果膠甲酯酶的作用機(jī)理及在食品加工中的應(yīng)用

何英東，崔文甲，李曉，王月明，王文亮，*，唐曉珍

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟(jì)南250100；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018）

果膠是植物細(xì)胞壁中最豐富的成分，是修飾植物多個(gè)生命階段的關(guān)鍵成分。果膠的存在使得植物細(xì)胞壁具有一定的流動(dòng)性，因此，植物細(xì)胞壁可以被認(rèn)為是動(dòng)態(tài)細(xì)胞器，而不單純是細(xì)胞內(nèi)部和外部世界之間的屏障。從結(jié)構(gòu)的角度來(lái)看，果膠是由α-（1，4）-連接的D-半乳糖醛酸單體構(gòu)成的高聚半乳糖（homogalacturonan，HG）鏈的線性鏈構(gòu)成的復(fù)雜多糖[1-4]。果膠可被各種果膠酶分子協(xié)同降解[5]。根據(jù)果膠酶作用效果的不同，可分為酯酶（催化果膠酯鍵水解）、解聚酶（催化果膠解聚）和原果膠酶（催化原果膠解聚）。其中，果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）作為果膠酯酶的一種，可以對(duì)果膠進(jìn)行去甲酯化[6]。隨著工業(yè)與科技的發(fā)展，對(duì)于果膠酶的應(yīng)用研究也越來(lái)越深入，果膠甲酯酶作為果膠的一種也逐漸成為研究的新熱門。

1 果膠甲酯酶的作用機(jī)理

果膠按酯化程度可分為低甲氧基果膠和高甲氧基果膠。基本上不與Ca2+反應(yīng)的高甲氧基果膠經(jīng)果膠甲酯酶去甲基化后，可形成低甲氧基果膠[7]。當(dāng)Ca2+存在時(shí)，低甲氧基果膠會(huì)與Ca2+交聯(lián)形成具有一定硬度的果膠鈣，減緩采后處理對(duì)果蔬的軟化作用，抑制果膠的部分物質(zhì)溶解，使果蔬的脆度接近新鮮的脆度，從而減少果蔬品質(zhì)的降低[8]。

果膠的代謝對(duì)于植物機(jī)體非常重要，它調(diào)控與植物發(fā)育和植物防御相關(guān)的多種過(guò)程，通過(guò)一連串的酶嚴(yán)格控制[9-11]。在果膠HG鏈上發(fā)生的修飾尤其重要，因?yàn)樗鼈冋{(diào)節(jié)果膠的組裝和分解，在植物病害期間病原體通過(guò)水解果膠破壞HG網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[12]，打亂植物細(xì)胞壁的重塑，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞。果膠的水解只能在HG鏈的單體單元逐步改性后發(fā)生。α-（1，4）-連接的D-半乳糖醛酸可以通過(guò)PME進(jìn)行脫甲基酯化。PME去除甲基基團(tuán)，將中性HG鏈轉(zhuǎn)化為帶高度負(fù)電荷的聚合物，改變高度甲基化的果膠的某些物理化學(xué)性質(zhì)，并對(duì)植物細(xì)胞壁生理作用產(chǎn)生一定的影響[10]，而稱為多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）的果膠分解酶可以有效識(shí)別去甲基化的中性HG鏈[13-14]，使得HG鏈實(shí)現(xiàn)脫甲基酯化，從而引發(fā)果膠水解。因此，PME和PG可以聯(lián)合促進(jìn)果膠聚合物的水解。

果膠是果汁呈現(xiàn)出混濁態(tài)的主要原因，果膠的存在會(huì)影響果汁的黏度。在果酒釀造工業(yè)中，需要對(duì)果汁進(jìn)行澄清處理，在果汁處理過(guò)程中減少果膠含量的方法是通過(guò)添加PME來(lái)促進(jìn)果膠沉淀，隨后將可以與帶負(fù)電荷的果膠（由PME改性）形成復(fù)合物的CaCl2加入到果汁中。最終，在結(jié)合Ca2+后，果膠沉淀以便去除。另外，為了保持植物細(xì)胞壁完整的多糖網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而保持產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)，可以對(duì)水果和蔬菜進(jìn)行類似的處理。在水果和蔬菜的采后處理（包括冷凍，脫水或巴氏滅菌）期間，細(xì)胞壁的破壞導(dǎo)致細(xì)胞成分和流體的損失以及產(chǎn)品硬度的降低。如前所述的PME和CaCl2在果汁澄清過(guò)程中的使用有利于避免硬度的降低。從HG鏈中除去甲基后，Ca2+離子橋連接去甲基化后的HG鏈的帶負(fù)電荷的羧酸酯基團(tuán)，有利于形成聚合物網(wǎng)絡(luò)，以減少處理環(huán)境對(duì)果蔬細(xì)胞壁完整性的破壞。在這種情況下，具有保持加工水果或蔬菜硬度脆度的作用。另一方面，分離的果膠可根據(jù)其攜帶的負(fù)電荷的多少用作增稠劑或膠凝劑[15-16]。

2 果膠甲酯酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

2.1 果膠甲酯酶在果蔬汁澄清中的應(yīng)用

果蔬汁的混濁態(tài)是評(píng)判果蔬汁產(chǎn)品品質(zhì)的感官特征之一，混濁態(tài)賦予了果蔬汁獨(dú)特的口感與風(fēng)味，但由于果蔬中存在著多種內(nèi)源酶，其中有一部分屬于果膠酶，這些內(nèi)源性的果膠酶會(huì)影響果蔬及其制品的風(fēng)味和穩(wěn)定性。其中內(nèi)源性的果膠甲酯酶易與果膠半乳糖醛酸殘基C6處羧基發(fā)生作用，導(dǎo)致果膠去甲酯化，易降解為甲醇與果膠酸，在果蔬汁加工與貯存過(guò)程中，使得混濁態(tài)易消失，造成果蔬汁產(chǎn)品感官品質(zhì)降低[17]。

目前主要采取兩種方式來(lái)鈍化果蔬汁中的內(nèi)源性果膠甲酯酶以保持其品質(zhì)，第一種為超高壓處理，改變果膠甲酯酶的內(nèi)構(gòu)以達(dá)成鈍化活性的目的。劉野等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在用超高壓技術(shù)鈍化果膠甲酯酶的試驗(yàn)中，處理壓力越高，鈍化效果越好。Ly-Nguyen等[19]研究發(fā)現(xiàn)草莓汁中的果膠甲酯酶經(jīng)過(guò)超高壓處理后，酶的活性鈍化明顯。Lacroix等[20]研究發(fā)現(xiàn)，橘子汁中的果膠甲酯酶經(jīng)過(guò)50℃的預(yù)熱后，在一定的pH值的條件中對(duì)于高壓環(huán)境十分敏感。張波波等[21]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，超高壓處理與瞬時(shí)超高溫滅菌處理都能對(duì)果膠甲酯酶產(chǎn)生鈍化作用，當(dāng)壓力超過(guò)某一定值之后，超高壓處理作用明顯強(qiáng)于瞬時(shí)超高溫處理。

第二種是在獼猴桃果實(shí)中提取果膠甲酯酶抑制劑來(lái)鈍化其活性，以提升果蔬汁混濁態(tài)的穩(wěn)定性。1990年，Castaldo等[22]研究發(fā)現(xiàn)，從獼猴桃中分離純化出一種可以抑制果膠甲酯酶的蛋白質(zhì)，即為果膠甲酯酶抑制劑（pectin methylesterase inhibitor，PMEI）。PMEI通過(guò)與植物中的果膠甲酯酶結(jié)合，形成一種非共價(jià)型可逆復(fù)合物。就目前的研究來(lái)看，從獼猴桃等植物體中直接分離純化PMEI的技術(shù)并不成熟，且效率很低，一般采用基因工程相關(guān)技術(shù)，利用真菌類生物生產(chǎn)單一果膠甲酯酶抑制劑。梅曉宏等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)，在畢赤酵母GS115菌株的基因中剪切進(jìn)獼猴桃果膠甲酯酶抑制基因，使其可以單一連續(xù)表達(dá)出果膠甲酯酶抑制劑，以達(dá)到高效生產(chǎn)的目的。

2.2 果膠甲酯酶在改善果蔬制品質(zhì)構(gòu)品質(zhì)中的應(yīng)用

根據(jù)果膠甲酯酶對(duì)果膠的作用機(jī)理，可知果膠甲酯酶對(duì)果膠作用的主要場(chǎng)所在部分甲酯化的半乳糖醛酸鏈上，果膠甲酯酶切除半乳糖醛酸鏈上的甲基后產(chǎn)生帶負(fù)電的多糖分子，與鈣離子結(jié)合生成難溶性的果膠酸鹽，增加果蔬的硬度脆度，提高果蔬的品質(zhì)。

目前利用果膠甲酯酶改善果蔬制品品質(zhì)的應(yīng)用方式主要有兩種。第一種為添加金屬離子激活內(nèi)源性果膠甲酯酶來(lái)達(dá)到目的。金屬離子對(duì)果膠甲酯酶有一定的激活作用，加速果膠分解成為甲醇和果膠酸，提高蔬菜中自由羧基的含量，加快其與鈣、鎂離子的交聯(lián)作用，從而保持蔬菜的脆度[25]。李春燕等[26]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性果膠甲酯酶活性增加會(huì)導(dǎo)致甜橙果實(shí)軟化；陸勝民等[27]發(fā)現(xiàn)：在青梅果實(shí)軟化過(guò)程中PME和β-半乳糖苷酶含量上升、活性增強(qiáng)；杜小琴等[28-30]使用改善溫度的方法以激活蘿卜泡菜中存在的內(nèi)源性的果膠甲酯酶，使其與外源鈣鹽結(jié)合，提高了泡菜產(chǎn)品的脆度；Anthon等[31]也發(fā)現(xiàn)了果膠甲酯酶在改善白蘿卜泡菜脆度方面具有良好的應(yīng)用；楊林等[32]探討了果膠甲酯酶和外源鈣離子對(duì)番茄丁硬度的影響，試驗(yàn)表明：果膠甲酯酶結(jié)合氯化鈣對(duì)番茄丁硬化效果明顯。第二種為通過(guò)添加外源性果膠甲酯酶與鈣離子進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。李曉等[33]研究了最優(yōu)條件下添加外源性果膠甲酯酶對(duì)低鹽腌漬黃瓜果膠含量和質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的影響，結(jié)果表明，添加果膠甲酯酶改善了低鹽腌漬黃瓜的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)。張慧娟等[34]利用添加超高壓浸漬酶與Ca2+處理罐裝桃制品，探究其保脆的最佳工藝條件，保脆效果顯著。因此，果膠甲酯酶在保持果蔬加工制品的質(zhì)構(gòu)、提高果蔬類泡菜的脆度、改良果醬制品黏度等方面應(yīng)用廣泛。

2.3 利用果膠甲酯酶制備低酯果膠

果膠根據(jù)酯化程度的不同可分為低甲氧基果膠（低酯果膠，甲氧基含量低于7%）和高甲氧基果膠（高酯果膠，甲氧基含量在7%～16.3%）。其中高酯果膠凝膠條件為可溶性固形物含量高于55%和一定的pH值，因此在食品工業(yè)中，高甲氧基果膠普遍應(yīng)用于高糖制品；而低酯果膠在可溶性固形物含量較低，pH值在2.6～6.8的環(huán)境下，與Ca2+等二價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合形成具有一定性質(zhì)的穩(wěn)定的凝膠[35]。

目前食品工業(yè)中低酯果膠的制備方法主要有酶法、堿法、酸法以及酰胺化法等。酸法與堿法生產(chǎn)低酯果膠的缺點(diǎn)明顯，酸法制備效率較低，而堿法的產(chǎn)物的酯化度難以控制。目前最高效且方便控制工藝的方法是酶法，生產(chǎn)工藝流程和設(shè)備簡(jiǎn)單，制出果膠凝膠度好。因此，酶法制備低酯果膠具有廣闊的前景，從現(xiàn)在到未來(lái)都將是一個(gè)研究熱門[36]。果膠甲酯酶是酶法制備低酯果膠的常用工具，對(duì)果膠有去甲酯化的作用。果膠酯酶制備低酯果膠主要分為兩種方法，內(nèi)源酶法和外源酶法，其作用機(jī)理都是激活果膠酯酶來(lái)生產(chǎn)低酯果膠。

內(nèi)源酶法制備低酯果膠的主要途徑就是通過(guò)在材料中添加內(nèi)源酶激活劑來(lái)激活果膠酯酶制備低酯果膠。雷激等[37]研究了激活鮮橙皮中內(nèi)源果膠酶制備低酯果膠的方法的工藝條件。蔡長(zhǎng)河等[38]與Yoon等[39]研究了利用碳酸鈉激活果膠酯酶以制備低酯果膠的方法。

利用外源酶法制備低酯果膠是從微生物發(fā)酵液或植物組織中提取果膠酶，然后用果膠酶生產(chǎn)低酯果膠。Sandra Aparecida de Assis等[40]通過(guò)明膠固定化果膠酯酶制備低酯果膠，確定了最佳工藝條件：pH 9.0，NaCl含量為0.1 mol/L，制備溫度為55℃。李川等[41]在酸法提取果膠的基礎(chǔ)上，利用外源性果膠甲酯酶在橙皮渣中提取低甲氧基果膠。焦云鵬等[42]采用明膠作載體和戊二醛作交聯(lián)劑制備固定化果膠酯酶，制得符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的低酯果膠產(chǎn)品。

酶法制備低酯果膠的優(yōu)點(diǎn)明顯，工藝條件易于控制，但是相較于其他3種方法，其不利因素在于在同條件下產(chǎn)出的果膠的凝膠度低于其他3種方法。目前，提高同條件下制出果膠的凝膠度也是一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前在研究中普遍采用從黑曲霉發(fā)酵液中分離提純得到果膠甲酯酶，并用該酶脫酯提取低酯果膠，能更好的保證產(chǎn)品的膠凝度。

2.4 果膠甲酯酶在葡萄酒釀造中的間接應(yīng)用

在葡萄酒的釀造過(guò)程中，添加果膠酶是不可缺少的關(guān)鍵一環(huán)，而果膠甲酯酶作為果膠酶的一種，也發(fā)揮著重要的作用。在改善酒液品質(zhì)方面，由于葡萄中含有的大量果膠在果實(shí)破碎后留在果汁里，影響汁液的澄清性，導(dǎo)致葡萄出汁率低、過(guò)濾效率低下等問(wèn)題的出現(xiàn)。同時(shí)，在浸漬處理的過(guò)程中，葡萄中含有的大量果膠會(huì)影響多酚類和色素類物質(zhì)的浸提、溶解和穩(wěn)定，導(dǎo)致了葡萄酒釀造難度的增加。當(dāng)在葡萄酒釀造的適當(dāng)工藝階段添加果膠酶后，其中的果膠裂解酶（pectin lyase，PL）會(huì)使果膠中的長(zhǎng)鏈分子鏈裂解為眾多的短鏈果膠分子；PG和PME使果膠長(zhǎng)鏈分子鏈裂解來(lái)的短鏈分子水解成更小的分子團(tuán)，有助于其凝聚并沉降分離，從而實(shí)現(xiàn)果膠的徹底分解，使葡萄在破碎榨汁階段的出汁率大為提升，后續(xù)的澄清和過(guò)濾變得更加容易，為提高葡萄酒的產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)[43-44]。

在對(duì)葡萄酒提色提香的過(guò)程中，果膠酶處理也具有十分重要的作用?；ㄉ帐瞧咸丫频闹饕噬镔|(zhì)，是影響葡萄酒感官品質(zhì)的重要成分之一?；ㄉ赵谄咸丫浦兄饕芯酆虾蛦误w兩種存在方式，其中聚合花色苷是單體花色苷與其他物質(zhì)的聚合體。在葡萄酒釀造的浸漬過(guò)程中，葡萄果皮中的花色苷類物質(zhì)慢慢的釋放出來(lái)。由于果膠酶對(duì)植物細(xì)胞壁中的果膠具有修飾降解作用，所以在浸漬過(guò)程中加入果膠酶有助于改變葡萄細(xì)胞壁的透過(guò)性，從而促進(jìn)花色苷等酚類物質(zhì)的釋放，降低葡萄汁的黏度，提高出汁率和澄清度[45]。

2.5 果膠甲酯酶在其他方面的應(yīng)用

在作物培育中，果膠甲酯酶通過(guò)改變植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)來(lái)影響周圍環(huán)境對(duì)植物的脅迫作用。植物細(xì)胞壁的主要成分為多糖、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用，尤其影響植物體的逆境脅迫。果膠是細(xì)胞壁的主要組成成分，對(duì)細(xì)胞壁通透性調(diào)節(jié)和細(xì)胞之間的連接具有重要作用。果膠甲酯酶是果膠催化作用的主力軍，作為整個(gè)催化反應(yīng)的第一個(gè)關(guān)鍵酶類，可以使果膠的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生定性變化。細(xì)胞壁代謝相關(guān)的酶能夠顯著地改變果膠結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)過(guò)程。目前有研究證實(shí)果膠甲酯酶在植物鎘脅迫[46-48]、鋁脅迫[49-54]、NaCl脅迫[55]、H2O2脅迫[56]、銅脅迫[57]、病原菌侵害[58-59]、營(yíng)養(yǎng)逆境[60]等過(guò)程中具有重要作用。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，果膠甲酯酶在食品行業(yè)中發(fā)揮著重要的作用，主要體現(xiàn)在澄清果蔬汁、保持腌漬果蔬的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)、制備果膠、釀造葡萄酒等方面。在果蔬汁的澄清中，通過(guò)超高壓、高溫或加入抑制劑的方式，盡量抑制果蔬自身中存在的果膠甲酯酶活性，以保持果蔬汁的渾濁態(tài)，維持口感和質(zhì)感已經(jīng)成為食品工業(yè)中的常用輔助手段。在果蔬腌漬中，一般利用果膠甲酯酶將高甲氧基果膠轉(zhuǎn)變?yōu)榈图籽趸z，加入鈣鹽，使得低甲氧基果膠與鈣離子結(jié)合形成一種果膠凝膠網(wǎng)絡(luò)，減緩果蔬在腌漬過(guò)程中脆度的降低，達(dá)到保脆的目的。在食品增稠劑、低酯果膠的生產(chǎn)中，利用果膠酯酶的酶法生產(chǎn)是未來(lái)的一大研究熱點(diǎn)，酶法制備果膠的優(yōu)點(diǎn)明顯，由于酶反應(yīng)的高效性和專一性，能夠提高反應(yīng)的脫酯效率，從而降低設(shè)備要求，簡(jiǎn)化工藝流程，使得工藝易于控制，保持產(chǎn)品良好的膠凝度，具有廣闊的市場(chǎng)前景，安全高效。在葡萄酒的釀造過(guò)程中，果膠甲酯酶作為果膠酶的一部分而發(fā)揮作用。其主要功能為修飾和處理果膠，促進(jìn)果膠降解，促進(jìn)色素活性物質(zhì)的釋放，從而提升酒液的澄清度與色澤香氣。

隨著工業(yè)的發(fā)展與進(jìn)步，人民的生活消費(fèi)水平不斷提高，對(duì)于產(chǎn)品的需求也逐年提高，持續(xù)增長(zhǎng)的需求使得特定果膠酶的應(yīng)用拓寬。在食品工業(yè)中，對(duì)于特定果膠酶的研究必定越來(lái)越深入，而在果膠甲酯酶應(yīng)用方面的研究，應(yīng)根據(jù)其作用機(jī)理，不斷開展新的應(yīng)用思路，拓展其應(yīng)用領(lǐng)域，致力于將其應(yīng)用于更多的工業(yè)生產(chǎn)流程中，提高工業(yè)生產(chǎn)的效率，這將是今后果膠甲酯酶研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)，也是其未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。