早熟蘋果果實軟化過程中乙烯、相關酶及其基因表達變化

李世軍，尹寶穎，李 佳，李中勇，張學英，徐繼忠

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，河北 保定 071000；2.河北景縣中學，河北 衡水 053500)

蘋果品種結構不合理是影響我國蘋果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要因素，提高早熟品種所占比例，是蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然。限制早熟蘋果品種在生產(chǎn)中廣泛應用的一個重要因素是早熟品種果實容易軟化、貨架期短。有關蘋果果實軟化的研究，歷來是蘋果研究中重要的熱點領域。齊秀東等[1-2]以嘎拉、富士、金冠蘋果為試材，分析了果實發(fā)育軟化過程細胞壁組分、細胞壁酶活性及其基因表達的變化。陳學森等[3]以喬納金及其脆肉株變?yōu)樵嚥?，比較分析了果實發(fā)育后期果實軟化相關基因的表達差異，李宏建等[4]研究了岳帥蘋果貯藏軟化過程中果實酶活性及理化性狀的變化。以上分析顯示果實軟化的研究以中晚熟品種為試材的較多，劉超超等[5]研究了泰山早霞、遼伏、極早紅等3個早熟品種果實軟化過程中硬度、乙烯、酶活性間的關系。

藤木1號是一個優(yōu)良早熟蘋果品種，在我國已有一定的栽培面積，XU2-5是河北農(nóng)業(yè)大學選育出早熟蘋果新品系，具有成熟期早、果個適中、果形端正、色澤鮮艷等優(yōu)點。本試驗通過測定藤木1號、XU2-5果實成熟過程中果實硬度、乙烯釋放速率及相關基因表達等指標的變化，探明藤木1號、XU2-5果實軟化的原因，以期為延長果實貯藏期，保持其品質提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試材及采樣

試驗于2016-2017年在河北省保定市順平縣南神南村河北農(nóng)業(yè)大學蘋果示范園中進行，供試材料為7～8 a生的早熟品種(系)XU2-5、藤木1號，中間砧為SH40，基砧為八棱海棠，樹形為細長紡錘形，株行距為2 m×4 m，樹勢生長健壯，常規(guī)管理。

每個品種(系)選擇生長結果一致的3棵樹，自盛花后80～100 d，每隔5 d取樣1次，共計5次。各品種(系)每次每株從樹冠外圍到內膛隨機選取大小均勻、無損傷的10個果實，共30個果實。采后立即運回實驗室備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 乙烯釋放速率的測定 將蘋果果實置于干燥器中，靜置密封6 h后收集乙烯氣體，醫(yī)用注射器抽取1 mL氣體保存?zhèn)溆茫總€重復測定3次。

采用FULI-9790II 氣相色譜儀進行測定，色譜條件為：色譜柱采用不銹鋼填充柱；氫火焰離子化檢測器；柱箱溫度90 ℃，汽化室溫度140 ℃，載氣流速分別為N2：120 mL/min(0.12 MPa)，H2：100 mL/min(0.1 MPa)，合成空氣：100 mL/min(0.1 MPa)，進樣量為1 mL。

1.2.2 硬度的測定 采用GY-1型果實硬度計測定，在果實表面選擇對稱的4個面，去皮，取4個面的平均值，單位kg/cm2。

1.2.3 酶活性的測定 取 2 g 樣品，用 6 mL 酶提取液(6% NaCl，內含0.6% EDTA，1% PVP) 勻漿。然后再 10 000 r/min 離心 20 min，上清液即為粗酶提取液，待用。

多聚半乳糖醛酸酶(PG)及果膠甲酯酶(PE)活性測定采用薛應龍[6]的方法。脂氧合酶活性(LOX)的測定參照陳昆松等[7]的方法。

1.2.4MdACS、MdPG、MdPE、MdLOX基因相對表達量測定 采用天根生物科技有限公司的試劑盒提取果實樣品總RNA，引用文獻中給出的MdPG1、MdPE、MdACS6、MdLOX引物[8-11](表 1)，用全式金逆轉錄試劑盒合成各基因的cDNA 第一鏈后，在多重Real-time熒光定量PCR儀下進行各基因的相對表達量的測定。以Actin為內參基因。重復3 次。

采用2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析。

2 結果與分析

2.1 果實硬度的變化

隨著果實發(fā)育成熟，2個品種(系)果實硬度均呈現(xiàn)降低的趨勢，但各品種(系)間下降幅度及速率存在差異(圖1)。花后80 d，藤木1號果實硬度最高，為14.15 kg/cm2，到花后100 d硬度最低，僅為7.38 kg/cm2，其硬度下降了47.84%。而XU2-5花后80～100 d，果實硬度變化幅度較小，僅降低了22.19%?；ê?00 d，XU2-5的果實硬度顯著高于藤木1號的果實硬度(P<0.05)。

表1 Real-time PCR 引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of primers in Real-time PCR

不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。圖2-9同。 Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level.The same as Fig.2-9.

2.2 乙烯釋放速率及MdACS6基因表達變化

如圖2所示，供試2個品種(系)的乙烯釋放速率(以鮮質量計)隨著果實成熟總體呈現(xiàn)增長的趨勢，但2個品種(系)間存在差異。藤木1號的乙烯釋放速率在花后95 d出現(xiàn)明顯的高峰，此時藤木1號的乙烯釋放速率顯著高于XU2-5。XU2-5的乙烯釋放速率前期緩慢增加，在花后90～100 d迅速升高，乙烯釋放速率增加了36.97 nL/(h·g)?；ê?0～100 d，藤木1號乙烯釋放速率顯著高于XU2-5。

圖2 兩個品種成熟過程中乙烯釋放速率的變化Fig.2 Changes of ethylene production during the ripening process

XU2-5和藤木1號的MdACS6基因相對表達量變化基本一致(圖3)，前期基因相對表達量較低，之后相對表達量逐漸升高?；ê?0，90，95 d藤木1號的MdACS6基因相對表達量均顯著高于XU2-5，花后85,100 d雖然藤木1號的MdACS6基因相對表達量高于XU2-5，但未達顯著水平。

對比兩品種(系)果實的乙烯釋放速率與MdACS6基因相對表達量，結果顯示二者總體趨勢相一致，藤木1號在花后95 d、XU2-5在花后100 d乙烯釋放速率較高，而且MdACS6基因相對表達量也相對較高。

圖3 兩個品種成熟過程中MdACS6基因相對表達量的變化Fig.3 Changes in MdACS6 gene expressions during the ripening process

2.3 相關酶活性及其基因表達變化

2.3.1 多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性及其基因相對表達量 由圖4，5可以看出，藤木1號果實成熟過程中MdPG1基因相對表達量和酶活性表現(xiàn)出了較好的一致性，而XU2-5則表現(xiàn)為盛花后80～90 d二者趨勢一致。盛花后80 d，藤木1號的MdPG1基因的相對表達量顯著高于XU2-5，此時，藤木1號的酶活性顯著高于XU2-5。盛花后85 d，兩品種(系)的基因相對表達量及酶活性均下降，差異不顯著；盛花后85～90 d兩品種(系)的基因相對表達量及酶活性均顯著升高，90 d時MdPG1基因相對表達量是85 d的7.56～29.72倍，XU2-5的相對表達量顯著高于藤木1號；盛花后90 d PG活性是85 d的1.39～1.58倍，表現(xiàn)為藤木1號的酶活性顯著高于XU2-5。盛花后90～95 d二者的基因相對表達量顯著下降，95 d時二者間無顯著差異，但二者的PG活性仍較高，二者間無顯著差異。盛花后100 d，二者的基因相對表達量和酶活性均升高，藤木1號的基因相對表達量顯著大于XU2-5，但酶活性間差異不顯著。

圖4 果實成熟過程中多聚半乳糖醛酸酶活性的變化Fig.4 Changes in PG activity of two varieties during the ripening process

圖5 兩個品種成熟過程中MdPG1基因相對表達量的變化Fig.5 Changes in MdPG1 gene expressions during the ripening process

2.3.2 果膠甲酯酶(PE)活性及其基因表達 由圖6，7可以看出，兩品種的MdPE基因相對表達量與PE酶活性(以鮮質量計)變化趨勢在盛花后85 d前一致，以后不一致。盛花后80～85 d，MdPE基因相對表達量升高，藤木1號的高于XU2-5，此時酶活性表現(xiàn)出一致性；盛花后90 d，XU2-5的MdPE基因相對表達量繼續(xù)升高，而藤木1號的則下降，而此時二者的酶活性則同時下降；盛花后90～100 d，兩品種(系)的MdPE基因相對表達量下降，而其酶活性則持續(xù)升高，盛花后100 d，藤木1號的酶活性顯著高于XU2-5。

圖6 果實成熟過程中果膠甲酯酶活性的變化Fig.6 Changes in PE activity of two varieties during the ripening process

圖7 兩個品種成熟過程中MdPE基因相對表達量的變化Fig.7 Changes in MdPE gene expressions during the ripening process

2.3.3 脂氧合酶(LOX)活性及其基因表達 由圖8，9可以看出，果實成熟過程中脂氧合酶(以鮮質量計)的變化趨勢與MdLOX基因相對表達量變化不一致。隨著果實成熟，供試2個品種(系)的脂氧合酶(LOX)活性呈現(xiàn)相似的變化趨勢，先降低后升高(圖8)?；ê?0～85 d，2個品種(系)的脂氧合酶活性迅速降低， XU2-5的降低幅度大于藤木1號?；ê?5～100 d，XU2-5和藤木1號的酶活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，藤木1號的酶活性始終高于XU2-5的酶活性，花后90 d和花后100 d，藤木1號和XU2-5的酶活性存在顯著差異。從圖9可以看出，XU2-5的MdLOX基因的相對表達量變化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，高峰出現(xiàn)在花后85 d，而藤木1號的MdLOX基因相對表達量波動較大，最高值出現(xiàn)在花后100 d。

圖8 果實成熟過程中脂氧合酶活性的變化Fig.8 Changes in LOX activity of two varieties during the ripening process

2.3.4 果實硬度與酶活性的相關性 XU2-5和藤木1號的發(fā)育過程中果實硬度與酶活性的相關系數(shù)見表2。由表2可知，XU2-5和藤木1號的果實硬度與PG活性存在顯著負相關，相關系數(shù)分別為-0.944，-0.870，而果實硬度與PE活性和LOX活性的相關性不明顯。

圖9 兩個品種成熟過程中MdLOX基因相對表達量的變化Fig.9 Changes in MdLOX gene expressions during the ripening process

表2 果實硬度與酶活性的相關性系數(shù)Tab.2 The correlation coefficient of related enzymes activity and firmness

注：*.5%的差異顯著水平。

Note：*.The significant level of 5%.

3 結論與討論

乙烯能夠改變細胞原生質膜的透性，使水解酶外滲，有助于降解細胞壁的組成成分，所以乙烯對果實的成熟軟化起著重要的調節(jié)作用。本研究結果顯示，隨著果實的成熟，XU2-5和藤木1號的乙烯釋放速率均呈現(xiàn)增高的趨勢，整個采樣期間藤木1號的乙烯釋放速率均明顯大于XU2-5，且藤木1號的果實已產(chǎn)生呼吸躍變。與之對應的二者果實的硬度也呈現(xiàn)明顯的下降，且藤木1號的果實硬度下降速率明顯高于XU2-5，因而推測乙烯釋放速率升高可能是造成果實硬度下降的主要原因，劉超超等[5]對泰山早霞的研究也得出了同樣的結果。但對比果實硬度下降和乙烯釋放速率可以看出，XU2-5在盛花后80～90 d乙烯釋放速率變化很小，但硬度下降較快，表明此時硬度的下降可能是獨立于乙烯控制或較小依賴乙烯的事件，Ireland 等[12]也有同樣發(fā)現(xiàn)。ACC合成酶(ACS)是乙烯合成的限速酶，在果實成熟軟化過程中起重要作用，雖然Harb等[13]研究顯示，蜜脆蘋果乙烯釋放量較低與乙烯生物合成基因表達不相關，但本試驗結果顯示花后90 d藤木1號、花后95 d XU2-5果實的ACS6的基因表達強度達到最高值，以后二者乙烯的釋放速率迅速升高。李通[11]的結果也顯示ACS基因表達在果實產(chǎn)生乙烯高峰時起著重要的調控作用。因此，采取措施調控ACS基因表達可以有效的調控軟化。

研究認為，果實軟化主要是多種細胞壁酶的作用引起果膠和細胞壁物質的水解，造成硬度的下降，但在不同果實中起主導作用的水解酶不同，且在不同發(fā)育階段也有所差異[14]。在山農(nóng)脆梨、黃金梨和鴨梨3個梨品種的研究中認為果膠甲酯酶(PE)、淀粉酶(AM)、纖維素酶(Cx)是引起硬度下降的主要原因[15]。秦冠的硬度和脆度與PG和PE酶活性呈顯著負相關[16]。而劉超超等[5]認為硬度的快速下降及貨架期短的原因主要是PG活性高峰的出現(xiàn)。在蘋果后期軟化過程中，PG起主要作用，與果實的成熟軟化呈正相關。本試驗中XU2-5和藤木1號果實硬度均呈現(xiàn)降低的趨勢，但下降幅度不同，2個品種(系)的硬度變化與PG活性變化存在顯著的負相關。但對比分析二者MdPG基因表達可以看出，藤木1號的基因相對表達量變化與酶活性變化一致，表明本試驗中檢測的MdPG基因(為MdPG1)在藤木1號中起主要作用，而在XU2-5中可能MdPG家族中其他基因起主要作用。LOX參與膜質過氧化作用，通過破壞膜結構，從而加速衰老，是果實軟化的重要因素之一[17-18]。有研究表明，脂氧合酶(LOX)在紅星蘋果和肥城桃軟化的啟動階段有促進作用，LOX可能是導致前期軟化的原因[19-20]。本試驗中，XU2-5和藤木1號的果實硬度變化與LOX活性變化相關性不顯著，但2個品種(系)的LOX活性在花后80 d處于最高峰，可能與果實軟化的啟動有關。