新型瘦肉精西馬特羅膠體金快速檢測卡的制備

李 鵬1 郭 燕 矯勝田

1.中國動物疫病預防控制中心 北京 1001252.新疆克拉瑪依市場監(jiān)督管理局 新疆克拉瑪依 834099

西馬特羅屬于腎上腺素受體激動劑(β興奮劑)，是一種新型的“瘦肉精”。有研究表明飼喂西馬特羅等瘦肉精，可以增加肥育豬、牛、羊等飼料報酬和瘦肉率[1～3]，達到促進家畜生長、改善肉質(zhì)的效果。但同時也會在食源性動物體內(nèi)蓄積殘留。食用含有瘦肉精的豬肉對人體有害。國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部曾多次發(fā)文規(guī)定，嚴禁在飼料、動物飲用水、所有動物食品，以任何用途使用西馬特羅，并規(guī)定西馬特羅為禁止使用的獸藥，在動物性食品中不得檢出。

目前檢測瘦肉精的檢測方法眾多，主要包括色譜技術(shù)[4]和免疫分析技術(shù)[5，6]。高效液相色譜法靈敏度高、選擇性好，但技術(shù)要求高、儀器昂貴，且不適合現(xiàn)場快速測定。膠體金免疫層析技術(shù)可快速、準確檢測出食品中有害有毒物質(zhì)殘留，操作方法簡單、便于現(xiàn)場檢測，現(xiàn)已廣泛應用于食品安全檢測領(lǐng)域。

本研究對新型瘦肉精Cimaterol西馬特羅膠體金檢測的工藝流程進行優(yōu)化，摸索膠體金檢測卡制備的最適條件，提高西馬特羅快速檢測卡質(zhì)量，并實現(xiàn)快速、準確現(xiàn)場檢測西馬特羅，同時也為基于膠體金技術(shù)的其他檢測產(chǎn)品的研究與探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1 實驗材料

氯金酸，購自國藥集團；

西馬特羅單抗自行研制，西馬特羅抗原購自上海金標；

西馬特羅標準品，購自北京中科質(zhì)檢生物；

膠體金耗材套裝，購自上海杰一生物；

羊肉、牛、豬肌肉組織樣品、尿樣，采自本地屠宰場。

1.1.2 實驗儀器

XYZ HM3030噴金劃膜儀(上海金標)；

WM-100切條機(上海金標)；

臺式高速冷凍離心機(SIGMA)；

紫外可見分光光度計(上海光譜儀器)。

1.2 方法

1.2.1 金標墊的制備

用1.35%紅色金顆粒標記取1mL膠體金溶液于2mL試管中，加入0.2M K2CO32.0μL/mL，混勻；加入抗體原液1.0μL，混勻后靜置5min；加入封閉液10μL/mL(10%BSA)，混勻后靜置5min；4℃，12 000r/min離心，5min；1/20體積的復溶液復溶，噴涂于已封閉好的玻璃纖維素膜上，迅速轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機內(nèi)進行冷凍干燥，制作成為金標墊。

1.2.2 樣品墊和吸水墊的制備

樣品墊為玻璃纖維素膜浸沒入封閉液(含有2%～3%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸緩沖液)進行封閉，37℃干燥備用。吸水墊為吸水性能較好的吸水濾紙材料。

1.2.3 硝酸纖維素膜(NC膜)的包被

用包被液將制備的人工西馬特羅抗體，稀釋50倍作為T液；PC-2羊抗鼠單克隆抗體，稀釋250倍作為C液。將制備的C液及T液分別在NC膜上劃線，從左至右順序依次為T液和C液，置37℃干燥20～40min，干燥后浸沒入封閉液封閉，置于37℃恒溫箱中干燥備用。

1.2.4 檢測卡的組裝

將制備好的樣品墊、金標墊、NC膜以及吸水墊裁剪為寬度相同的長方形，把人工抗原用包被液50倍稀釋后，用移液器點1μL于空白NC膜上，背板一端貼上吸水紙，另一端貼上處理后的金標墊與樣品墊，輔料之間相互連接，兩端均壓NC膜1～2mm，切成3.5mm寬的條子，組裝成檢測西馬特羅含量的檢測卡。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金快速檢測卡pH的優(yōu)化

用1.35%的紅色金顆粒標記，0.2mol/L的K2CO3分別添加1.5、2.0、2.5、3.0μL/mL，抗體標記量為5μL/mL，每個條件標記1mL，10%BSA封閉，復溶液復溶至100μL，備用。檢測結(jié)果如附圖1所示，結(jié)果顯示K2CO3加2μL/mL時效價最好。

圖1 pH的優(yōu)化結(jié)果

2.2 抗體標記量的優(yōu)化

在上述標記條件下，抗體標記量調(diào)整為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μL/mL，檢測結(jié)果如附圖2所示，結(jié)果顯示抗體標記量在1.5μL/mL時顯色最好。

圖2 抗體標記量優(yōu)化結(jié)果

2.3 西馬特羅膠體金快速檢測卡靈敏度測試

通過使用研制的西馬特羅膠體金，快速檢測卡對含有西馬特羅的樣品進行檢測，結(jié)果如附圖3所示。檢測結(jié)果顯示，所獲得的西馬特羅膠體金快速檢測卡靈敏度達到0.1ppb，通過調(diào)試產(chǎn)品達到檢測需求。

圖3 西馬特羅膠體金快速檢測卡靈敏度測試

2.4 西馬特羅瘦肉精檢測卡性能驗證

2.4.1 靈敏度和重復性檢測

靈敏度和重復性檢測見表1。

表1 西馬特羅檢測卡靈敏度檢測的T、C線顯色結(jié)果表

注：“+”為顯色、“-”為不顯色、“+/-”為顯色不清晰。

表1結(jié)果顯示，當西馬特羅標準液濃度達到0.1ng/mL時T線不顯色，為陽性；隨著標準品濃度的增加T線不顯色，C線顏色增深，表明西馬特羅瘦肉精檢測卡的最低檢測限為0.1ng/mL。西馬特羅試紙條加入陰性PBS后，T、C顯色清晰，陽性樣本西馬特羅標準液加入后的檢測結(jié)果如表1所示，檢測卡的批內(nèi)和批間重復性為100%，假陽性率和假陰性率均為0%(見表2)。

表2 試紙條重復性的檢測

2.4.2 特異性檢測

為了驗證研發(fā)的西馬特羅檢測卡的特異性，我們通過滴加不同濃度的常見的三種瘦肉精鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺，表3的結(jié)果顯示，試紙條與上述三種瘦肉精均未有交叉反應出現(xiàn)，表現(xiàn)出良好的特異性。

表3 試紙條的特異性檢測

2.5 西馬特羅檢測卡檢測應用

分別使用西馬特羅檢測卡和ELISA試劑盒對86份豬組織樣品進行檢測，結(jié)果ELISA檢測出12份陽性，西馬特羅檢測卡檢測出11份陽性，兩者的符合率為91.7%。

3 討論

養(yǎng)殖環(huán)節(jié)非法添加瘦肉精已經(jīng)是普遍的現(xiàn)象，目前新型瘦肉精的不斷出現(xiàn)給監(jiān)管部門執(zhí)法監(jiān)管帶來很大障礙，尤其是缺乏現(xiàn)場快速檢測技術(shù)。膠體金免疫層析技術(shù)近年來發(fā)展迅速，因其操作簡便快捷，特異性強，靈敏度高且便于現(xiàn)場操作，已廣泛應用于食品安全檢測領(lǐng)域。本研究制備的新型瘦肉精西馬特羅膠體金檢測卡的靈敏度為0.1ng/mL，且特異性好，與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等常見的瘦肉精均無交叉反應。而且使用方便、快速、準確，成本低，可用于西馬特羅的快速檢測，適合基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖企業(yè)、屠宰企業(yè)、市場監(jiān)管部門使用。