。MSCs具有顯著的自我更新能力，不僅能分化成成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞，而且能分化成神經元[9,10]。與其他細胞類型相比，MSCs的最大優(yōu)勢是可用于自體移植[11]。先前的研究表明，胚胎干細胞、神經干細胞、臍帶血干細胞、誘導多能干細胞和成人內耳干細胞可以產生內耳神經元或類毛細胞樣細胞[12]。

張等人[13]將來源于C57bl的神經干細胞通過耳蝸側壁移植到小鼠內耳中，發(fā)現(xiàn)它們能高效地分化為聽覺神經元。在另一項研究中，Mi等人[14]將耳毒性藥物（新霉素）注射到正常聽力豚鼠內耳中，人為的引起SNHL，觀察到豚鼠的聽覺誘發(fā)腦干反應（ABR）閾升高至80-90dB，并在光學顯微鏡下觀察到外毛細胞變性和聽神經元缺失。然后他們從孕婦臍血中采集間充質干細胞，經肱靜脈移植到豚鼠耳內，5周后ABR閾值從80-90dB提高到40dB，聽覺神經元和HCs的數(shù)量也增加。由此，他們得出結論：從臍血中靜脈移植間充質干細胞可以通過增加外毛細胞和聽神經元的數(shù)量來提高聽力。Chien等人[15]經顱內途徑將人源性間充質干細胞（HL-MSCs）移植入小鼠耳蝸神經，并在耳蝸神經干周圍用微量移液管注射HL-MSCs，通過ABR和耳聲發(fā)射（DPOAE）測定小鼠的聽覺閾值。然后用哇巴因誘導聽覺閾值升高但DPOAE正常的小鼠發(fā)生聽神經病，采用免疫組織學染色，檢測HL-MSCs在細胞移植2天后定位于耳蝸神經干，移植3個月后，與未移植HL-MSCs的耳蝸相比，在哇巴因處理的小鼠耳蝸中檢測到了更多的HCs，并且HL-MSCs移植3個月后，ABR聽力明顯改善。最終得出結論：HL-MSCS可作為治療SNHL的細胞療法。以上實驗結果表明，干細胞療法對SNHL患者具有一定的治療潛能。

2 基因治療SNHL

2.1 基因療法的研究背景

基因治療的歷史始于20世紀60年代末和70年代初，當時基因標記細胞被用于了解幾種病毒載體的細胞轉化機制。隨著重組DNA技術和基因克隆的引進和進展，基因治療在醫(yī)學的許多領域得到應用，從神經細胞再生到抗癌治療，基因療法被用于治療阿爾茨海默病[16]、胰腺癌[17]、肌肉疾病[18]和眼部疾病[19-20]。與此同時，耳聾基因治療在短期內也取得了令人矚目的成績。

2.2 基因治療SNHL的研究現(xiàn)狀

基因治療是利用分子生物學技術將目的基因導入人體內治療相關疾病的方法。在基因治療SNHL中，研究人員需要識別在毛細胞和聽神經中可以再生的基因，然后選擇合適的載體（比如病毒載體、納米載體），將基因攜帶到靶細胞中。耳蝸基因治療類似于干細胞替換聽覺系統(tǒng)中丟失的HCs，使用載體將治療基因(比如神經營養(yǎng)相關因子、Atoh1基因、Vglut3、miRNAs等)導入到患者的內耳，通過替換丟失的HCs及SGNs來恢復聽力。內耳獨特的解剖結構可使其作為基因治療的一個理想的靶位。

耳蝸HCs的分化是由特異的基因調控的,其中最關鍵的是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helic-loop-helix,bHLH)基因轉錄調控因子,例如Atoh1是HCs分化的正向調控基因,Hes1和Hes5是負向調控基因[21]。目前，基因治療在動物實驗模型中取得了一定的成果。Lee[22]等人發(fā)現(xiàn)Math1基因是一種轉錄因子，對耳蝸corti器中HCs結構和功能的恢復起重要作用。在小鼠模型中，Chen[23，24]等人發(fā)現(xiàn)神經營養(yǎng)素-3（Neurotrophin-3，N-3）基因可以保護聽覺神經和毛細胞免受順鉑的耳毒性作用。隨后，Kawamoto等人[25]發(fā)現(xiàn)了一種基于載體的神經營養(yǎng)因子通過轉基因表達，可防止毛細胞退化凋亡。Wise等人發(fā)現(xiàn)外源性載體介導的神經營養(yǎng)因子（BDNF）或N-3的轉基因表達可延長聽神經元的存活時間[26]。此外，Shibata等人[27]發(fā)現(xiàn)神經營養(yǎng)因子或神經營養(yǎng)素可以保護內耳毛細胞，增加聽神經元的存活時間，并誘導聽神經再生。Kelly等人[28]發(fā)現(xiàn)Atoh1基因對聽覺功能起很重要的作用，他們通過敲除小鼠Atoh1基因建立小鼠先天性SNHL實驗模型，然后將Atoh1基因克隆到一個載體中，并將其送回該小鼠體耳內，最終得出Atoh1的轉基因表達可將支持細胞轉化為與內源性感覺上皮相似的異位感覺細胞。最近，科學家發(fā)現(xiàn)miRNAs對內耳HCs的進化和生存起著關鍵作用，例如，去除大鼠和斑馬魚內耳中的miRNA會導致HCs死亡[29]。另一項研究結果表明，在脊椎動物的內耳中，miRNA對HCs的產生和維持其特征是必不可少的[30]。Akil等人通過敲除小鼠囊泡谷氨酸轉運體-3基因（Vglut3），人為的造成小鼠SNHL，發(fā)現(xiàn)小鼠ABR閾值約為90dB，無驚嚇反應，然后通過轉基因表達的方式將Vglut3基因置入小鼠耳內，2周后小鼠ABR閾值恢復正常，驚嚇反應部分恢復[31]。

以上動物實驗研究表明，通過基因治療能夠成功地恢復聽力功能，雖然這一技術沒有運用到人類耳蝸，但這將是人類耳聾基因治療的重要一步。

3 基因與干細胞治療SNHL的局限性

3.1 干細胞治療SNHL的局限性

使用干細胞再生來恢復聽力的討論和研究截至目前已有40余年的時間，得到廣泛認同的一種觀點是,干細胞療法將有可能在HCs和SGNs嚴重退化或缺損時成為SNHL一個更直接更有前途的治療方法，但這一技術的應用也存在諸多問題，如安全性、有效性、費用等方面問題。

例如，干細胞很難在內耳中存活，根據(jù)動物實驗可以得知，即使目前的技術能夠實現(xiàn)將轉化的干細胞移植到內耳中，替換缺失的HCs和SGNs，它們對健康的負面影響可能難以控制，比如干細胞過度增殖、不可控制的分裂、難以精準的靶向等等，這些副作用會引起過度免疫、移植失敗和免疫排斥等[32]。此外，耳蝸具有非常復雜的結構，包含許多不同類型的細胞，這些細胞從頂部到底部的差異很大，它們具有不同的功能，耳聾患者的病變部位可能不同，因此，能否將干細胞移植到耳蝸靶區(qū)也具有很大的挑戰(zhàn)性。另外，干細胞在耳蝸組織中的植入可能存在一個有效的時機，過早或太遲也許都難以確保干細胞的有效植入，原因是在耳蝸組織結構沒有發(fā)生損害的情況下，組織細胞間的連接十分緊密使之成為一道有效的組織細胞屏障，在這種情況下，外來干細胞幾乎沒有植入的可能；當然在損害修復之后形成的瘢痕組織同樣形成一道有效屏障以確保內淋巴與外淋巴的有效隔離，在這種情況下，干細胞植入也十分困難，因為那里已經不再有縫隙供干細胞植入。在感覺上皮的損害過程中，組織細胞間的屏障遭到部分破壞或嚴重破壞，甚至形成百孔千瘡，在這種組織急需修復的情況下，干細胞植入可能更容易，但這一說法還需要進一步的實驗證實[33]。再者，費用昂貴同樣阻礙了其應用?；诟杉毎委烻NHL未進行嚴格的臨床試驗，安全性與有效性均不明朗，且花費高昂，目前僅限于動物實驗階段，并沒有應用于人類實驗。

3.2 基因治療SNHL的局限性

雖然基因治療SNHL在動物模型中取得了許多可喜的成績,但是也存在一系列遠未解決的問題,離臨床實際應用尚有很長一段的距離?，F(xiàn)階段基因治療僅限于動物新生階段干預，首要原因是缺少安全有效的手術徑路，將目的基因輸送到內耳的方法與干細胞移植相似，包括鼓階途徑、圓窗膜路徑、半規(guī)管途徑、蝸軸途徑、耳蝸外側壁等途徑植入[34]，耳蝸空間小在一定程度上增加了手術難度，且在移植過程中多少都會對耳蝸本身結構造成損傷，再加上耳蝸中存在阻礙植入組織插入皮質器官的緊密連接，因此手術路徑的選擇研究也是能否成功的關鍵，目前還沒有達成一致協(xié)議[35]。另外，基因轉染的實現(xiàn)首先需要載體的攜帶，而載體能否將攜帶的特定基因片段轉入到特定的耳蝸靶細胞，卻是一個非常復雜的問題。

除此之外，基因治療SNHL還可能存在以下局限性：（1）障礙大：基因治療必須克服與內耳結構特征和解剖有關的幾個障礙，耳蝸是一個被骨覆蓋的封閉的充滿液體的腔，很容易受到內耳液體數(shù)量和成分變化的影響。因此，在不破壞體內平衡的情況下，將基因輸送到耳蝸靶區(qū)是非常具有挑戰(zhàn)性的。（2）免疫反應：目前基因載體多選用病毒載體，但由于病毒載體可能引起部分病毒蛋白的表達，具有一定的免疫源性，可能激活內耳的免疫反應，從而導致基因表達的封閉[36]。（3）轉染效率低：基因載體的選擇是另一大難題，相對于病毒載體而言，非病毒載體的安全性較高，非病毒載體的主要缺點是轉染效率較低和缺乏靶向性[37]。（4）費用高：納米載體[38]如羥基磷灰石納米顆粒（NHAT）在耳聾基因治療中具有良好的生物相容性、幾乎沒有細胞毒性、無免疫性、無致癌性和相對無限的載量等優(yōu)點。同時，這種粒子可用于連接不同的分子群，從而能夠構建多種具有多功能的載體，雖然這些優(yōu)點解決了病毒載體在耳聾基因治療中的一些缺點，特別是在免疫源性和致癌性方面，但因其低轉染效率（＜30%）、費用高同樣阻礙了臨床的應用。（5）未發(fā)現(xiàn)的副作用：基因一旦在內耳中啟動表達，無組織特異性，可能會在內耳組織中廣泛表達，如果不能對目的基因進行適當?shù)目刂坪蛢?yōu)化，引起不必要的細胞生長，可能會引起目前尚未發(fā)現(xiàn)的副作用[36]。

如果上述問題能夠得到解決，我們有理由相信在不遠的將來基因治療將成為治療感音神經性耳聾的有效方法。

4 總結與展望

干細胞療法是用具有適當特征的新細胞群替換受損或缺失的HCs或SNGs的一種選擇，這一治療方法可能為SNHL患者提供一種新的治療方法?；蛑委熆捎糜趯⒒驅攵伈∽儾课?，以誘導治療劑基因的表達，取代缺陷基因或使支持細胞獲得丟失或受損HCs的表型，以修復或再生受損SNGs。這兩者都是現(xiàn)代醫(yī)學先進的技術,給SNHL患者的治療帶來了新的曙光。但是基因與干細胞對SNHL的治療面臨諸多的難題有待突破。盡管面臨諸多挑戰(zhàn)，但基因和干細胞療法在聽力損失研究中仍然是一個誘人的策略，因為這可能是導致成熟哺乳動物耳蝸中HCs再生和SGNs恢復的唯一選擇。動物研究的一些結果雖然沒有在人類身上得到證實，但將動物研究的結果翻譯到臨床上并非不可能，有時也非常成功?，F(xiàn)有的動物模型通過基因治療和干細胞移植均成功地恢復了聽覺功能。鑒于遺傳學和細胞生物學的最新進展以及克服當前障礙的方法，我們相信基因與干細胞治療SNHL的臨床應用的最終目標并不遙遠。當然，在實際臨床應用之前仍需要大量的研究。